無前導(dǎo)肽細(xì)菌素的研究進展及在食品保藏中的應(yīng)用

張曉峰，王丹，戶萌菲，孫西玉，潘春梅

（河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，河南鄭州450046）

細(xì)菌素是細(xì)菌在代謝過程中由核糖體合成的、對產(chǎn)生菌具有自身免疫性的一類具有抗菌活性的多肽類物質(zhì)[1]。細(xì)菌素在生物合成、作用模式、抗性機制及抗菌活性方面與抗生素存在明顯不同，被認(rèn)為是抗生素的最佳替代品之一[2]。據(jù)統(tǒng)計，一半以上的細(xì)菌可產(chǎn)生不同種類的細(xì)菌素[3]。隨著大量微生物基因組的公布和細(xì)菌素在線比對工具的應(yīng)用，越來越多的細(xì)菌素被發(fā)現(xiàn)和鑒定。Xin B Y 等通過在線比對工具BAGEL3對GenBank 中的223 株蘇云金芽胞桿菌基因組的細(xì)菌素基因簇進行預(yù)測，從77 個菌株的基因組中預(yù)測到了101 個羊毛硫細(xì)菌素的基因簇，通過對部分預(yù)測結(jié)果進行驗證，最后獲得了含有4 條肽鏈的新型羊毛硫細(xì)菌素thuricin4A[4]。目前研究的最多、最深入的是來源于乳酸菌的羊毛硫細(xì)菌素[5]。雖然1951 年就提出細(xì)菌素可作為防腐劑在食品中使用，然而，迄今為止僅有廣譜活性細(xì)菌素nisin 和pediocinPA-1 被授權(quán)做為食品保藏劑使用[6]。所以，開發(fā)新型的、具有廣譜活性的細(xì)菌素具有廣泛的應(yīng)用前景[7]。不同于大多數(shù)細(xì)菌素，無前導(dǎo)肽細(xì)菌素是細(xì)菌素家族中一類由核糖體合成的、不進行任何翻譯后修飾的、N 端沒有前導(dǎo)肽序列的細(xì)菌素[8]。該類細(xì)菌素遺傳結(jié)構(gòu)簡單，抗菌機制獨特，產(chǎn)生菌多來源于食品且易于在其它微生物中表達，適合通過生物工程進行規(guī)?；a(chǎn)，具有巨大的商業(yè)應(yīng)用潛能。目前已有近20 種無前導(dǎo)肽細(xì)菌素被鑒定和報道，本文對該類細(xì)菌素的類型、理化特性、生物合成、作用機制及在食品保藏中的應(yīng)用進行了綜述，使人們深入理解無前導(dǎo)肽細(xì)菌素的特性和優(yōu)勢，為其進一步應(yīng)用提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 無前導(dǎo)肽細(xì)菌素的類型

細(xì)菌素的分類有不同的方法，目前廣泛接受的是由Cotter 等在2013 年修訂后的分類方案，按照該分類方案，細(xì)菌素主要分為I 類細(xì)菌素（也稱為翻譯后可修飾細(xì)菌素）和II 類細(xì)菌素（也稱為翻譯后非修飾細(xì)菌素）兩類。其中I 類細(xì)菌素主要包含羊毛硫細(xì)菌素等可修飾細(xì)菌素。II 類細(xì)菌素又分為5 小類，IIa 類為pediocinPA-1 類細(xì)菌素，如pediocinPA-1；IIb 類為由兩條肽鏈組成的具有協(xié)同作用的二肽細(xì)菌素，如lactacinF；IIc 類為環(huán)肽類細(xì)菌素，如enterocinAS-48；IId 類為非修飾的、線狀的、不屬于pediocinPA-1 的細(xì)菌素，如microcinS、無前導(dǎo)肽細(xì)菌素等；IIe 類為具有鐵載體修飾的羧基末端富含絲氨酸的細(xì)菌素，如microcin E492。另外，2016 年，Alvarez 等[9]在前人基礎(chǔ)上對來源于乳酸菌的細(xì)菌素進行了分類，該分類方案同樣將細(xì)菌素主要分為修飾細(xì)菌素和非修飾細(xì)菌素兩大類（I類和II 類），其中環(huán)肽類細(xì)菌素被作為I 類細(xì)菌素，無前導(dǎo)肽細(xì)菌素被作為II 類細(xì)菌素中的一小類。無論哪種分類方案，無前導(dǎo)肽細(xì)菌素都屬于比較特殊的一類。

首次報道的無前導(dǎo)肽細(xì)菌素是1998 年由菌株E.faecium L50 產(chǎn)生的細(xì)菌素enterocinL50 （entL50），該細(xì)菌素含有兩條肽鏈，分別為enterocinL50-A（entL50-A）、enterocinL50-B（entL50-B）[10]。除此之外，到目前為止已經(jīng)對來自不同種屬細(xì)菌的多個無前導(dǎo)肽細(xì)菌素進行了報道，分別有來自屎腸球菌的enterocinQ（entQ）、enterocinK1（entK1）；來自糞腸球菌的enterocinEJ97（entEJ97）、enterocin7（ent7，與報道的enterocinMR10相同），ent7 含有兩條肽鏈，分別為enterocin7-A（ent7-A）、enterocin7-B（ent7-B）；來自金黃色葡萄球菌的aureocinA53（aurA53）、aureocinA70（aurA70），aurA70 含有4 條肽鏈，分別為aureocinA70-A（aurA70-A）、aureocinA70-B（aurA70-B）、aureocinA70-C（aurA70-C）、aureocinA70-D（aurA70-D）；來自表皮葡萄球菌的epidermicinNI01（epiNI01）；來自乳酸乳球菌的lacticinQ （lnqQ）、lacticinZ（lnqZ）、lsbB、lactolisterinBU（LliBU）；來自鼠鏈球菌的BHT-B，來自希臘魏氏桿菌的weisselicinY（welY）、weisselicinM（welM）；來自格氏乳球菌的garvicinKS（garKS），garKS 含有3 條肽鏈，分別為garvicinKS-A（garKS-A）、garvicinKS-B（garKSB）、garvicinKS-C（garKS-C）；來自蠟樣芽胞桿菌的cereucinX（cerX）、cereucinH（cerH）、cereucinV（cerV），它們是經(jīng)生物信息學(xué)預(yù)測后化學(xué)合成的無前導(dǎo)肽細(xì)菌素，其中cerX 含有3 條肽鏈，分別為cereucinX-A（cerX-A）、cereucinX-B（cerX-B）、cereucinX-C（cerXC），cerH 含有4 條肽鏈，分別為cereucinH-A（cerHA）、cereucinH-B（cerH-B）、cereucinH-C（cerH-C）、cereucinH-D（cerH-D），cerV 含有3 條肽鏈，分別為cereucinV-A （cerV-A）、cereucinV-B （cerV-B）、cereucinV-C（cerV-C）[11-12]。根據(jù)組成無前導(dǎo)肽細(xì)菌素的氨基酸序列，采用在線軟件clustal omega 對其氨基酸序列一致性進行比對，結(jié)果如圖1 所示。

由圖1 可見，根據(jù)組成細(xì)菌素的氨基酸序列一致性，無前導(dǎo)肽細(xì)菌素可以明顯分為a、b、c、d 4 類，其中a 類無前導(dǎo)肽細(xì)菌素肽鏈的N 端和C 端氨基酸序列都較保守，N 端保守序列為MXXXAKXXXK（X 為任意氨基 酸），C 端 保 守 序 列 為GWXXXKKXYXXXMQ－FIGXGW，包括welY、ent7 和entL50；b 類富含甘氨酸和丙氨酸，包括aur70、garKS、cerX、cerH、cerV；c 類N端較保守而C 端相對不保守，其中N 端保守序列為AXXGXKXV，包括lliBU、BHT-B、aur53、epiNI01、lnqQ及l(fā)nqZ；d 類C 端較保守而N 端相對不保守，其中C端保守序列為KXXXGXXPWE，包括entQ、lsbB、entEJ97 和entK1。

圖1 無前導(dǎo)肽細(xì)菌素氨基酸序列比對結(jié)果Fig.1 Amino acid sequence alignment results of leaderless bacteriocins

2 無前導(dǎo)肽細(xì)菌素的生物合成

通常，細(xì)菌素的合成分為3 個過程，首先合成無活性的、N 端含有前導(dǎo)肽序列的前體肽，前體肽在修飾酶的作用下進行翻譯后修飾，最后除去前體肽中的前導(dǎo)肽序列從而變?yōu)橛谢钚缘某墒祀腫13]。前導(dǎo)肽是細(xì)菌素生物合成酶的識別位點，是酶-底物相互作用所必需的，并對細(xì)菌素產(chǎn)生菌有保護作用[14]。大部分細(xì)菌素前導(dǎo)肽的切割和分泌需要其專門的前導(dǎo)肽序列，前導(dǎo)肽在細(xì)菌素的生物合成中起重要作用[15]。長期以來人們認(rèn)為前導(dǎo)肽是細(xì)菌素生物合成所必需的，然而，無前導(dǎo)肽細(xì)菌素的生物合成過程卻不形成前導(dǎo)肽序列，在翻譯后不經(jīng)任何修飾即轉(zhuǎn)變有活性的成熟肽。如aurA53 的生物合成除結(jié)構(gòu)基因外幾乎不需要其它遺傳信息，類似簡單的遺傳組織在entL50 中也有發(fā)現(xiàn)[16]。另外，除welM、welY 的結(jié)構(gòu)基因位于不同操縱子外，其余由同一菌株所產(chǎn)細(xì)菌素的各條肽鏈結(jié)構(gòu)基因均存在于同一操縱子內(nèi)，并且肽鏈之間存在協(xié)同效應(yīng)，包括ent7、entL50、aurA70、garKS、cerX、cerH、cerV。無前導(dǎo)肽細(xì)菌素這種簡單的遺傳組織使其很容易與其它微生物蛋白的N 端擴展融合，因此也更容易被其它細(xì)菌、真菌或真核細(xì)胞表達。如來源于乳酸乳球菌的lnqQ 和來源于金黃色葡萄球菌的aurA53 能夠在大腸桿菌E.coli BL21 中大量表達，另外lnqQ 也已在枯草芽胞桿菌中成功表達[17]。來源于E.faecium L50 的細(xì)菌素entL50-A 和entL50-B 也已經(jīng)在釀酒酵母和畢赤酵母中成功表達[18-19]。

3 無前導(dǎo)肽細(xì)菌素的理化特征

無前導(dǎo)肽細(xì)菌素因其肽鏈N 端不含前導(dǎo)肽序列而得名，無前導(dǎo)肽細(xì)菌素通常含27 個～53 個氨基酸，肽鏈相對較短，相對分子質(zhì)量在2.7 kDa～6.1 kDa 之間，富含賴氨酸殘基而缺少半胱氨酸殘基。研究顯示，大多數(shù)無前導(dǎo)肽細(xì)菌素N 端的甲硫氨酸殘基進行了甲?；?，形成了N-甲酰甲硫氨酸，如aurA53、lnqQ、lsbB、garKS、aurA70、ent7、welY、welM 等，但其功能一直未知。在大腸桿菌菌株E.coli BL21 中異源表達的lnqQ、aurA53 都不含甲酰甲硫氨酸殘基，但其保持有完整的生物活性。lnqZ、lnqQ 中甲酰甲硫氨酸殘基的去除也不影響其抗菌活性。可見，N 端的甲酰甲硫氨酸殘基并不影響無前導(dǎo)肽細(xì)菌素的抗菌活性。另外，所有無前導(dǎo)肽細(xì)菌素都帶2 個～8 個不等的正電荷，有較高的等電點，通常大于9，由于其氨基酸序列的差異，細(xì)菌素的親水疏水作用各不相同。例如，ent7-A 和ent7-B 分別含有44、43 個氨基酸殘基，7 個正電荷，等電點分別為10.68、10.95，水溶液中具有高度的結(jié)構(gòu)性。lnqQ 含有53 個氨基酸殘基，其中有8 個賴氨酸和4個色氨酸殘基，帶有8 個正電荷，等電點為10.7。aurA53 含有51 個氨基酸殘基，其中10 個賴氨酸和5 個色氨酸殘基，帶有8 個正電荷，等電點為10.8，對蛋白酶不敏感，在水溶液中呈剛性結(jié)構(gòu)[20]。lsbB 含30 個氨基酸殘基，帶有6 個正電荷，等電點為10.75[21]。

另外，除lsbB 僅對乳酸乳球菌有活性外，多數(shù)無前導(dǎo)肽細(xì)菌素有廣譜抑菌活性，特別是對食品腐敗菌李斯特菌屬的微生物。值得注意的是garKS 對革蘭氏陰性菌Acinetobacter baumannii B1162 等有抑菌活性，而ent7-A、ent7-B 對革蘭氏陰性菌Brevundimonas diminuta 有抑菌活性。部分無前導(dǎo)肽細(xì)菌素抑菌譜見表1。

表1 部分無前導(dǎo)肽細(xì)菌素的抑菌譜Table 1 Antibacterial spectrum of part leaderless bacteriocins

4 無前導(dǎo)肽細(xì)菌素的抗菌機制

理解細(xì)菌素抗菌機制是其能夠進行廣泛應(yīng)用的基礎(chǔ)和關(guān)鍵，而三維結(jié)構(gòu)的解析對理解細(xì)菌素的抗菌機制有重要作用。第一個三維結(jié)構(gòu)被解析的無前導(dǎo)肽細(xì)菌素是ent7-A、ent7-B，除此之外，到目前為止，aurA53、lnqQ、lsbB 的三維結(jié)構(gòu)也已獲得解析，因此，它們的抑菌機制可認(rèn)為是無前導(dǎo)肽細(xì)菌素抗菌機制的代表。

核磁共振的結(jié)構(gòu)解析顯示，ent7-A、ent7-B、aurA53 及l(fā)nqQ 具有相似的三維結(jié)構(gòu)，它們的N 末端和C 末端均由兩親性的α-螺旋構(gòu)成，其三維結(jié)構(gòu)高度折疊，表面含有較高的陽離子，疏水殘基位于核心而親水殘基暴露于溶劑，形成親水的表面區(qū)域，但也有某些疏水氨基酸暴露溶劑使其表面形成一定的疏水區(qū)域。如aurA53 中所有的賴氨酸殘基位于表面，5 個色氨酸中有4 個暴露于表面，形成一定的疏水區(qū)域。但lsbB 的三維結(jié)構(gòu)顯示其N 末端為α-螺旋，C 末端無結(jié)構(gòu)，在水溶液中呈非結(jié)構(gòu)狀態(tài)[22]。

通常細(xì)菌素通過與靶標(biāo)細(xì)胞膜上的特定受體結(jié)合形成“孔道”結(jié)構(gòu)破壞細(xì)胞膜或抑制細(xì)胞壁的形成，發(fā)揮抑菌作用，如羊毛硫細(xì)菌素nisin 是通過與靶標(biāo)細(xì)胞膜上的細(xì)胞壁合成前體脂質(zhì)II 綁定形成“孔道”并抑制細(xì)胞壁的合成從而抑制細(xì)菌生長[23]。細(xì)菌素pediocinPA-1 通過與靶標(biāo)細(xì)胞膜上的甘露糖磷酸轉(zhuǎn)移酶綁定形成“孔道”而獲得抗菌活性[24]。與大多數(shù)細(xì)菌素的作用機制不同，無前導(dǎo)肽細(xì)菌素ent7-A、ent7-B、aurA53 及l(fā)nqQ 發(fā)揮抑菌作用卻不需要任何受體參與。lnqQ 首先通過靜電吸引與帶負(fù)電的靶標(biāo)細(xì)胞膜結(jié)合，然后通過滲透在靶標(biāo)細(xì)胞膜上形成“環(huán)形孔”使細(xì)胞內(nèi)容物泄露而殺死細(xì)菌[25]，也有報道稱細(xì)菌素lnqQ并不形成“環(huán)形孔”，而是通過羥自由基的積累來殺死靶標(biāo)細(xì)菌的[26]。aurA53 既不需要任何特殊受體，也不形成“孔道”結(jié)構(gòu)，而是滲透到靶標(biāo)細(xì)胞膜后使重要分子泄露、膜電位消失、大分子合成終止而發(fā)揮抗菌作用。有研究顯示，aurA53 與中性細(xì)胞膜的相互作用強于陰性細(xì)胞膜，推測其疏水作用在與靶標(biāo)細(xì)胞膜的相互作用過程中發(fā)揮重要作用。同樣，ent7-A、ent7-B 也是通過靜電吸引和疏水作用與靶標(biāo)細(xì)胞膜結(jié)合，隨后α-螺旋解旋，疏水核暴露并插入膜靶標(biāo)細(xì)胞膜中[27]。然而，研究顯示，lsbB 卻需要受體介導(dǎo)來發(fā)揮抑菌作用，其C末端最外的8 個氨基酸序列為受體結(jié)合部分，lsbB 需要與靶標(biāo)細(xì)胞膜上的受體鋅依賴的金屬肽酶結(jié)合，從而導(dǎo)致靶標(biāo)細(xì)胞膜破壞而發(fā)揮抗菌作用，但帶正電荷的lsbB 與帶負(fù)電荷的靶標(biāo)細(xì)胞膜之間的靜電作用對其與受體的結(jié)合有重要影響。由此可見，靜電吸引在無前導(dǎo)肽細(xì)菌素的抗菌機制中發(fā)揮重要作用，所有無前導(dǎo)肽細(xì)菌素均帶有正電荷，這使其更易與帶負(fù)電荷的靶標(biāo)細(xì)胞相互作用而減少對特定受體的依賴，可能也是其擁有廣譜抗菌活性的原因之一，這種機制與多細(xì)胞生物的小陽離子抗菌肽（20 個～40 個殘基）的膜滲透作用類似[28]。另外，疏水作用在無前導(dǎo)肽細(xì)菌素的抗菌機制中也發(fā)揮重要作用，如ent7-A、ent7-B、aurA53 及l(fā)nqQ 雖然具有極其相似的三維結(jié)構(gòu)，但由于氨基酸序列的差異仍使其具有不同的抗菌活性，這可能與其不同的疏水作用相關(guān)。

5 無前導(dǎo)肽細(xì)菌素在食品中的應(yīng)用

單核細(xì)胞增生性李斯特菌（單增李斯特菌）、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、芽胞桿菌等都是導(dǎo)致食品污染或腐敗的常見微生物。如單增李斯特菌是一種食源性病原菌，其廣泛存在于水、土壤、植物中。該菌可污染牛奶、肉制品、蔬菜等食品，在加工運輸和冷藏條件下均可生長。單增李斯特菌是人畜共患菌，可引起人和動物腦膜炎、敗血癥、胃腸炎等疾病，威脅人類生命與健康[29-31]。許多無前導(dǎo)肽細(xì)菌素是由食品中分離的微生物產(chǎn)生的，如細(xì)菌素aurA53、aurA70、garKS、lsbB是由分離自商品牛奶或奶酪中的微生物產(chǎn)生的，ent7是從碎牛肉中分離到的微生物產(chǎn)生的，welY、welM 是由分離自日本泡菜桶中的微生物產(chǎn)生的，它們很多是食品級乳酸菌產(chǎn)生的，如garKS、lsbB、ent7、welY、welM等，這種特性使其在食品中的應(yīng)用具有先天的安全性。多數(shù)無前導(dǎo)肽細(xì)菌素對革蘭氏陽性細(xì)菌有廣泛的抑菌活性，尤其是單增李斯特菌。雖然多數(shù)無前導(dǎo)肽細(xì)菌素對革蘭氏陰性細(xì)菌無活性，但與其它抑菌物質(zhì)的聯(lián)合使用對很多食源性病原菌有協(xié)同抑菌作用。如garK 是由分離自原料牛乳中的乳酸菌Lc. garvieae KS1546 產(chǎn)生的含有3 條肽鏈的無前導(dǎo)肽細(xì)菌素，其與polymyxinB 聯(lián)合使用對不動桿菌和大腸桿菌有協(xié)同抑菌活性，與polymyxinB、nisin 聯(lián)合使用能夠快速殺滅并完全根除不動桿菌和大腸桿菌，與nisin 聯(lián)合使用對金黃色葡萄球菌有協(xié)同作用，與nisin、金合歡醇聯(lián)合使用在低濃度下能快速根除金黃色葡萄球菌[32]。

另外，無前導(dǎo)肽細(xì)菌素沒有毒性，易降解而不易殘留，耐熱、耐酸堿，對某些抗生素抗性菌株有活性。如aurA53 對真核細(xì)胞無毒，沒有溶血活性，在4 ℃可至少存放48 周，在-20 ℃可保持72 周活性不變，對模擬胃液和膽鹽敏感，在模擬胃液3 h 活性喪失87.5%，對膽鹽90 min 喪失68.5%。aurA53 對接種單增李斯特菌的脫脂牛奶抑菌試驗表明，4 ℃條件下存放7 d 后，與對照相比，aurA53 可使牛奶中的活菌總數(shù)減少107.7 CFU/mL，aurA53 可作為保鮮劑應(yīng)用于牛乳產(chǎn)品[33-34]。ent7 除對單增李斯特菌、梭菌屬的細(xì)菌有活性外，還對耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌及耐萬古霉素的腸球菌有活性[35]。除此之外，無前導(dǎo)肽細(xì)菌素由于其簡單的遺傳組織使其更易于在其它微生物細(xì)胞中表達、更易于通過生物工程手段進行規(guī)模化生產(chǎn)、更易于進行分子改造而生產(chǎn)出新型的、更具優(yōu)勢功能的細(xì)菌素。如通過在原生產(chǎn)菌株中增加garKS 基因簇的拷貝數(shù)，優(yōu)化培養(yǎng)基成分，優(yōu)化培養(yǎng)條件使其表達量增加2 000 倍[36]。

6 結(jié)論

無前導(dǎo)肽細(xì)菌素是由核糖體合成的、N 端不含前導(dǎo)肽序列的一種細(xì)菌素，該類細(xì)菌素通常含27 個～53 個氨基酸，富含賴氨酸殘基而缺少半胱氨酸殘基，均帶有正電荷，有較高的等電點。根據(jù)氨基酸序列的一致性，該類細(xì)菌素可分為4 類。無前導(dǎo)肽細(xì)菌素具有相似的三維結(jié)構(gòu)，作用于靶標(biāo)細(xì)胞時受特定受體依賴較小，靜電作用和疏水作用在抑菌機制中發(fā)揮重要作用，多數(shù)具有廣譜抑菌活性，特別是對食品腐敗菌李斯特菌屬的微生物。無前導(dǎo)肽細(xì)菌素不需要前導(dǎo)肽序列就能生物合成，翻譯后不經(jīng)任何修飾或簡單的甲基化即可成為有活性的成熟肽，這種簡單的遺傳結(jié)構(gòu)更易被其它細(xì)菌、真菌或真核細(xì)胞表達，有利于通過生物工程進行大規(guī)模生產(chǎn)，具有巨大的商業(yè)應(yīng)用潛能，無前導(dǎo)肽細(xì)菌素未來會在食品工業(yè)及其它領(lǐng)域有更廣泛的應(yīng)用。