食管癌腫瘤出芽的研究進(jìn)展

鄭羽佳 陳東來 王文佳 王偉 桑永華 張永勝 陳勇兵

食管癌一直都是威脅人類健康的主要惡性腫瘤，發(fā)病率和病死率分別為全部惡性腫瘤的第六和第五位[1]。食管癌主要分為食管鱗癌和食管腺癌2種組織學(xué)類型，我國以食管鱗癌為主。流行病學(xué)研究[2]顯示，吸煙和飲酒是食管癌的重要危險(xiǎn)因素。目前食管癌的治療方法根據(jù)分期早晚而決定，早期主要應(yīng)用腔鏡下黏膜切除或者黏膜剝離術(shù)，術(shù)后給予必要的放化療，對于中晚期患者主要采取以手術(shù)為主的綜合治療，通常對切除有困難的患者給予術(shù)前放化療，術(shù)后必要時(shí)再給予放化療。避免早期食管癌進(jìn)展以及對中晚期食管癌采取有效的措施可使更多的患者受益[3-6]。因此，如何有效進(jìn)行食管癌病變分期成為目前需要關(guān)注的問題。目前組織形態(tài)學(xué)分析仍是對惡行腫瘤分期的重要手段。腫瘤出芽（tumor budding，TB）作為一種存在于多種惡性腫瘤中的病理現(xiàn)象，已展示出其潛在的預(yù)后預(yù)測價(jià)值。因此，研究TB的發(fā)生、分級及其對食管癌的預(yù)后影響具有重要的臨床病理意義。

一、TB及其病理過程

TB是可在多種癌癥中見到的一種病理學(xué)現(xiàn)象，對于TB的定義目前仍有爭議，被廣泛接受的定義是：TB指顯微鏡下所見的腫瘤浸潤前沿間質(zhì)內(nèi)散在的呈未分化形態(tài)的腫瘤細(xì)胞群，這種細(xì)胞群往往呈單個(gè)腫瘤細(xì)胞或小于5個(gè)細(xì)胞的小灶狀（圖1）。TB并非一個(gè)靜態(tài)的過程，而被視作腫瘤轉(zhuǎn)移的動態(tài)過程[3]。腫瘤轉(zhuǎn)移最重要的過程是上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）。EMT的異常激活被認(rèn)為是腫瘤轉(zhuǎn)移的標(biāo)志，其上皮細(xì)胞失去細(xì)胞間黏附，并獲得間質(zhì)細(xì)胞典型的遷移和侵襲性特征。多種腫瘤研究表明，TB中有上皮標(biāo)志物（如E-鈣黏蛋白）的下調(diào)和間質(zhì)標(biāo)志物（如波形蛋白）的上調(diào)，因此，提出了一種觀念，即TB是EMT的形態(tài)表達(dá)[7]。Niwa等[8]檢查了78例食管鱗癌患者手術(shù)標(biāo)本的EMT狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)TB高級別組和間質(zhì)表型相關(guān)，低級別組和上皮表型相關(guān)，表明在食管癌中，腫瘤EMT狀態(tài)與TB明顯相關(guān)（P＝0.009）。然而，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，TB中的EMT過程并不完整，只經(jīng)歷了部分EMT，表現(xiàn)為雜種單細(xì)胞E/M表型。

二、TB的分子機(jī)制

TB被認(rèn)為是EMT的形態(tài)表達(dá)，而EMT的發(fā)生受多種生長因子調(diào)控，如轉(zhuǎn)化生長因子﹑肝細(xì)胞生長因子﹑表皮生長因子等，這些生長因子可與酪氨酸激酶受體結(jié)合，經(jīng)過不同的信號通路，影響細(xì)胞黏附分子的功能，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲[9-10]。Jensen等[11]的研究證實(shí)了TB和EMT分子表達(dá)的一致性，表明TB中富集激活的TGF-β信號及與EMT-TF(ZEB1，PRRX1)的表達(dá)增加和METTF(OVOL1，KLF和GRHLs）的表達(dá)減少有關(guān)。在一項(xiàng)對T1期食管鱗癌的研究中，發(fā)現(xiàn)E-鈣黏蛋白和TB密切相關(guān)（P＝0.04）[12]。此外，Jass等[13]研究發(fā)現(xiàn)，TB顯示出β-連環(huán)蛋白和p16的表達(dá)增加，p16表達(dá)和WNT途徑的破環(huán)是TB的先決條件。說明TB不僅僅是由于腫瘤邊緣的宿主免疫反應(yīng)引起的結(jié)構(gòu)破壞的結(jié)果，更是基因控制下的動態(tài)過程。另有研究顯示，TB與趨化因子配體相關(guān)，TB經(jīng)過CXCL12染色后，更容易辨認(rèn)，且CXCL12可以調(diào)控腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移[14]?，F(xiàn)關(guān)于TB的分子生物學(xué)研究多基于大腸癌，與食管癌相關(guān)的研究較少，這值得研究者的關(guān)注。

三、TB的計(jì)數(shù)與分級方法

TB的細(xì)胞和細(xì)胞核異型性較大，細(xì)胞質(zhì)嗜酸性，因此在HE染色下即可觀察到。國際腫瘤出芽共識會議（International Tumor Budding Consensus Conference，ITBCC）指出，TB的評估主要基于HE染色，而非細(xì)胞角蛋白免疫組織化學(xué)染色（immunohistochemistry，IHC）[15]。一項(xiàng)薈萃分析表明，通過HE計(jì)數(shù)TB和IHC間沒有實(shí)質(zhì)性的差異，會議目前建議仍用HE染色計(jì)數(shù)TB[15-16]。但是一些研究發(fā)現(xiàn)，IHC在可重復(fù)性和觀察者之間的一致性方面優(yōu)于HE[17-18]，此外TB可能被腫瘤周圍的炎癥反應(yīng)掩蓋，無法用HE染色鑒別，而此時(shí)IHC可以更好地顯示腫瘤內(nèi)出芽。盡管之前大多數(shù)TB計(jì)數(shù)都基于HE染色，但近年來，為了減少TB計(jì)數(shù)的錯(cuò)誤，很多研究都應(yīng)用了IHC的方法。

最開始的研究并沒有明確地對TB進(jìn)行分級，后來Ueno等[19]提出了兩種對TB分級的方法，選擇TB最密集的區(qū)域，一種根據(jù)TB的數(shù)量（＜5，5～9，10～19和≥20，×25視野，即0.385 mm2區(qū)域）分為4組，另一種根據(jù)TB的數(shù)量（＜10 和≥10，×25視野，即0.385 mm2區(qū)域）分為2組。在此基礎(chǔ)上，ITBCC確定了TB的標(biāo)準(zhǔn)判定方法，即低級別為0～4個(gè)出芽，中級別為5～9個(gè)出芽，高級別為10個(gè)及以上出芽[9]。然而，大多數(shù)的食管癌研究都采用了改良的Ueno方法，選擇TB最密集的區(qū)域（×20視野）計(jì)數(shù)，＜5的出芽數(shù)為低級別，≥5的出芽數(shù)為高級別[6]。

四、TB與食管癌治療決策

目前食管癌患者的治療決策主要由臨床TNM分期和患者的臨床癥狀決定，而分期是基于影像學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行的，這與病理分期相比，具有過度或分期不足的風(fēng)險(xiǎn)。目前，很少有研究去探討TB對于食管癌術(shù)前活檢標(biāo)本的重要性及其對治療決策的影響。Jesinghaus等[20]基于TB和細(xì)胞巢大小建立了一個(gè)改進(jìn)的分級系統(tǒng)，稱為“細(xì)胞分離度”（Cellular Dissociation Grading，CDG）。還對術(shù)前活檢標(biāo)本的CDG及腫物切除術(shù)后的臨床分期進(jìn)行了隊(duì)列研究，發(fā)現(xiàn)較差的CDG與更高的臨床T分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（P＜0.001）。該研究顯示，一個(gè)獨(dú)立于臨床分期的可以預(yù)測食管癌浸潤深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的有效參數(shù)，可以用于治療前活檢及腫物切除，為臨床治療前決策（如初次切除術(shù)及新輔助放化療）提供新的有力的參考。另外，有研究[21]表明TB可作為預(yù)測淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的獨(dú)立預(yù)后因素，這在淺表食管癌中十分重要。這種風(fēng)險(xiǎn)評估可作為治療決策的主要決定因素，治療范圍可從對低風(fēng)險(xiǎn)腫瘤進(jìn)行內(nèi)窺鏡下切除術(shù)到對高風(fēng)險(xiǎn)轉(zhuǎn)移者進(jìn)行新輔助放化療后再行食管切除術(shù)。同時(shí)，Jesinghaus等[22]還基于CDG，對接受新輔助化療后的術(shù)后標(biāo)本進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)CDG仍是獨(dú)立預(yù)后因素，提示CDG能進(jìn)一步對接受了新輔助化療的患者進(jìn)行預(yù)后分層，即使患者對新輔助治療表現(xiàn)出良好的初始反應(yīng)。缺乏預(yù)測因素導(dǎo)致無法在進(jìn)行或未進(jìn)行新輔助治療的患者中選擇最佳的輔助治療，而CDG正是能夠與病理、臨床分期相結(jié)合的具有潛力作為新輔助化療后的預(yù)測指標(biāo)，幫助決策最佳治療方案。

圖1 食管癌的腫瘤出芽現(xiàn)象（HE，×40）

五、TB與食管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移

此前，研究[3]表明，TB和大腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，是淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的新的危險(xiǎn)因素。以此推論，TB和食管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移也可能具有相關(guān)性。Landau等[21]分析了210位pT1期的食管腺癌患者，高級別TB患者有41%出現(xiàn)了淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，而低級別TB患者只有15%出現(xiàn)，沒有TB的患者只有10%出現(xiàn)了淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。該研究表明廣泛的TB是淺表食管腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，淺表食管腺癌應(yīng)將TB作為預(yù)后評估的一部分。最近，F(xiàn)uchinoue等[23]研究了50例淺表食管鱗癌的患者，使用HE染色和IHC兩組計(jì)數(shù)TB的方法，均證明了TB和淺表食管鱗癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（P＜0.001），并指出TB可能是淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的原因。

六、TB與食管癌預(yù)后

很多研究都表明了TB和食管癌的不良預(yù)后有關(guān)，表1總結(jié)了近20年來TB和食管癌預(yù)后關(guān)系的相關(guān)研究。Roh等[24]最早研究了56例食管鱗癌患者，其中低級別TB患者22例（36.9%），高級別TB患者34例（60.7%），隨訪發(fā)現(xiàn)低級別組的3年生存率明顯高于高級別組。該研究表明TB可能是高度惡性潛能的病理表現(xiàn)，會降低食管鱗癌患者的生存率。之后，Koike等[25]研究了136例食管鱗癌，也表明了低級別組的3年和5年生存率明顯高于高級別組。因此，TB可被視為腫瘤轉(zhuǎn)移的第一步，能反應(yīng)病灶內(nèi)腫瘤的侵襲性，并可輔助推斷患者是否可以受益于當(dāng)前的治療。一項(xiàng)關(guān)于接受新輔助化療后的食管鱗癌患者預(yù)后的研究發(fā)現(xiàn)即使在接受了新輔助化療后，存在高級別TB的患者5年生存率仍然較低，是食管鱗癌的不良預(yù)后因素。在接受新輔助化療之后再次進(jìn)行TB的評估，可以給后續(xù)是否需要行其他輔助治療提供一個(gè)有效的信息。Nakanishi等[28]研究發(fā)現(xiàn)，高級別TB與較大的腫瘤直徑﹑淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移﹑血管浸潤等不良預(yù)后因素有關(guān)，且無病生存期明顯短于低級別TB組。因此，可以將TB作為判斷預(yù)后的因素之一，但是也要注意低級別TB與晚期復(fù)發(fā)相關(guān)，尤其是pT2和pT3的患者中。

表1 近年來TB和食管癌預(yù)后的關(guān)系

有一項(xiàng)研究選取了79例pT1期的食管鱗癌患者，50例為低級別TB，29例為高級別TB，低級別組的3年總體生存率明顯高于高級別組（94.5% vs. 48.8%，P＜0.001）[29]。通過多因素分析表明TB是食管鱗癌的獨(dú)立預(yù)后因素，還提出可以將TB作為食管癌切除手術(shù)和內(nèi)鏡黏膜切除術(shù)（endoscopic mucosal resection，EMR）標(biāo)本的常規(guī)病理檢查。

大多數(shù)研究均探討TB在食管鱗癌中的意義，值得一提的是，Thies等[30]研究食管腺癌的TB，并將TB分為腫瘤內(nèi)出芽和腫瘤周圍出芽。該研究表明較高的腫瘤內(nèi)出芽與較差的總體生存率相關(guān) （P＝0.029），且在pT1亞組分析中，腫瘤內(nèi)出芽也與較差預(yù)后相關(guān)（P＝0.038），而腫瘤周圍出芽對患者預(yù)后沒有顯著影響（P＝0.385）。因此，TB可用于早期食管癌活檢標(biāo)本的病理學(xué)診斷中，為預(yù)測腫瘤預(yù)后提供了新的參考。

七、結(jié)語

TB可以預(yù)測食管癌患者的預(yù)后，且與食管癌治療前分期﹑淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移﹑血管浸潤等密切相關(guān)，高級別TB提示較差的預(yù)后[32]。可考慮將TB納入常規(guī)病理檢測以及TNM分期中，但仍有大量問題有待研究。首先，TB的分子病理學(xué)特征仍未明確，與部分EMT過程尤其是雜種單細(xì)胞E/M表型的相關(guān)性有待進(jìn)一步考證；在高通量測序技術(shù)飛速發(fā)展的今天，學(xué)界對TB陽性病灶內(nèi)腫瘤的突變頻譜等信息仍所知甚少。其次，TB的分級大多基于Ueno的方法進(jìn)行改良，缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，且關(guān)于應(yīng)用HE染色還是IHC未有定論，有待研究進(jìn)一步統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)[6]。此外，切除術(shù)式和切緣距離是否會影響存在TB的接受外科手術(shù)的食管癌患者預(yù)后仍亟待研究。最后，有關(guān)TB在接受新輔助化療及術(shù)后放化療患者中預(yù)后意義的研究尚顯匱乏，需更多的臨床研究深化認(rèn)識。希望隨著越來越多的學(xué)者對TB現(xiàn)象的重視和研究，TB的評估可以早日被應(yīng)用，這對食管癌及其他腫瘤的治療及預(yù)后判斷都有重要的意義。