麥門冬湯對間質(zhì)性肺炎小鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞自噬及肺水清除的作用機制研究

趙躍恒 常姍 史瑞玲 張華

1.河南省榮軍醫(yī)院 河南，新鄉(xiāng) 453002 2.鄭州大學附屬鄭州中心醫(yī)院

特發(fā)性肺纖維化 （idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一種慢性進行性間質(zhì)性肺部疾病，肺部損害不可逆轉(zhuǎn)，患者預后較差，確診后患者的預計生存期為3～5年，男性發(fā)病率高于女性[1]。該病以慢性進行性肺間質(zhì)損害和肺纖維化為主要特征，患者表現(xiàn)為慢性咳嗽和漸進性呼吸困難，組織病理學檢查可見肺間質(zhì)細胞增生和細胞外基質(zhì)過度沉積，藥物造成的肺損傷還可出現(xiàn)肺水腫、呼吸性堿中毒等情況[2]。IPF的病因復雜，與環(huán)境、遺傳和衰老等多種因素有關，現(xiàn)有治療藥物較少，且不良反應較多，尚不能顯著提高患者存活率，因此尋找有效的治療藥物是當前亟待解決的問題[3]。

麥門冬湯源于《金匱要略》，臨床用于治療虛熱肺痿、胃陰不足之證，研究表明，麥門冬湯對肺纖維化、肺癌等嚴重的肺部疾病均有較好的治療作用，但其治療肺纖維化的作用機制尚不清楚[4]。自噬是一種基本的細胞生物學過程，可以降解病毒和細菌等微生物、受損細胞器和無法被蛋白酶降解的蛋白質(zhì)等，是控制肺纖維化發(fā)展的一種保護機制[5-6]。自噬微管相關蛋白輕鏈3-Ⅱ（microtubule-associated protein light chain 3-Ⅱ，LC3-Ⅱ）是構(gòu)成自噬體膜的主要成分，泛素結(jié)合蛋白p62則可結(jié)合泛素化蛋白和LC3，是一種選擇性自噬接頭蛋白，LC3和p62被證明是檢測細胞自噬的重要標志物[7]。研究證明，IPF患者的肺上皮細胞和肺成纖維細胞自噬受到抑制，LC3-Ⅱ的表達顯著降低，而哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（target of rapamycin，mTOR）的活性則顯著增加，抑制磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B （protein kinase B，AKT）/mTOR通路的異常表達可能是減輕肺纖維化的有效策略[8]。自噬活動與肺纖維化發(fā)病密切相關，而目前關于麥門冬湯對肺纖維化細胞自噬的作用尚缺乏研究，故本研究以肺纖維化經(jīng)典胞內(nèi)代謝過程“自噬”為切入點，觀察麥門冬湯對間質(zhì)性肺炎小鼠肺纖維化和肺上皮細胞自噬的影響，并初步探究其作用機制，為IPF的藥物治療提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級C57BL/6小鼠120只，雌雄各半，6～8周齡，體質(zhì)量（20±2）g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司 [實驗動物生產(chǎn)許可證號碼：SCXK （京）2016-0006]，飼養(yǎng)于河南省實驗動物中心實驗室獨立動物房[實驗動物使用許可證號碼：SYXK（豫）2016-0002]，飼養(yǎng)條件符合《實驗動物管理條件》要求。飼養(yǎng)條件：室溫（22±2）℃，濕度（50±10）%，每天定時換氣，12h明暗交替，食水不限。研究方案獲河南省榮軍醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 藥品及試劑 麥門冬湯組方由麥門冬42g，半夏、甘草各6g，人參9g，粳米3g，大棗4枚組成，由鄭州中心醫(yī)院藥劑科提供并制備；硫酸博來霉素（bleomycin，BLM）購于Sigma-Aldrich公司（批號：15361-1MG）；醋酸潑尼松片購于浙江仙琚制藥股份有限公司（批號：170623）；蛋白定量試劑盒購于博士德生物公司（批號：AR0145）；胰蛋白酶、Ⅰ型膠原酶、杜氏改良Eagle培養(yǎng)基（Dulbecco's Modified Eagle Medium，DMEM）、胎牛血清、小鼠免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）、放射免疫沉淀法 （radio immunoprecipitation assay，RIPA）裂解液、苯甲基磺酰氟（phenylmethyl sulfonyl fluoride，PMSF）、電化學發(fā)光（electro chemi luminescence，ECL）、聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）轉(zhuǎn)印膜、蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色試劑盒、Masson三色染色試劑盒、Evans Blue、牛血清白蛋白、羥脯氨酸含量檢測試劑盒、中性樹膠均購于北京索萊寶科技有限公司（批號：T1300、C8140、12800017、1011-8611、SP031、R0010、P0100、PE0010、ISEQ00010、G1121、G1340、IE0280、A8020、BC0255、G8590）；α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、p62、LC3-Ⅱ、 磷酸化磷酯酰肌醇-3-激酶（phosphorylated-phosphatidylinositol-3-kinase，p-PI3K）、磷酸化蛋白激酶B（phosphorylated-protein kinase B，p-AKT）和磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（phosphorylated-mammalian target of rapamycin，p-mTOR）兔源單克隆抗體和羊抗兔二抗均購于美國CST公司（批號：19245、23214、3868、17366、4060、5536、7074）。

1.3 儀器 MET VX200-T型渦旋振蕩器購于上海施銳貿(mào)易有限公司；IX53顯微鏡為日本奧林巴斯公司產(chǎn)品；G：BOX多功能凝膠成像系統(tǒng)購于Syngene公司；Multiskan MK3酶標儀購于Thermo Fisher Scientific公司；TGL16MB型高速冷凍離心機為長沙湘智離心機儀器有限公司產(chǎn)品。

1.4 方法

1.4.1 分組與造模 將120只C57BL/6小鼠隨機分為6組：正常組、模型組、強的松組、麥門冬湯高劑量組、麥門冬湯中劑量組和麥門冬湯低劑量組，每組20只。除正常組小鼠經(jīng)鼻腔滴注等量0.9%氯化鈉溶液之外，其余各組小鼠均通過鼻腔滴注BLM建立間質(zhì)性肺炎模型。以0.5%戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉小鼠，捉持小鼠使其頭部后仰，暴露鼻腔，用移液器吸取BLM溶液50μL緩慢滴入小鼠鼻腔，BLM濃度為6μg·μL-1，造模劑量為1μL·g-1，不足的部分以0.9%氯化鈉溶液補充。藥液經(jīng)鼻腔進入小鼠氣管內(nèi)，將小鼠直立并旋轉(zhuǎn)使藥液均勻分布于肺組織，聽診器置于小鼠前胸，若聞及哮鳴音及濕羅音即提示造模成功[9]。造模完畢將小鼠放回籠內(nèi)。

1.4.2 藥物制備 取麥門冬湯組方，加入5倍量蒸餾水浸泡2h，煎煮3次，每次30min。用紗布過濾每次煎煮的藥液，將3次煎煮所得藥液濃縮至生藥量1g·mL-1，分裝后4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 給藥方法 各組小鼠造模第2天開始給藥。按照人與小鼠體表面積折算等效劑量，中劑量為8.58g·kg-1，高劑量為17.16g·kg-1，低劑量為4.29g·kg-1。 麥門冬湯高劑量組、中劑量組和低劑量組小鼠按照上述劑量灌胃給藥，強的松組采用0.46g·kg-1強的松灌胃，正常組和模型組小鼠灌胃0.9%氯化鈉溶液，給藥體積均為0.2mL/10g，1次/d，連續(xù)28d。

1.4.4 肺組織濕干重比（wet/dry weight ratio，W/D）檢測 每組選擇10只小鼠，分離右上肺葉用于W/D檢測，其余肺葉一部分置于4%多聚甲醛中固定，用于HE染色和Masson染色，另一部分用于羥脯氨酸含量檢測和Ⅱ型肺泡上皮細胞分離。用吸水紙擦干肺組織表面水分后稱重，記錄為濕重（wet weight，W）；隨后將肺組織放入80℃恒溫干燥箱中烘干，24h后稱重，記錄為干重（dry weight，D），計算W/D。

1.4.5 肺泡液體清除率（alveolar fluid clearance，AFC）檢測 每組選擇10只小鼠，仰臥位固定，以0.5%戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉后，打開頸部皮膚，暴露氣管，將氣管剪開一“T”字形切口行氣管插管，將小鼠調(diào)整為頭高腳低的45°仰臥位，通過氣管導管緩慢注入以濃度為0.15mg·mL-1的Evans Blue標記的5%白蛋白等滲0.9%氯化鈉溶液250μL，每次50μL，每2min灌注一次，同時給予純氧4mL/min持續(xù)吸入。灌注完畢20min后處死小鼠，將小鼠調(diào)整為頭低腳高的45°仰臥位，輕輕擠壓兩側(cè)胸壁，用移液器吸取肺泡液體，于620nm處檢測吸光度（optical density，OD）值。根據(jù)標準曲線計算AFC，AFC（%）=[（Vi-Vf）/Vi]×100%，Vf=（Vi×Pi）/Pf，其中Vi為肺泡液體灌注量，Vf為肺泡液體最終剩余量，Pi為灌注前肺泡液體白蛋白濃度，Pf為灌注后肺泡液體白蛋白濃度。

1.4.6 小鼠肺組織病理學觀察

1.4.6.1 肺組織病理學觀察 取小鼠肺組織，置于4%多聚甲醛中固定48h，蒸餾水清洗，梯度乙醇脫水，制作組織蠟塊，4μm切片，二甲苯脫蠟30min，95%、80%的乙醇及蒸餾水中復水，HE染色，脫水、透明后封片，鏡下觀察各組小鼠肺組織病理變化。

1.4.6.2 肺組織纖維化觀察 取小鼠肺組織，肺組織切片、脫蠟、復水過程同1.4.6.1，Weigert鐵蘇木素染色5min，酸性乙醇分化5～15s，Masson藍化液返藍3～5min，麗春紅酸性品紅染液染色5～10min，弱酸工作液洗滌后磷鉬酸溶液染色1min，弱酸工作液再次洗滌，苯胺藍染色1～2min，弱酸工作液洗滌后，95%乙醇和無水乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，鏡下觀察肺組織纖維化情況。

1.4.7 羥脯氨酸含量測定 取0.2g小鼠肺組織，剪碎后加入6mol·L-1鹽酸2mL，煮沸消化至無肉眼可見的組織塊，16 000r/min離心20min，離心半徑為12.5cm，調(diào)整pH值至6～8，蒸餾水定容至4mL，取上清液，560nm波長檢測OD值，根據(jù)標準曲線計算組織中羥脯氨酸含量。

1.4.8 小鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞的分離 取各組小鼠新鮮肺組織，磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered solution，PBS）清洗、剪碎后放入離心管，加入適量1g·L-1胰蛋白酶（含脫氧核糖核酸酶Ⅰ 0.01g·L-1）混合均勻，37℃消化5min，加入等量DMEM完全培養(yǎng)基終止消化，此過程重復兩次，合并兩次消化所得的細胞懸液；消化后的剩余肺組織采用1g·L-1Ⅰ型膠原酶（含脫氧核糖核酸酶Ⅰ 0.01g·L-1）37℃消化15min，合并所有細胞懸液，200目篩網(wǎng)過濾，1 000r/min離心5min，離心半徑為12.5cm，離心2次后棄去上清液，保留細胞沉淀，以DMEM完全培養(yǎng)基重懸，接種到包被小鼠IgG的培養(yǎng)皿中，置于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1h。將含有未黏附細胞的培養(yǎng)基接種到另一包被小鼠IgG的培養(yǎng)皿中，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)1h，重復2次，最后吸出含有未黏附細胞的培養(yǎng)基，離心后棄去上清液，以DMEM完全培養(yǎng)基重懸，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，用于Western blot檢測[10]。

1.4.9 Western blot法檢測α-SMA、p62、LC3-Ⅱ、p-PI3K、p-AKT和p-mTOR蛋白表達水平 收集小鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞，裂解、離心取上清液，測定蛋白濃度后行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）電泳，轉(zhuǎn)膜、封閉后，加入α-SMA、p62、LC3-Ⅱ、p-PI3K、p-AKT和p-mTOR兔源一抗稀釋液（稀釋比例均為1∶1 000）孵育過夜，Tris-Tween緩沖鹽溶液（Tris butfered saline Tween，TBST）清洗后加入二抗（稀釋比例1∶2 000），37℃孵育2h，TBST清洗后滴加ECL試劑，置于凝膠成像系統(tǒng)顯影。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）為內(nèi)參，采用Image J軟件分析各蛋白灰度值，計算蛋白相對表達量，蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值。

1.5 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以±s表示，多樣本比較采用單因素方差分析，兩樣本比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠肺組織W/D和AFC比較 與正常組比較，模型組、強的松組、麥門冬湯高、中、低劑量組小鼠肺組織W/D值均升高，AFC均降低（P＜0.05）；與模型組比較，強的松組、麥門冬湯高、中、低劑量組小鼠肺組織W/D值均降低，AFC均升高（P＜0.05）；與強的松組比較，麥門冬湯高、中劑量組小鼠肺組織W/D值均降低，AFC均升高（P＜0.05），但麥門冬湯低劑量組W/D值和AFC與強的松組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組小鼠肺組織W/D和AFC比較（±s）Tab.1 Comparison of W/D and AFC of lung tissues in each group（±s）

表1 各組小鼠肺組織W/D和AFC比較（±s）Tab.1 Comparison of W/D and AFC of lung tissues in each group（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與強的松組比較，△P＜0.05Note:Compared with normal group，*P＜0.05;compared with model group，#P＜0.05;compared with prednisone group，△P＜0.05

W/D AFC（%）正常組 4.80±0.33 29.27±2.65模型組 10.11±0.72* 18.51±2.84*強的松組 8.94±0.48*# 23.03±3.32*#麥門冬湯高劑量組 5.80±0.39*#△ 27.94±2.97*#△麥門冬湯中劑量組 7.31±0.40*#△ 25.32±3.01*#△麥門冬湯低劑量組 8.97±0.42*# 23.18±2.96*#組別

2.2 各組小鼠肺組織炎癥和纖維化情況比較 HE染色和Masson染色結(jié)果顯示，正常組小鼠肺組織未見明顯結(jié)構(gòu)異常，無充血、水腫和炎癥浸潤，肺間質(zhì)僅有少量散在的藍色膠原纖維組織。與正常組比較，模型組小鼠肺組織肺泡壁明顯增厚，肺泡腔變小，肺組織正常結(jié)構(gòu)基本消失，有部分炎癥細胞浸潤，并可見大量藍色膠原纖維組織增生，呈實質(zhì)樣變化。與模型組比較，麥門冬湯高、中劑量組小鼠肺組織肺泡結(jié)構(gòu)相對清晰，炎癥細胞浸潤和膠原纖維增生較少，藍色膠原纖維組織亦顯著減少，但麥門冬湯低劑量組和強的松組小鼠肺組織仍存在炎癥細胞浸潤、肺泡壁增厚、肺泡腔縮小和膠原沉積的情況。見圖1～2。

圖1 各組小鼠肺組織病理變化（HE染色，400×）Fig.1 Pathological changes in lung tissues in each group（HE staining，400×）

圖2 各組小鼠肺組織膠原纖維沉積情況（Masson染色，400×）Fig.2 Deposition of collagen fibers in lung tissues of mice in each group（Masson staining，400×）

2.3 各組小鼠肺組織羥脯氨酸含量比較 與正常組比較，模型組、強的松組、麥門冬湯高、中、低劑量組羥脯氨酸含量均增加（P＜0.05）。與模型組比較，強的松組和麥門冬湯低劑量組羥脯氨酸含量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），麥門冬湯高、中劑量組小鼠肺組織羥脯氨酸含量均降低（P＜0.05）。與強的松組比較，麥門冬湯高、中劑量組羥脯氨酸含量降低（P＜0.05），麥門冬湯低劑量組羥脯氨酸含量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。 見表2。

表2 各組小鼠肺組織羥脯氨酸含量比較（±s）Tab.2 Comparison of hydroxyproline content in lung tissues in each group（±s）

表2 各組小鼠肺組織羥脯氨酸含量比較（±s）Tab.2 Comparison of hydroxyproline content in lung tissues in each group（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與強的松組比較，△P＜0.05Note:Compared with normal group，*P＜0.05;compared with model group，#P＜0.05;compared with prednisone group，△P＜0.05

羥脯氨酸（mg·g-1）正常組 1.49±0.22模型組 2.55±0.38*強的松組 2.66±0.41*麥門冬湯高劑量組 1.96±0.24*#△麥門冬湯中劑量組 1.94±0.29*#△麥門冬湯低劑量組 2.39±0.35*組別

2.4 各組小鼠肺組織α-SMA、p62、LC3-Ⅱ、p-PI3K、p-AKT和p-mTOR蛋白表達比較 與正常組比較，模型組、強的松組、麥門冬湯高、中、低劑量組小鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞α-SMA、p62、p-PI3K、p-AKT和pmTOR蛋白表達均增高，LC3-Ⅱ蛋白表達均降低（P＜0.05）。與模型組比較，麥門冬湯高、中、低劑量組和強的松組小鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞α-SMA、p62、p-PI3K、p-AKT和p-mTOR蛋白表達均降低，LC3-Ⅱ蛋白表達均增高（P＜0.05）。與強的松組比較，麥門冬湯高、中劑量組小鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞α-SMA、p62、p-PI3K、p-AKT和p-mTOR蛋白表達均降低，LC3-Ⅱ蛋白表達均增加（P＜0.05），而麥門冬湯低劑量組小鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞中上述蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖3、表3。

圖3 Western blot檢測小鼠肺組織α-SMA、p62、LC3-Ⅱ、p-PI3K、p-AKT和p-mTOR蛋白表達Fig.3 Protein expressions of α-SMA，p62，LC3-Ⅱ，p-PI3K，p-AKT and p-mTOR in mice lung tissues detected by Western blot

表3 各組小鼠肺組織α-SMA、p62、LC3-Ⅱ、p-PI3K、p-AKT和p-mTOR蛋白表達比較（±s）Tab.3 Comparison of the protein expressions of α-SMA，p62，LC3-Ⅱ，p-PI3K，p-AKT and p-mTOR in each group（±s）

表3 各組小鼠肺組織α-SMA、p62、LC3-Ⅱ、p-PI3K、p-AKT和p-mTOR蛋白表達比較（±s）Tab.3 Comparison of the protein expressions of α-SMA，p62，LC3-Ⅱ，p-PI3K，p-AKT and p-mTOR in each group（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與強的松組比較，△P＜0.05Note:Compared with normal group，*P＜0.05;compared with model group，#P＜0.05;compared with prednisone group，△P＜0.05

組別 α-SMA p62 LC3-Ⅱ p-PI3K p-AKT p-mTOR正常組 0.15±0.02 0.16±0.03 0.90±0.07 0.16±0.02 0.20±0.03 0.19±0.02模型組 0.99±0.10* 0.96±0.08* 0.18±0.03* 0.98±0.08* 0.95±0.08* 1.02±0.09*強的松組 0.69±0.03*# 0.68±0.02*# 0.26±0.04*# 0.70±0.08*# 0.67±0.03*# 0.76±0.01*#麥門冬湯高劑量組 0.26±0.02*#△ 0.27±0.03*#△ 0.50±0.02*#△ 0.28±0.03*#△ 0.26±0.02*#△ 0.28±0.02*#△麥門冬湯中劑量組 0.44±0.04*#△ 0.33±0.05*#△ 0.41±0.03*#△ 0.36±0.04*#△ 0.43±0.05*#△ 0.46±0.05*#△麥門冬湯低劑量組 0.72±0.06*# 0.65±0.08*# 0.29±0.01*# 0.73±0.06*# 0.65±0.06*# 0.78±0.08*#

3 討論

IPF是一類彌散性實質(zhì)性肺部疾病，尚無特效治療藥物，雖然糖皮質(zhì)激素在臨床應用廣泛，但其療效尚未得到明確認可，而且不良反應較多，往往造成患者免疫功能降低和肝腎功能損害[11-12]。麥門冬湯由麥門冬、半夏、甘草、人參、粳米和大棗6味藥材組成，具有降逆下氣和益胃生津之功效，臨床用于治療肺損傷、肺癌以及間質(zhì)性肺病如IPF等[13-14]，但麥門冬湯治療間質(zhì)性肺疾病的作用機制尚不清楚。

本研究構(gòu)建BLM誘導的小鼠間質(zhì)性肺炎模型，觀察麥門冬湯對小鼠間質(zhì)性肺炎的改善作用。既往研究證實，BLM滴鼻可誘導小鼠肺纖維化，引起肺W/D值升高，肺水含量增加，肺組織可出現(xiàn)間隔明顯增厚和膠原纖維沉積等與人類肺纖維化相似的病理學改變[15]。本研究結(jié)果提示，麥門冬湯可顯著降低小鼠肺組織W/D值，升高AFC，其中麥門冬湯高、中劑量的作用優(yōu)于強的松組，并呈劑量依賴性，表明麥門冬湯能夠減輕BLM導致的肺損傷，提高肺組織的肺水清除功能，其中麥門冬湯高劑量的療效最佳。進一步以HE染色和Masson染色觀察麥門冬湯對小鼠肺組織炎癥和纖維化等病理變化的影響，結(jié)果顯示BLM可明顯改變肺組織結(jié)構(gòu)，增加炎癥浸潤和膠原纖維的增生，而麥門冬湯高、中劑量組能夠顯著抑制肺組織炎癥浸潤和膠原纖維沉積，效果優(yōu)于麥門冬湯低劑量組和強的松組。羥脯氨酸含量檢測可以反映組織膠原蛋白的生成情況，本研究提示高、中劑量麥門冬湯可減少小鼠肺組織羥脯氨酸含量，使膠原蛋白表達顯著減少，但該作用不呈劑量依賴性，低劑量麥門冬湯和強的松對肺組織膠原蛋白生成的作用無影響，說明一定劑量的麥門冬湯對BLM誘導的小鼠間質(zhì)性肺炎炎癥浸潤和膠原蛋白形成過程具有抑制作用。

自噬是人體正常的細胞生物學行為，涉及正常細胞的細胞穩(wěn)態(tài)和生存機制，在肺部感染和炎癥反應中起著至關重要的作用[16]。mTOR是自噬活動的負調(diào)控靶點，根據(jù)環(huán)境營養(yǎng)的變化，調(diào)控細胞生長和代謝，磷酸化mTOR可抑制細胞自噬功能，而mTOR抑制劑雷帕霉素處理后可激活細胞自噬活性。研究發(fā)現(xiàn)，間質(zhì)性肺炎患者肺成纖維細胞中mTOR被過度激活，LC3-Ⅱ蛋白表達明顯下降，而p62的活性明顯增加，肺組織細胞自噬活性降低，抑制mTOR則可增強自噬，使肺纖維化得到緩解[17]。同時，抑制自噬功能可使細胞外基質(zhì)沉積增加，同時導致α-SMA蛋白表達增加，肺泡上皮細胞則出現(xiàn)異常修復，說明自噬缺陷是促進間質(zhì)性肺炎肺纖維化發(fā)展的重要原因[6]。PI3K是mTOR的傳統(tǒng)上游激活劑，通過磷酸化其下游重要的信號轉(zhuǎn)導分子AKT來調(diào)節(jié)自噬，AKT激活后可通過使結(jié)節(jié)性硬化復合物2（tuberous sclerosis complex 2，TSC2）磷酸化進而激活mTOR，活化的mTOR進一步激活下游相關因子，調(diào)控細胞的增殖及蛋白質(zhì)合成，加速細胞代謝，從而導致自噬的抑制[18]。徐昌君等[19]研究證明，PI3K/AKT/mTOR信號通路在細胞自噬活動調(diào)控中起重要作用，而間質(zhì)性肺病中肺纖維化的形成可能與細胞自噬功能缺陷有關，抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路能夠提升細胞自噬功能，從而抑制肺纖維化的進展。Hsu等[20]研究證明，PI3K/AKT/mTOR信號通路影響肺成纖維細胞的增殖，從而促進BLM誘導的肺纖維化。本研究發(fā)現(xiàn)，BLM可顯著提高小鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞α-SMA、p62、p-PI3K、p-AKT和p-mTOR蛋白表達，降低LC3-Ⅱ蛋白表達。與模型組比較，不同劑量麥門冬湯和強的松均能抑制小鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞α-SMA、p62、p-PI3K、p-AKT和p-mTOR蛋白表達，升高LC3-Ⅱ蛋白表達，但與強的松組比較，麥門冬湯高、中劑量組小鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞α-SMA、p62、p-PI3K、p-AKT和p-mTOR蛋白表達均降低，LC3-Ⅱ蛋白表達均增加，而麥門冬湯低劑量組蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義，表明麥門冬湯可通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路增強自噬活性，從而阻止間質(zhì)性肺炎小鼠肺纖維化的發(fā)展，其作用與強的松類似，甚至可能優(yōu)于強的松。

綜上所述，麥門冬湯可減輕間質(zhì)性肺炎小鼠肺組織肺水含量，提高肺水清除能力，抑制肺組織炎癥和纖維化病變，其作用可能與抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路，增強肺組織細胞自噬活性有關。但本研究僅在動物水平進行初步探討，更詳細的分子機制尚需結(jié)合體外實驗進一步深入探究。