治療性單克隆抗體的藥物監(jiān)測(cè)：LC-MS/MS技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)展

夏 穎，郭宏麗，胡雅慧，陳 峰

（南京醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院藥學(xué)部藥學(xué)研究中心，南京210008）

近年來(lái)，治療性單克隆抗體（monoclonal antibody，mAb）在臨床中應(yīng)用越來(lái)越廣泛，其用于多種疾病的治療，包括各種腫瘤、免疫疾病、炎癥性疾病等［1-5］。但是，mAbs的藥代動(dòng)力學(xué)（PK）和藥效動(dòng)力學(xué)（PD）過(guò)程非常復(fù)雜，具有非線性動(dòng)力學(xué)特征、個(gè)體暴露差異大、以非特異性途徑消除、特異性靶標(biāo)介導(dǎo)以及藥物處置個(gè)體差異大［6］。因此，需要對(duì)mAbs 進(jìn)行治療藥物監(jiān)測(cè)（therapeutic drug monitoring，TDM），通過(guò)測(cè)定患者體內(nèi)的藥物暴露、藥理標(biāo)志物或藥效指標(biāo)，實(shí)施個(gè)體化藥物治療［7-9］。

mAbs 的傳統(tǒng)生物分析方法包括：液相放射免疫測(cè)定、固相酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定、報(bào)告基因測(cè)定、酶免疫測(cè)定、均相遷移測(cè)定等［10-11］，以酶聯(lián)免疫法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）最為常用［7］，該方法簡(jiǎn)單快速、可用于高通量分析，但其存在定量范圍較窄（約2個(gè)數(shù)量級(jí)）、方法開(kāi)發(fā)時(shí)間長(zhǎng)、存在交叉免疫、非特異性結(jié)合、專屬性差、僅可測(cè)定抗體的游離形式等缺點(diǎn)，限制了其應(yīng)用［12-13］。近年來(lái)，LC-MS/MS 法在大分子藥物領(lǐng)域的應(yīng)用引起了廣泛的關(guān)注，與傳統(tǒng)ELISA 相比，其定量范圍更寬（3～5個(gè)數(shù)量級(jí)）、選擇性高、方法開(kāi)發(fā)時(shí)間短、結(jié)果更可靠［12，14］。然而，LC-MS/MS 作為小分子藥物定量的“金標(biāo)準(zhǔn)”，在mAbs 的檢測(cè)中存在難點(diǎn)，如mAbs 相對(duì)分子質(zhì)量約10～15 kD，內(nèi)源性干擾蛋白含量達(dá)60～80 g/L［12］，因而其樣品前處理更為復(fù)雜，目前仍難以確定建立LC-MS/MS 的最佳策略。本文綜述了近年來(lái)LC-MS/MS 測(cè)定mAbs 的分析方法、分析過(guò)程、常見(jiàn)問(wèn)題及解決辦法，為臨床mAbs的TDM提供技術(shù)指導(dǎo)。

1 基于LC-MS/MS定量分析mAbs的方法分類

LC-MS/MS 定量分析mAbs 主要有兩種途徑：（1）“自下而上”（bottom-up approach）分析，即把mAbs 酶解成更小的肽，然后選取一個(gè)或多個(gè)特征肽進(jìn)行LC-MS/MS 分析。（2）“自上而下”（top-down approach）分析，即直接用LC-MS/MS 分析完整的mAbs，但此方法受分析物大小限制，常適用于相對(duì)分子質(zhì)量小于10～15 kD的mAbs［12］。

“自下而上”的分析檢測(cè)mAbs 某一肽段而非整個(gè)蛋白質(zhì)，所以檢測(cè)靈敏度高，選擇性好，應(yīng)用廣泛?！白陨隙隆钡姆治隹蓽p少樣品制備步驟，提高分析通量。然而，由于全掃描光譜中蛋白質(zhì)電荷包膜、加合物形成和色譜分離的復(fù)雜性，使其難以獲得足夠的靈敏度［15-16］。因此，該方法的生物分析應(yīng)用較少。故本文將介紹LC-MS/MS“自下而上”分析的工作流程及相關(guān)問(wèn)題。

2 基于LC-MS/MS定量分析mAbs的方法開(kāi)發(fā)

2.1 特征肽（signature peptide）的選擇

方法開(kāi)發(fā)的關(guān)鍵是選擇治療性mAbs 的特征肽，常選擇mAbs 的互補(bǔ)決定區(qū)（CDR）序列的片段作為特征肽，選擇標(biāo)準(zhǔn)為：（1）特征肽應(yīng)具有唯一性（擁有唯一的序列）和代表性；（2）肽序列長(zhǎng)度為6～20 個(gè)氨基酸，若氨基酸太少檢測(cè)易受到干擾，而氨基酸太多會(huì)超出檢測(cè)限；（3）在整個(gè)分析過(guò)程中穩(wěn)定，避免有反應(yīng)性殘基和易被修飾的氨基酸，如甲硫氨酸、天冬酰胺、色氨酸和谷氨酰胺；（4）盡量不含連續(xù)或交替出現(xiàn)的精氨酸、賴氨酸，以及脯氨酸-精氨酸或脯氨酸-賴氨酸序列，以避免酶切不完全；（5）特征肽在MS/MS分析中易于離子化和解離，質(zhì)譜響應(yīng)優(yōu)［14，17-18］。

目前，特征肽的確定方法主要包括：（1）從已有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中尋找特征肽；（2）根據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)特征肽，并選取可信度高的肽段進(jìn)行進(jìn)一步比對(duì)，常用工具軟件包括Peptide Mass，Protein BLAST，Peptide Atlas，Skyline，UniProt/Swissprot 等［14，18］。該法應(yīng)用較多，如Peng等［19］先通過(guò)Peptide Mass 軟件預(yù)測(cè)了英夫利昔單抗CDR 區(qū)的肽段，然后用BLAST 軟件對(duì)比了人血清蛋白和英夫利昔單抗的氨基酸序列，并排除了血清中存在的肽段。通過(guò)理論分析對(duì)比，從而選出候選肽段。為避免后續(xù)方法開(kāi)發(fā)出現(xiàn)其他問(wèn)題，因此建議選擇兩個(gè)或多個(gè)特征肽進(jìn)行MS/MS 定量［14］。特別是采用選擇性反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（SRM）進(jìn)行測(cè)定時(shí)，質(zhì)量分辨率不夠高，可能會(huì)存在離子通道的干擾，樣品分析中若出現(xiàn)較明顯的信號(hào)變化，提示可能存在干擾［20］。部分文獻(xiàn)中抗體藥物進(jìn)行LC-MS/MS 分析時(shí)選用的特征肽見(jiàn)表1。

2.2 樣品前處理

mAbs 基質(zhì)樣品復(fù)雜，混有大量?jī)?nèi)源性蛋白質(zhì)和小分子化合物，因此需對(duì)其進(jìn)行樣品前處理，以提高靈敏度、選擇性和準(zhǔn)確性。

2.2.1 直接酶解法 該法選用一定量的胰蛋白酶直接對(duì)mAbs 進(jìn)行酶切，與其他方法相比，該法操作簡(jiǎn)單，成本更低。因?yàn)榫彼岷唾嚢彼嵩趍Abs 中出現(xiàn)頻率較高，胰蛋白酶會(huì)切割精氨酸和賴氨酸后的肽鍵，故常選用胰蛋白酶作為蛋白水解酶［14］。通常，需考察緩沖液種類、加入酶量、孵育溫度、孵育時(shí)間等對(duì)酶切效率的影響；并可考慮是否需要微波、高溫、有機(jī)溶劑或振搖等加速反應(yīng)以提高酶切效率，Mouchahoir 等［23］借助LC-MS/MS方法建立NISTmAb 的肽譜圖時(shí)對(duì)上述條件進(jìn)行了詳細(xì)的考察，從而獲得了最佳條件。另外，還需優(yōu)化胰蛋白酶與目標(biāo)蛋白的加入比例，Chiu 等［24］在分析貝伐單抗時(shí)，考察了胰蛋白酶與目標(biāo)蛋白加入比例1∶10 到1∶100 之間的酶切效率，發(fā)現(xiàn)其比例1∶50時(shí)酶切效率最高。該方法包括溶液中酶解法和蛋白球酶解法。

表1 LC-MS/MS定量分析單克隆抗體的特征肽

溶液中酶解法，是通過(guò)加熱或添加表面活性劑［如十二烷基硫酸鈉（SDS）或RapiGest，等］使蛋白質(zhì)變性，然后用二硫蘇糖醇（DTT）或三（2-羧乙基）膦等還原二硫鍵，再加入碘乙酰胺（IAA）等烷化劑使還原后的巰基烷基化，形成穩(wěn)定硫化物，以阻止二硫鍵的恢復(fù)，最后加入胰蛋白酶進(jìn)行酶切處理，用甲酸終止酶切反應(yīng)，得到所需肽段。

蛋白球酶解法，是用甲醇、乙腈、飽和硫酸銨溶液等將待測(cè)樣品進(jìn)行蛋白沉淀，離心去除上清液后用碳酸氫銨溶液復(fù)溶蛋白球，得到均勻的蛋白懸浮液，直接加入胰蛋白酶酶解［21］或加入三氟乙醇（TFE）、DDT、IAA 等進(jìn)一步變性后，加入胰蛋白酶酶解，最后用甲酸終止反應(yīng)［13］。Ouyang 等［25］在定量分析蛋白1（候選生物大分子藥物）的實(shí)驗(yàn)中，采用蛋白球酶解法進(jìn)行樣品前處理，并將其與溶液中酶解法進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)蛋白球酶解法處理后待測(cè)物的響應(yīng)比后一種方法的響應(yīng)高15 倍，基質(zhì)效應(yīng)也得到了改善，酶解效率更高。

總體而言，蛋白球酶解法可有效地去除一些水溶性蛋白、磷脂、鹽類等，與溶液中酶解法相比，提取后的樣品更干凈，干擾更少［26］。故蛋白球酶解法相對(duì)更優(yōu)，應(yīng)用也越來(lái)越廣。

2.2.2 酶解結(jié)合固相萃取法（SPE） 該方法包括樣品經(jīng)SPE 柱后進(jìn)行酶解和酶解后的樣品經(jīng)過(guò)SPE 柱兩種，該類方法可實(shí)現(xiàn)樣品的進(jìn)一步純化，是一種更具選擇性、靈敏度更高的樣品凈化方式，可以除去絕大部分干擾物質(zhì)，降低雜質(zhì)信號(hào)［26］。常用的SPE 柱有Oasis MCX 96 孔板、Bond Elit C18SPE 柱等［27］。對(duì)于體積排阻SPE，利用分子排阻原理，排除無(wú)法進(jìn)入SPE 孔隙的大分子蛋白。例如，40～80 ? 孔徑的SPE 柱可以大致去除相對(duì)分子質(zhì)量大于20 kD 的蛋白質(zhì)。而離子交換SPE 與反相色譜正交分離模式聯(lián)用時(shí)，通常有更高的選擇性凈化作用［12］。Shibata［28］等在蛋白酶解后進(jìn)一步用Oasis HLB 的SPE 柱純化樣品，成功定量人血清中西妥昔單抗?jié)舛炔⒂糜谀[瘤患者的藥代動(dòng)力學(xué)研究。

2.2.3 高豐度蛋白質(zhì)的去除 由于生物樣品的組成很復(fù)雜，其內(nèi)源性蛋白的總濃度高達(dá)60～80 mg/mL。故簡(jiǎn)單的酶解處理不能滿足低豐度蛋白的檢測(cè)靈敏度，即需要進(jìn)行富集操作，以減少干擾并提高mAbs 分析的靈敏度，其中一種富集方法是去除高豐度蛋白。白蛋白是含量最豐富的蛋白質(zhì)，質(zhì)量濃度為35～50 mg/mL，故常利用化學(xué)親和力或免疫親和力，采用白蛋白消耗試劑盒去除血清中大量白蛋白或其他高豐度蛋白［12］。Echan等［29］用白蛋白試劑盒處理后，結(jié)果顯示蛋白含量降低了85%。Liu［30］等用異丙醇和1.0%三氯乙酸的混合物去除血漿中白蛋白，結(jié)果表明該方法可去除95%的白蛋白，且目標(biāo)蛋白幾乎無(wú)損耗，該方法簡(jiǎn)單穩(wěn)健，成功用于測(cè)定猴血清中靶標(biāo)蛋白BMS-C的濃度。

2.2.4 免疫親和捕獲法 mAbs 樣品前處理常需要用特異性或非特異性方法富集目標(biāo)分析物。其中，免疫捕獲富集是最常用的方法，其通過(guò)特異性抗體等捕獲目標(biāo)蛋白或其特征肽，然后洗脫除去未被捕獲的雜質(zhì)，再將待測(cè)物與捕獲劑分離，洗脫收集待測(cè)物后進(jìn)行酶切處理。使用的捕獲劑包括抗獨(dú)特型抗體、目標(biāo)mAbs 本身的配體蛋白、蛋白A、蛋白G、抗人Fc抗體等，一般前兩種用于具有抗原結(jié)合位點(diǎn)的mAbs 的親和純化，可定量分析游離藥物（非配體形式）的濃度；而后幾種廣泛用于具有免疫球蛋白（Ig）G Fc 區(qū)域的mAbs 的親和純化，可定量測(cè)定總藥物濃度［31-33］。已有大量文獻(xiàn)報(bào)道通過(guò)蛋白A或蛋白G特異性結(jié)合IgG 的Fc區(qū)域，將蛋白A、G 偶聯(lián)到磁珠上形成磁珠復(fù)合體或采用蛋白A、G 樹脂，高效地進(jìn)行目標(biāo)蛋白的捕獲。Chiu等［33］開(kāi)發(fā)了一種普遍適用于IgG 的mAbs藥物的親和純化方法，其采用蛋白G 磁珠捕獲并分離出目標(biāo)蛋白，去除了其他高濃度的干擾蛋白，大大降低了基質(zhì)復(fù)雜性，提高了選擇性。同時(shí)，純化步驟會(huì)減少胰蛋白酶的用量，從而節(jié)約成本。

Ig 是血清中最豐富的蛋白質(zhì)之一［34-35］，這些內(nèi)源性Ig 在上述純化過(guò)程中會(huì)與治療性mAbs 一起被提取，在質(zhì)譜分析時(shí)產(chǎn)生干擾并競(jìng)爭(zhēng)性抑制電離。此外，在免疫親和作用中，內(nèi)源性Ig 將與治療性mAbs 競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合位點(diǎn)，從而可能降低回收率。Amrani 等［31］開(kāi)發(fā)了一種免疫親和純化方法，彌補(bǔ)了此缺點(diǎn)。其用涂有鏈霉親和素的96孔板捕獲生物素化的腫瘤壞死因子-α（b-TNF-α），從而選擇性提取人血清中英夫利昔單抗的活性形式。Jourdil等［36］也用類似的免疫親和捕獲方法成功定量分析了人血漿中英夫利昔單抗的濃度。

2.3 內(nèi)標(biāo)的選擇

選擇內(nèi)標(biāo)對(duì)于LC-MS/MS 分析至關(guān)重要，其可有效地校正樣本處理分析過(guò)程中的偏差及基質(zhì)效應(yīng)，從而確保分析方法的穩(wěn)健性和檢測(cè)結(jié)果的可靠性。

2.3.1 穩(wěn)定同位素標(biāo)記的特征肽（SIL 肽） SIL肽是目前最常用的一種內(nèi)標(biāo)，通常在酶切處理后加入。這種方法非常直接，能有效校正酶切后及LC-MS/MS 分析過(guò)程中的偏差，且SIL 肽常易于以低成本合成［37］。但是，這類內(nèi)標(biāo)的主要缺點(diǎn)之一是不能校正樣品處理過(guò)程中一些關(guān)鍵步驟如提取、酶切等引入的偏差，因此，可能會(huì)導(dǎo)致定量結(jié)果的偏倚［38］。

2.3.2 穩(wěn)定同位素標(biāo)記的延伸特征肽（延伸SIL肽） 延伸SIL 肽即在特征肽兩端的酶切位點(diǎn)加上額外的氨基酸。在樣品酶切前加入延伸SIL 肽內(nèi)標(biāo)，該類內(nèi)標(biāo)可隨樣品一起被胰蛋白酶酶切，從而在一定程度上校正酶切效率的變化［39］。當(dāng)然，由于這類內(nèi)標(biāo)是單純的肽段，酶切位點(diǎn)單一，故其比治療性mAbs 更易被酶切。所以，嚴(yán)格來(lái)說(shuō)，這類內(nèi)標(biāo)的酶切效率與治療性mAbs 的也不等同。且對(duì)于免疫親和捕獲法，捕獲劑如蛋白G 無(wú)法捕獲延伸SIL肽，故無(wú)法校正親和捕獲過(guò)程［24］。

2.3.3 穩(wěn)定同位素標(biāo)記蛋白（SIL 蛋白） SIL 蛋白作為內(nèi)標(biāo)，通常在樣品處理開(kāi)始時(shí)添加，甚至在樣品采集期間添加，從而很好地監(jiān)測(cè)酶切效率、樣品處理全過(guò)程和LC-MS/MS 分析結(jié)果。這類內(nèi)標(biāo)可以作為金標(biāo)準(zhǔn)來(lái)確保方法的準(zhǔn)確性和精密度。但缺點(diǎn)是不易獲得，要制備完全相同的SIL 蛋白是相當(dāng)困難的，因?yàn)榧词故桥囵B(yǎng)條件的微小差異也可能導(dǎo)致糖鏈或氨基酸修飾的顯著差異［12］。

2.3.4 蛋白質(zhì)類似物 當(dāng)難以獲得SIL 蛋白內(nèi)標(biāo)時(shí)，可考慮選用蛋白質(zhì)類似物為內(nèi)標(biāo)。蛋白質(zhì)類似物內(nèi)標(biāo)應(yīng)盡可能與治療性mAbs 相似，以更好地校正目標(biāo)蛋白的分析偏差。例如，Willrich 等［13］選用馬的IgG 作為內(nèi)標(biāo)，與SIL 蛋白相比，選用的IgG與治療性mAb 有相似的三級(jí)結(jié)構(gòu)，是種屬特異性肽并大大降低了成本，使用馬IgG 內(nèi)標(biāo)有助于克服胰蛋白酶酶切效率的變化，提高了批間精密度。

另外，Damen 等［40］用兩種內(nèi)標(biāo)校正方法進(jìn)行3種IgG 的mAbs藥物的同時(shí)分析：SIL肽內(nèi)標(biāo)可以校準(zhǔn)樣品前處理過(guò)程及LC-MS/MS 分析的偏差，但每個(gè)待測(cè)物需要各自的SIL 肽內(nèi)標(biāo)；而柱后輸注內(nèi)標(biāo)（PCI-IS）可作為通用內(nèi)標(biāo)，校正基質(zhì)效應(yīng)，但無(wú)法校正前處理過(guò)程的偏差。故選用貝伐單抗的延伸SIL 肽和PCI-IS 兩種內(nèi)標(biāo)，從而有效地提高了定量的準(zhǔn)確度和精密度。表2 總結(jié)了近年來(lái)部分文獻(xiàn)中選用的內(nèi)標(biāo)。

3 基于LC-MS/MS 定量分析mAbs 前處理的常見(jiàn)問(wèn)題

3.1 多電荷的影響

與小分子化合物不同，在ESI 條件下，蛋白質(zhì)或肽會(huì)形成多電荷離子，從而使高分子質(zhì)量的蛋白或肽在質(zhì)譜有限的質(zhì)荷比掃描范圍內(nèi)能被檢測(cè)到。但是同一蛋白或肽在不同的ESI 條件下電離會(huì)產(chǎn)生電荷分布不同的多電荷離子峰簇，其豐度和穩(wěn)定性存在較大差異，從而降低了質(zhì)譜檢測(cè)的分辨率和選擇性。所以對(duì)于LC-MS/MS 分析蛋白類藥物，需特別注意要選擇靈敏度高的母離子。此外，離子源參數(shù)特別是去簇電壓（DP）、流動(dòng)相的組成、pH、基質(zhì)等對(duì)其質(zhì)譜響應(yīng)的影響顯著。Hahne等［43］通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在流動(dòng)相中加入一定量的二甲基亞砜（DMSO）能增加肽類的質(zhì)譜響應(yīng)。因此，在方法開(kāi)發(fā)中需全面優(yōu)化以上幾個(gè)因素，從而建立靈敏度高、穩(wěn)健的方法。有研究表明，帶2 個(gè)電荷或3個(gè)電荷的母離子較常用，其質(zhì)荷比在質(zhì)譜較常用的檢測(cè)范圍內(nèi)（400～1 000）［44］。

表2 LC-MS/MS定量分析單克隆抗體的內(nèi)標(biāo)

3.2 穩(wěn)定性

穩(wěn)定性是mAbs 定量分析的主要關(guān)注點(diǎn)。研究表明，樣品儲(chǔ)存條件影響蛋白質(zhì)或肽的穩(wěn)定性［45］。尤其是低濃度時(shí)，蛋白質(zhì)或肽易受體內(nèi)蛋白酶水解的影響。可以在樣品處理的一個(gè)或多個(gè)環(huán)節(jié)加入蛋白酶抑制劑［46］，且樣品前處理應(yīng)在冰上或4 ℃條件下處理，因?yàn)榇蠖鄶?shù)蛋白酶在室溫至37 ℃時(shí)活性最佳。

此外，某些氨基酸如蛋氨酸和半胱氨酸易發(fā)生氧化，因此，應(yīng)盡量減少暴露在空氣中的時(shí)間。因半胱氨酸易于形成分子內(nèi)和分子間二硫鍵，常加入DTT 或2-巰基乙醇，以完全還原二硫鍵，然后用IAA或碘乙酸烷基化。

pH也影響mAbs的穩(wěn)定性。在酸性條件下，某些氨基酸殘基末端易發(fā)生裂解及脫酰胺作用等。因此，應(yīng)盡可能在pH 近中性的緩沖液中處理并儲(chǔ)存mAbs。還需注意的是，反復(fù)凍融、劇烈渦旋等會(huì)破壞蛋白質(zhì)，樣品處理過(guò)程應(yīng)溫和，儲(chǔ)存過(guò)程中也應(yīng)避免此類情況［12］。

3.3 吸 附

mAbs易吸附于容器壁、移液槍頭、LC-MS系統(tǒng)管路等，導(dǎo)致各濃度水平回收率不平行、質(zhì)譜響應(yīng)降低等。一般，帶正電的肽及蛋白易吸附于帶負(fù)電的玻璃表面，而中性肽及蛋白由于疏水性相互作用，易吸附于疏水性的聚丙烯材料物上。然而，吸附不容易預(yù)測(cè)，僅在實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出來(lái)［47］。根據(jù)這種非特異性吸附的原理及影響因素，可采取以下措施解決：（1）根據(jù)肽及蛋白的性質(zhì)選擇合適的容器；（2）在待測(cè)物溶液中加入置換劑，常用結(jié)構(gòu)類似物或富含蛋白溶液（血漿、血清等）。如Peng等［19］在定量測(cè)定英夫利昔單抗時(shí)，其儲(chǔ)備液以空白血清為溶劑配制；（3）在待測(cè)物溶液中加入有機(jī)溶劑、酸、鹽或表面活性劑等，改善肽類溶解度，從而減少損失。Zhang 等［48］發(fā)現(xiàn)溶劑為50%乙腈水溶液時(shí)，肽類吸附最少，回收率相對(duì)較高。

3.4 特異性蛋白結(jié)合

LC-MS/MS 測(cè)定肽和蛋白的一個(gè)潛在問(wèn)題是待測(cè)樣品與蛋白特異性結(jié)合。隨著生物藥物的快速發(fā)展，一個(gè)值得關(guān)注的問(wèn)題是抗藥抗體（ADA）的形成，其產(chǎn)生于機(jī)體免疫系統(tǒng)的一種自身保護(hù)［45］。而ADA的存在除了可能導(dǎo)致生物制劑臨床療效喪失外，在LC-MS/MS 定量測(cè)定時(shí)也會(huì)導(dǎo)致結(jié)果有偏差，因此在樣品處理時(shí)需將ADA和mAbs分開(kāi)。Ji 等［49］在固相萃取前，用8 mol/L 鹽酸胍變性猴血漿樣品，使小分子蛋白藥物與其ADA分離。

3.5 翻譯后修飾（PTM）

PTM 的一些常見(jiàn)形式包括磷酸化、糖基化、泛素化、亞硝基化、甲基化、乙酰化、脂化和蛋白水解。因其會(huì)影響蛋白的特性，故在定量測(cè)定時(shí)必須考慮PTM。一般而言，當(dāng)選擇特征肽時(shí)，應(yīng)排除含有潛在PTM 的序列。若要定量糖蛋白，可通過(guò)PNGase F 糖苷酶切去N 糖。根據(jù)研究目的不同，有時(shí)又需要以含PTM 的蛋白質(zhì)作為目標(biāo)蛋白，這給LC-MS/MS 定量方法的開(kāi)發(fā)帶來(lái)了很大的挑戰(zhàn)，因?yàn)楹蠵TM 的特定序列可能不適合LC-MS/MS分析?？偟膩?lái)說(shuō)，PTM 會(huì)影響LC-MS/MS 檢測(cè)的準(zhǔn)確性，應(yīng)盡量避免［12］。

4 總結(jié)與展望

LC-MS/MS 在mAbs 分析研究中越來(lái)越受關(guān)注，與傳統(tǒng)方法比較，其選擇性好、重現(xiàn)性佳、方法穩(wěn)健、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，是ELISA 等方法強(qiáng)有力的補(bǔ)充。然而，由于mAbs 的固有特征，LC-MS/MS 定量測(cè)定mAbs 面臨著諸多挑戰(zhàn)，其樣品處理操作相對(duì)繁瑣。相信隨著LC-MS/MS 技術(shù)的發(fā)展，可以實(shí)現(xiàn)部分操作的自動(dòng)化，儀器性能也會(huì)有更好地提高，從而將LC-MS/MS 技術(shù)廣泛用于mAbs 的治療藥物監(jiān)測(cè)，更好地發(fā)揮抗體藥物的治療作用。