免疫檢查點及其抑制劑在腦膠質瘤中的研究進展

陳文婷，柳 軍

（中國藥科大學新藥篩選中心，南京210009）

腦膠質瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最常見且致命的原發(fā)性惡性腫瘤。其中Ⅳ級膠質母細胞瘤（glioblastoma，GBM）患者的預后最差，其5 年相對生存率低于5%，且最終都會復發(fā)［1］。膠質母細胞瘤的常規(guī)療法是手術切除后輔以放療并聯(lián)合使用替莫唑胺（temozolomide）化療，效果仍不理想［2］。傳統(tǒng)手術的局限性主要是由于腫瘤的擴散浸潤性，阻止了正常腦實質浸潤細胞的完全切除，因此臨床上亟需新的療法來改善患者預后［3］。

除化療、放療、手術和其他靶向治療外，腫瘤免疫治療（也稱為免疫腫瘤學）現(xiàn)在被認為是腫瘤治療的第五大支柱，主要是由于免疫檢查點抑制劑的快速發(fā)展［4-6］，因此該療法有望造福腦膠質瘤患者。免疫檢查點分子通過調節(jié)T 細胞對自身抗原的免疫反應來限制自身免疫的發(fā)展，但也會像“剎車”一樣限制免疫系統(tǒng)對癌細胞的攻擊，不同的免疫檢查點其作用機制也不盡相同［7］。本文綜述了免疫檢查點分子及其抑制劑在腦膠質瘤中的研究現(xiàn)狀，為探索和研發(fā)更為有效的免疫治療方案提供參考。

1 免疫檢查點分子在腦膠質瘤中的研究

1.1 程序性死亡蛋白-1及其配體（PD-1/PD-L1）

PD-1表達于活化的T細胞、B 細胞、單核細胞、樹突狀細胞（dendritic cell，DC）和自然殺傷細胞（natural killer，NK）。PD-L1 是PD-1 的主要配體，有研究發(fā)現(xiàn)其在乳腺癌、黑色素瘤和口腔鱗狀細胞癌等多種腫瘤組織中高表達［8］。PD-1 與PD-L1結合可以抑制T細胞受體下游的信號傳遞，從而阻斷T 細胞活化的第一信號，阻止T 細胞的增殖，促進活化T 細胞的凋亡，抑制各種細胞因子的產(chǎn)生，導致腫瘤反應性T 細胞的耗竭而導致免疫逃逸［9］。PD-L1 的表達與腦膠質瘤的惡性級別正相關且在腫瘤生長邊緣顯著上調［10-11］。值得注意的是，在小膠質細胞/巨噬細胞中也有發(fā)現(xiàn)PD-L1，而PD-1 表達于腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL），且一般集中在血管周圍，并非是腫瘤組織，提示腫瘤浸潤淋巴細胞可能不容易遷移到免疫抑制的腫瘤微環(huán)境中，而在血管周圍發(fā)生阻滯［12］。Nduom 等［13］通過腫瘤基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)PD-1/PD-L1 的表達水平與膠質母細胞瘤患者預后呈負相關，但此觀點仍存在爭議［12］。此外，腦膠質瘤中白介素-10（interleukin-10，IL-10）信號傳導的上調促進了循環(huán)單核細胞和腫瘤浸潤性巨噬細胞中PD-L1 的表達，使其轉變?yōu)槊庖咭种票硇停?4］。PD-1抑制劑與其他療法的聯(lián)合用藥在小鼠腦膠質瘤模型中產(chǎn)生了顯著的療效：PD-1 抑制劑聯(lián)合放療、樹突狀細胞疫苗或替莫唑胺化療可延緩腫瘤生長，顯著提高小鼠的存活率［15-17］，與Toll樣受體3（toll-like receptor 3，TLR3）激動劑聯(lián)合治療腦膠質瘤，增加了樹突狀細胞活化和T 細胞增殖［18］。

1.2 細胞毒性T淋巴細胞相關抗原-4（CTLA-4）

CTLA-4表達在活化的調節(jié)性T細胞（regulatory T cell，Treg）表面，可通過與共刺激分子CD28，競爭性結合抗原呈遞細胞（antigen-presenting cell，APC）表面的配體B7-1 和B7-2，抑制協(xié)同刺激信號，進而抑制T 細胞活化，增強Treg 免疫抑制活性而介導免疫逃逸［19］。Fong 等［20］發(fā)現(xiàn)接種樹突狀細胞疫苗后，膠質母細胞瘤患者的生存率與CD4+和CD8+T 細胞上表達的CTLA-4水平具呈負相關。這表明在樹突狀細胞疫苗的存在下，輔助性T細胞和細胞毒性T細胞上降低CTLA-4的表達可延長患者生存期，從而增強抗腫瘤免疫反應。研究發(fā)現(xiàn)，CTLA-4在高級別膠質瘤患者中的表達高于低級別膠質瘤患者；在異檸檬酸脫氫酶（isocitrate dehydrogenase，IDH）野生型膠質瘤中的表達高于IDH突變型；在間充質分子亞型膠質瘤患者中的表達顯著高于其他分子亞型膠質瘤患者；進一步分析表明腦膠質瘤患者中CTLA-4 表達水平越高，其腫瘤浸潤淋巴細胞的浸潤程度越高，生存率越低，預示著CTLA-4 可作為腦膠質瘤的預后因素［21］。CTLA-4的特異性單克隆抗體（monoclonal antibody，mAb）阻斷劑顯示出了抗腫瘤功效，可降低小鼠腦膠質瘤模型中CD4+FoxP3+Treg 細胞的比例，并提高小鼠的存活率，聯(lián)合PD-1 或PD-L1 抑制劑后治愈率高達75%［22-23］。同時，CTLA-4 抗體阻斷也被證明可增強腫瘤細胞疫苗的效力［24］。

1.3 T細胞免疫球蛋白和黏蛋白分子-3（TIM-3）

TIM-3 既表達于T 細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞、NK，也在腫瘤細胞上表達。TIM-3 與配體半乳凝素-9（galectin-9）和磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PtdSer）結合，誘導T 細胞凋亡，增加吞噬作用，上調促炎細胞因子的分泌而促進腫瘤生長［25］。有研究稱TIM-3通過與配體黏附蛋白癌胚抗原相關細胞黏附分子1（carcinoembryonic antigen-related celladhesion molecule 1，CEACAM-1）的聯(lián)合阻斷可改善小鼠CT26 結腸癌的抗腫瘤免疫反應［26］。此外，高遷移率族蛋白B1（high mobilitygroupbox 1，HMGB1）是TIM-3 的另一配體，腫瘤相關樹突狀細胞表面的TIM-3通過干擾HMGB1介導核酸傳感系統(tǒng)的激活，抑制先天性核酸免疫應答［27］。TIM-3 主要在膠質母細胞瘤和IDH 野生型膠質瘤中高表達，并且在間充質分子亞型膠質瘤中的表達水平顯著上調。它還與膠質瘤的免疫功能密切相關，尤其是T 細胞介導的腫瘤細胞免疫應答和針對腫瘤細胞的細胞毒性。通過Kaplan-Meier 法分析1024例膠質瘤患者的預后，發(fā)現(xiàn)TIM-3的表達與患者的預后呈負相關［28］。外周CD4+和CD8+T 細胞中TIM-3 呈高表達，且與腦膠質瘤惡性級別正相關［29］，而膠質母細胞瘤瘤內CD4+T 細胞中TIM-3 表達水平也較高［30］。在原位小鼠腦膠質瘤模型中，TIM-3 表達于膠質細胞和T 細胞。對腦膠質瘤模型的荷瘤細胞和對側大腦半球細胞的比較發(fā)現(xiàn)，腫瘤浸潤的CD11b+CD45mid膠質細胞中TIM-3 表達較低，而腫瘤浸潤的CD8+T 細胞中TIM-3 表達較高［31］。與雙藥或單藥治療相比，PD-1抑制劑、TIM-3 抑制劑和放療三聯(lián)療法也已被證明可顯著提高小鼠的生存率［32］。目前，全球尚無抗TIM-3的抗體藥物獲批上市，一項諾華公司研制的MBG453（TIM-3 單抗）和PD-1 抑制劑在復發(fā)性膠質母細胞瘤中聯(lián)用的研究，已申請了Ⅰ期臨床試驗（NCT03961971）。

1.4 淋巴細胞活化基因-3蛋白（LAG-3）

LAG-3 是在多種T 細胞（CD4+、CD8+T 細胞為主）和NK、樹突狀細胞、B 細胞上表達的一種免疫球蛋白，可抑制T 細胞增殖和細胞因子分泌［33］。LAG-3在結構上與CD4同源，通過結合抗原呈遞細胞上的主要組織相容性復合物-Ⅱ（major histocompatibility complex-II，MHC-II）傳遞抑制信號，促進Treg 介導的免疫抑制［34］。腫瘤相關基質細胞上表達的半乳凝素-3（galectin-3）和腫瘤細胞表達的肝竇內皮細胞凝集素（liver sinusoidal endothelial cell lectin，LSECtin）也被認為是LAG-3的配體，兩者均通過其糖基化位點與LAG-3 結合，阻斷該作用可增強CD8+T 細胞分泌IFN-γ 的能力［35-36］。此外，纖維蛋白原相關蛋白（fibrinogen-related protein，F(xiàn)GL-1）與LAG-3 的D1 和D2 結構域結合，也可作為配體發(fā)揮作用［37］。在流式細胞術分析的膠質瘤樣本中，LAG3 在高達30%的CD8+腫瘤浸潤淋巴細胞中呈陽性，在CD4+細胞中呈低頻率表達［38］。研究發(fā)現(xiàn)，LAG-3 和PD-1 的共同表達標志著T 細胞衰竭和對自身與腫瘤抗原耐受［39］。抗LAG-3 和抗PD-1抗體的共同作用增強了對單一檢查點耐藥腫瘤的清除率，包括膠質母細胞瘤［40-41］。LAG-3 的抗體藥物還未批準上市，目前百時美施貴寶公司研發(fā)的BMS-986016（relatlimab，LAG-3 單抗）與抗PD-1 單抗納武單抗（nivolumab）聯(lián)用，正在進行Ⅰ期臨床試驗（NCT03493932）。

1.5 T細胞免疫球蛋白和ITIM結構域蛋白（TIGIT）

TIGIT 是一種跨膜蛋白，表達于CD8+、CD4+T細胞、Treg和NK細胞上。TIGIT與CD96、CD226形成了類似于CD28/CTLA-4 的通路：CD226 是共刺激受體，而TIGIT 與CD96是共抑制受體，可競爭性結合配體CD155，抑制NK 細胞活性［42］。在幾種荷瘤小鼠模型中，阻斷TIGIT可阻止NK細胞衰竭，還可導致腫瘤特異性T 細胞免疫，增強PD-1 抗體治療，并在腫瘤再攻模型中維持記憶免疫。這表明TIGIT 在NK 細胞中具有重要作用，單獨或聯(lián)合其他檢查點抑制劑是一種可行的抗腫瘤策略［43］。膠質母細胞瘤患者的腫瘤浸潤淋巴細胞上TIGIT 表達升高，提示TIGIT 可能是有價值的治療膠質母細胞瘤的靶點。TIGIT 和PD-1 阻斷劑聯(lián)用可增加小鼠腦膠質瘤模型中細胞毒性CD8+T細胞，減少Treg并提高存活率。與單藥治療組相比，聯(lián)合用藥可以增強效應T細胞功能、抑制腫瘤浸潤樹突狀細胞產(chǎn)生［44］。目前，抗TIGIT的抗體藥物還未批準上市，已申請的臨床實驗也還未應用于腦膠質瘤領域。

1.6 負性協(xié)同共刺激分子B7-H4

B7-H4通過抑制CD4+和CD8+T細胞增殖、細胞因子分泌和細胞周期而負向調控T 細胞的免疫應答，從而介導免疫逃逸［45］。迄今為止，B7-H4 的受體尚未發(fā)現(xiàn)，但有研究表明其受體可能在活化的T細胞上表達；同時B7-H4 以血清可溶性形式存在，在各種腫瘤組織中均有表達，可作為診斷腫瘤的生物標志物，與腫瘤的不良預后及高復發(fā)率密切相關［46］。CD133+細胞是腦膠質瘤的腫瘤干細胞（tumor stem-like cells，TSC），而腫瘤干細胞被認為在腫瘤的更新和對放療與化療的抵抗中起著重要作用。Yao 等［47］發(fā)現(xiàn)了B7-H4 在人原發(fā)性膠質瘤和髓母細胞瘤的腫瘤細胞中均有表達，B7-H4在分選的CD133+細胞中也有表達。另一方面，Yao等［48］又報道了B7-H4 的表達水平與腦膠質瘤的惡性級別正相關，可作為疾病預后不良的潛在預測因子。免疫熒光實驗證實了B7-H4在巨噬細胞/小膠質細胞中表達且主要在腫瘤邊緣上調，可能與腫瘤細胞侵入鄰近腦組織期間逃避免疫監(jiān)視相關。信號傳導與轉錄激活因子3（signal transduction and transcriptional activators 3，STAT3）與B7-H4 上游啟動子位點結合，通過IL-6/Janus 激酶（Janus Kinase，JAK）/STAT3 信號通路上調B7-H4的蛋白表達?？笲7-H4 單抗藥物還未批準上市，目前有兩項Ⅰ期臨床試驗（NCT01878123 和NCT03514121）正在進行，但還未應用于腦膠質瘤疾病。

1.7 T 細胞激活抑制物免疫球蛋白可變區(qū)結構域（VISTA）

VISTA 是2011 年發(fā)現(xiàn)的一種新型免疫檢查點，屬于Ⅰ型跨膜蛋白，其胞外段免疫球蛋白可變區(qū)（immunoglobulin variable region，IgV）結構與PD-1 相似，故又稱PD-1 同源物（PD-1 homolog，PD-1H）［49-50］。VISTA 在CD11b+的髓系細胞系和CD4+、CD8+T 細胞上高表達，在B 細胞上表達較弱［49］。目前，VISTA的配體即VSIG-3（V-Set and Immunoglobulin domain containing 3），又稱免疫球蛋白超家族11（immunoglobulin superfamily member 11，IGSF-11）已被發(fā)現(xiàn)，可以抑制T 細胞增殖和細胞因子的產(chǎn)生［51］；另一方面，有報道VISTA 是P 選擇素糖蛋白配體1（P-selectin glycoprotein ligand-1，PSGL-1）的酸性pH 選擇性配體，免疫反應可通過特定于酸性環(huán)境的檢查點進行調節(jié)［52］。Wang 等［49］發(fā)現(xiàn)了腫瘤細胞上高表達的VISTA 干擾了小鼠體內的抗腫瘤免疫反應，而在多種腫瘤中也發(fā)現(xiàn)了VISTA的高表達［53］。最近一項Meta 分析評估了VISTA 在10 種實體腫瘤中的預后價值，發(fā)現(xiàn)VISTA 的高表達與良好的總生存期以及CD8+腫瘤浸潤淋巴細胞浸潤相關，這表明VISTA 是一種潛在的實體瘤預后的生物標志物［54］。Flies 等［55］在接受放射治療的小鼠腦膠質瘤模型中發(fā)現(xiàn)，VISTA敲除鼠比野生型鼠更能抵抗腫瘤生長，表明VISTA 在治療腦膠質瘤方面有作為免疫調節(jié)靶點的潛力。小膠質細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的髓系細胞，具有與組織巨噬細胞類似的功能，如抗原提呈、吞噬、細胞因子和趨化因子的釋放等。最近研究發(fā)現(xiàn)VISTA 主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的小膠質細胞表達，可能通過促進抗炎細胞因子、免疫抑制分子和血管生成因子的產(chǎn)生而促進膠質母細胞瘤的進展［56］。Liu 等［57］已發(fā)現(xiàn)與VISTA 單敲除小鼠或PD-1 單敲除小鼠相比，雙基因敲除小鼠在受到外來抗原攻擊后T 細胞的反應幅度協(xié)同增加，支持了VISTA 和PD-1通路的非冗余免疫抑制作用。VISTA 和PD-1 的單克隆抗體進行聯(lián)合阻斷治療，獲得了最佳的腫瘤清除治療效果。目前已有抗VISTA 單克隆抗體（JNJ-61610588/CI-8993）的Ⅰ期臨床試驗（NCT02671955），但未應用于腦膠質瘤疾病。

免疫檢查點在腦膠質瘤中的研究見表1，其他檢查點分子如B 和T 淋巴細胞衰減因子（B-and Tlymphocyte attenuator，BTLA）等在腦膠質瘤中的研究還在進行中。

表1 免疫檢查點在腦膠質瘤中的研究

2 免疫檢查點抑制劑在治療腦膠質瘤中的研究

近年來，美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準上市的單克隆抗體在不同的腫瘤中取得了良好的療效（表2），為進行腦膠質瘤治療的臨床試驗提供了合理的依據(jù)。這些臨床試驗檢測免疫檢查點抑制劑作為單藥或聯(lián)合靶向治療、其他免疫治療的療效，主要集中在抗PD-1/PD-L1 和CTLA-4 的單抗研究，但大多正處于Ⅰ期或Ⅱ期臨床研究階段（表3）。

表2 FDA已批準的免疫檢查點抑制劑

表3 免疫檢查點抑制劑在腦膠質瘤中的臨床研究

（續(xù)表）

在一項24 例高級別膠質瘤患者接受抗PD-1單抗派姆單抗（pembrolizumab）治療的實驗中，回顧性評估了其安全性和有效性，其中患者中位無進展生存期（progression free survival，PFS）為1.4個月，中位總生存期（overall survival，OS）為4 個月［58］。另一項Ⅰ期（NCT01375842）臨床實驗中，16 例復發(fā)性膠質母細胞瘤患者經(jīng)過PD-L1 單抗阿特珠單抗（atezolizumab）治療，期間耐受性良好，未報告任何嚴重不良事件［59］。Gorsi 等［60］對10 例復發(fā)性腦膠質瘤兒童使用nivolumab 治療進行了回顧性分析，發(fā)現(xiàn)PD-L1 陽性患者的中位生存期為13.7 周，而PD-L1 陰性患者的中位生存期為4.2 周，提示nivolumab 在兒童腦瘤中的應用對高表達PD-L1 的 患 者更 有效。Carter 等［61］進 行了20 例膠質母細胞瘤患者聯(lián)合使用抗CTLA-4 單抗伊匹單抗（ipilimumab）和抗血管生成藥物貝伐珠單抗（bevacizumab，商品名Avastin）的研究，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥顯示出良好的藥物活性，其毒性遠小于單用ipilimumab所產(chǎn)生的毒性。

然而在已報道的Ⅰ期臨床試驗（NCT02017717）中，Omuro等［62］將40例復發(fā)膠質母細胞瘤患者分為3組，評估nivolumab與ipilimumab單用或聯(lián)用的安全性和耐受性。發(fā)現(xiàn)nivolumab單藥治療耐受性優(yōu)于nivolumab+ipilimumab聯(lián)合用藥，該組合的耐受性受ipilimumab 劑量的影響。但該實驗最終因使用聯(lián)合用藥治療的患者產(chǎn)生的藥物不良反應較為嚴重，40%的患者不能耐受治療而被迫中止。在代號為Checkmate-143 的Ⅲ期臨床試驗中，進行了nivolumab 和bevacizumab 單藥治療復發(fā)性膠質母細胞瘤的效果和安全性評估，共納入患者369 人，這是首次對PD-1 抑制劑進行的大型隨機臨床試驗［63］。然而，2017年公布的初步結果顯示，先前接受化療和放療的復發(fā)性膠質母細胞瘤患者用nivolumab 單藥的治療效果與bevacizumab 相比，并沒有顯著改善患者預后。治療失敗的原因可能是由于放療引起的淋巴細胞減少，使得患者對PD-1的 應 答 率 較 低［64］。最 近 研 究 發(fā) 現(xiàn)nivolumab 和bevacizumab 的安全性一致，但聯(lián)合用藥并未改善患者總生存期。與此同時，兩個大型Ⅲ期隨機試驗（NCT02617589 和NCT02667587）正 在 測 試nivolumab對甲基鳥嘌呤甲基轉移酶（methylguanine methyltransferase，MGMT）甲基化或非甲基化膠質母細胞瘤患者的療效，該類患者可能從免疫檢查點抑制劑中獲益［65］。

3 展 望

免疫療法是腫瘤治療策略中的重要組成部分，其中免疫檢查點抑制劑在多種實體瘤治療中取得了重大突破。雖然與傳統(tǒng)的抗腫瘤藥物相比，免疫檢查點抑制劑不殺傷正常組織細胞，不良反應有了大幅度降低，但患者應答率相對較低，在膠質母細胞瘤中尤其如此。膠質母細胞瘤在腫瘤微環(huán)境中免疫抑制程度較高，同時免疫檢查點阻斷的理想治療效果得益于患者高突變負荷，探索與免疫應答相關的候選靶點可能為提高免疫檢查點阻斷的臨床療效提供新的策略。

目前，免疫檢查點阻斷治療腦膠質瘤的研究尚處于起步階段。單藥免疫檢查點抑制劑治療腦膠質瘤患者效果不佳，而將此療法與其他療法聯(lián)合運用又帶來嚴重的不良反應事件。如何在腦膠質瘤的治療中，將檢查點抑制劑與當前的放療、替莫唑胺、bevacizumab 等的治療標準相結合，這些藥物的使用是否與積極或消極的相互作用相關，以及如何應對聯(lián)合治療引起的不良事件等問題還需研究解決。