抗炎三肽KdPT對(duì)小鼠眼干燥癥的治療作用

王 華，許元生，宋 燕

（廣州領(lǐng)晟醫(yī)療科技有限公司，廣州510663）

眼干燥癥是由于淚液的量或質(zhì)或流體動(dòng)力學(xué)異常引起的淚膜不穩(wěn)定和（或）眼表損害，從而導(dǎo)致眼不適癥狀及視功能障礙的一類疾病。目前世界范圍內(nèi)眼干燥癥發(fā)病率為5.5%～33.7%，我國眼干燥癥的發(fā)病率為21%～30%［1］。

研究表明，炎癥是眼干燥癥發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，抗炎已經(jīng)成為治療眼干燥癥（特別是中重度眼干燥癥）的重要手段［2-4］。目前治療眼干燥癥常用的抗炎藥物主要有糖皮質(zhì)激素類或環(huán)孢菌素A 滴眼液等，然而長(zhǎng)期使用糖皮質(zhì)激素有升高眼壓［5］、存在誘發(fā)青光眼及白內(nèi)障的潛在風(fēng)險(xiǎn)，而環(huán)孢素滴眼液則具有刺激性強(qiáng)的缺點(diǎn)［6］，因此，開發(fā)新的安全有效的治療眼干燥癥的局部抗炎藥物具有重要的臨床意義。

KdPT（Lys-D-Pro-Thr）是一種衍生自α-促黑色素細(xì)胞激素（α-melanocyte-stimulating hormone，α-MSH）的抗炎三肽，具有多重抗炎活性。有文獻(xiàn)報(bào)道，α-MSH 可以用于治療眼干燥癥和修復(fù)角膜損傷［7-9］，但目前尚未有KdPT 對(duì)眼干燥癥的治療作用的報(bào)道，本研究通過建立苯扎氯銨誘導(dǎo)小鼠眼干燥癥模型，考察了KdPT 對(duì)眼干燥癥的治療作用，為新型眼干燥癥治療藥物的開發(fā)提供數(shù)據(jù)支持。

1 材 料

1.1 試 劑

KdPT（純度大于98%，批號(hào)：C613160802-YJ1，深圳市健元醫(yī)藥科技有限公司）；人工淚液滴眼液、熒光素鈉滴眼液（中山大學(xué)附屬眼科醫(yī)院）；淚液檢測(cè)酚紅棉線（天津晶明新技術(shù)開發(fā)有限公司）；苯扎氯銨（批號(hào)：BCBX5919，美國Sigma 公司）；其他試劑均為市售分析純。

1.2 儀 器

蘭羚KJ5D 裂隙燈（蘇州康捷醫(yī)療股份有限公司）；JB-P5 包埋機(jī)、JB-L5 凍臺(tái)（武漢俊杰電子有限公司）；RM2016 病理切片機(jī)（上海徠卡儀器有限公司）；KD-P 組織攤片機(jī)（浙江科迪儀器設(shè)備有限公司）；E100 顯微鏡、DS-U3 成像系統(tǒng)（日本尼康公司）。

1.3 動(dòng) 物

SPF 級(jí)BALB/c 小鼠（7 周齡，15～17 g）120 只，雄性，購自中山大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)為：44007200064321，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（粵）2010-0102，在溫度20 ℃～25 ℃和濕度50%～70%進(jìn)行12 h 光/暗循環(huán)飼養(yǎng)。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均符合動(dòng)物倫理委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)。

2 方 法

2.1 小鼠眼干燥癥模型的構(gòu)建及分組給藥

SPF級(jí)BALB/c小鼠120 只，雄性，適應(yīng)1周后，造模動(dòng)物右眼滴入0.2%苯扎氯銨溶液5 μL，每天2 次，持續(xù)4 周，誘導(dǎo)小鼠蒸發(fā)過快型眼干燥癥模型。正常對(duì)照組給予生理鹽水，其他操作均相同。造模4周后進(jìn)行熒光素鈉染色，按熒光素鈉染色評(píng)分隨機(jī)分為6 組：正常對(duì)照組（以生理鹽水造模）、模型對(duì)照組、KdPT 低、中、高劑量組、人工淚液組，每組10只動(dòng)物，分別滴眼給予相應(yīng)藥物處理（正常對(duì)照組和模型對(duì)照組給予生理鹽水，KdPT 低、中、高劑量組分別給予1、10、100 μg/mL 的KdPT，陽性對(duì)照組給予人工淚液），給藥體積為每眼5 μL，每日2次。

2.2 角膜熒光素鈉染色

分別于給藥3、5、7、10、14 d 后在裂隙燈鈷藍(lán)光下觀察并記錄小鼠眼表形態(tài)，同時(shí)進(jìn)行熒光素鈉染色評(píng)分。熒光素鈉染色方法為：吸取1%熒光素鈉溶液5 μL 滴至小鼠眼表，并閉合眼瞼使熒光素鈉均勻涂布于角膜表面，90 s 后用生理鹽水200 μL 沖洗3 次，棉簽輕輕吸取眼睛周圍液體后，用裂隙燈顯微鏡鈷藍(lán)光下觀察角膜上皮熒光素鈉染色情況。將眼表分為4個(gè)象限，并對(duì)每個(gè)象限進(jìn)行評(píng)分，評(píng)分分為4 個(gè)等級(jí)：無染色為0 分；輕微的點(diǎn)狀染色為0.5 分；彌漫的點(diǎn)狀染色為1 分；覆蓋少于1/3 角膜的彌漫染色為2 分；覆蓋1/3 至2/3 角膜的彌漫染色為3 分；覆蓋超過2/3 角膜的彌漫染色為4 分，4 個(gè)象限總分為12 分，得分越高表示眼干燥癥越嚴(yán)重。

2.3 酚紅棉線

給藥治療14 d 后，麻醉并固定小鼠，用顯微結(jié)膜鑷輕拉小鼠下眼瞼暴露下結(jié)膜囊，將酚紅棉線一端置于下瞼內(nèi)側(cè)結(jié)膜囊內(nèi)60 s后取出，測(cè)量被淚液浸濕的酚紅棉線紅色部分總長(zhǎng)度。

2.4 組織病理分析

給藥治療14 d 后，將小鼠麻醉后處死，迅速取下包括上下眼瞼在內(nèi)的整個(gè)眼球，眼球固定液固定并染色，制作病理切片，光學(xué)顯微鏡下觀察角膜組織的病理學(xué)變化。

2.5 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)由GraphPad Prism 7.0 生物統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：計(jì)量數(shù)據(jù)以表示，采用Two-Way ANOVA 結(jié)合Dunnett′s 多重比較法進(jìn)行分析；采用方差分析結(jié)合Dunnett′s 多重比較法進(jìn)行分析；計(jì)數(shù)資料采用Kruskal-Wallis 秩和檢驗(yàn)進(jìn)行分析；采用One-Way ANOVA 結(jié)合Dunnett′s多重比較法進(jìn)行分析。

3 結(jié) 果

3.1 一般狀態(tài)觀察與體重

各組小鼠一般狀態(tài)均無明顯異常，與模型對(duì)照組相比，各治療組小鼠體重均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P ＞0.05）。

3.2 角膜熒光素鈉染色評(píng)分

治療7、14 d 后，與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組熒光素鈉染色評(píng)分顯著升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P ＜0.01），說明造模成功；與模型對(duì)照組相比，各治療組的熒光素鈉評(píng)分均有不同程度的降低，其中以KdPT 高劑量組和陽性對(duì)照組最為明顯，且有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P ＜0.01），見圖1和圖2。

Figure 1 Corneal fluorescent staining scores of each treatment group(n = 10)

Figure 2 Corneal fluorescein sodium staining of model control group(A)and 100 μg/mL KdPT group(B)

3.3 淚液分泌量測(cè)定

與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組小鼠酚紅棉線長(zhǎng)度明顯縮短，淚液分泌量明顯降低（P ＜0.01），說明造模成功；與模型對(duì)照組相比，KdPT各治療組和陽性對(duì)照組均可增加酚紅棉線長(zhǎng)度，促進(jìn)淚液分泌，且KdPT 中劑量組、高劑量組、陽性對(duì)照組有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P ＜0.01），見圖3。

Figure 3 Lacrimal secretion of each treatment group(,n = 10)

3.4 病理學(xué)變化

與模型對(duì)照組相比，各治療組的病理評(píng)分均有不同程度的降低，其中以KdPT 高劑量組（100 μg/mL）、陽性對(duì)照組最為明顯，且有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P ＜0.01），見圖4。組織病理結(jié)果顯示，模型對(duì)照組角膜上皮厚度不均勻，局部變窄，并出現(xiàn)裂隙，基質(zhì)重度腫脹，表現(xiàn)為裂隙擴(kuò)張。KdPT 治療明顯改善眼干燥癥小鼠的角膜組織病理評(píng)分，特別是高劑量組角膜上皮厚度均勻，細(xì)胞形態(tài)正常，無角質(zhì)，基質(zhì)厚度均勻，無血管、無炎癥，見圖5，提示KdPT治療明顯修復(fù)了受損的角膜上皮。

Figure 4 Corneal histopathological score of each treatment groups,n = 10)

Figure 5 Corneal histopathology of model control group and 100 μg/mL KdPT group

4 討 論

KdPT 為衍生自促黑激素α-MSH 的抗炎三肽，具有多重抗炎活性，對(duì)多種炎癥性疾病有良好的治療作用。文獻(xiàn)報(bào)道，KdPT 對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎［10-11］、鼻炎［12］、銀屑?。?3］等疾病有明顯的治療作用，目前KdPT治療潰瘍性結(jié)腸炎的研究在國外已進(jìn)入臨床Ⅱ期，在國內(nèi)進(jìn)入臨床Ⅰ期（國內(nèi)代號(hào)為L(zhǎng)H025，由廣州領(lǐng)晟醫(yī)療科技有限公司開發(fā)），具有良好的開發(fā)前景。本研究通過建立苯扎氯銨誘導(dǎo)小鼠眼干燥癥模型，考察了KdPT 對(duì)眼干燥癥的治療作用，研究結(jié)果表明，KdPT治療可促進(jìn)淚液分泌，修復(fù)受損的角膜上皮，對(duì)小鼠眼干燥癥具有明顯的治療作用，有可能開發(fā)為眼干燥癥的新型治療藥物。本研究為KdPT 開展眼干燥癥的臨床開發(fā)提供了數(shù)據(jù)支持，增加了藥物潛在的適應(yīng)證，具有重要的研究?jī)r(jià)值。

炎癥是眼干燥癥發(fā)病的關(guān)鍵因素［3］，IL-1R 是參與眼干燥癥發(fā)生的重要受體［14-16］，KdPT 是IL-1R的抑制劑，能夠阻斷多種炎癥因子（如IL-1β 等）與IL-1R 的結(jié)合，從而阻斷炎癥通路，這可能是KdPT能夠治療眼干燥癥的作用機(jī)制之一。

本研究首次證實(shí)了KdPT 三肽對(duì)蒸發(fā)過強(qiáng)型小鼠眼干燥癥模型具有顯著的治療作用，后續(xù)研究中將考察KdPT 對(duì)其他眼干燥癥模型的有效性和安全性，同時(shí)對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行更加深入地研究，為KdPT 用于眼干燥癥治療的臨床開發(fā)積累更多的數(shù)據(jù)。