他唑巴坦雜質(zhì)A國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制

肖 亭，王 晨，田 冶，張 夏，劉 穎，馬步芳，劉書(shū)妤，姚尚辰*，馮艷春**

（1中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京102629；2上海工程技術(shù)大學(xué)，上海201620）

國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)系指供國(guó)家法定藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥品的物理、化學(xué)及生物學(xué)等測(cè)試用，具有確定的特性或量值，用于校準(zhǔn)設(shè)備、評(píng)價(jià)測(cè)量方法、給供試藥品賦值或鑒別用的物質(zhì)，應(yīng)具備穩(wěn)定性、均勻性和準(zhǔn)確性［1］。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備是藥品質(zhì)量研究中最重要的一環(huán)。近年來(lái)，隨著公眾健康安全意識(shí)和分析技術(shù)手段的不斷提高，標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)于雜質(zhì)的定向控制也越來(lái)越細(xì)化。使用雜質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對(duì)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中要求的雜質(zhì)進(jìn)行定性和定量的控制是最理想的雜質(zhì)控制方法。因此無(wú)論從監(jiān)管理念的轉(zhuǎn)變、藥品質(zhì)量的提升還是市場(chǎng)需求等多個(gè)角度，雜質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制逐漸成為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制的發(fā)展方向［2］。

目前在各國(guó)藥典中，仍有很多采用原位降解技術(shù)［3］或利用相對(duì)保留時(shí)間定位來(lái)進(jìn)行某些雜質(zhì)的控制或用于檢查方法的系統(tǒng)適用性。但原位降解技術(shù)過(guò)程繁瑣、產(chǎn)生雜質(zhì)有限且重現(xiàn)性較差，不同實(shí)驗(yàn)室由于實(shí)驗(yàn)條件的差異可能造成色譜峰相對(duì)保留時(shí)間的改變［4］，使得許多藥典方法在執(zhí)行過(guò)程中遇到困難。因此，在條件許可的情況下逐漸將原位降解技術(shù)產(chǎn)生的雜質(zhì)逐一研制成雜質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或者進(jìn)行混合雜質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制［5］成為藥典標(biāo)準(zhǔn)修訂中一項(xiàng)重要的工作。

他唑巴坦（tazobactam）是從舒巴坦的衍生物中篩選出來(lái)的一種β-內(nèi)酰胺酶抑制劑。它可以與數(shù)種β-內(nèi)酰胺類抗生素產(chǎn)生協(xié)同作用，增加了β-內(nèi)酰胺類抗生素的抗菌活性并擴(kuò)大了其抗菌譜［6］。因此《中華人民共和國(guó)藥典》（以下簡(jiǎn)稱“中國(guó)藥典”）自2010 版收錄了該品種原料的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，其中有關(guān)物質(zhì)檢查項(xiàng)和含量測(cè)定項(xiàng)都使用了他唑巴坦的氫氧化鈉降解溶液作為系統(tǒng)適用性溶液，使用降解產(chǎn)生的雜質(zhì)來(lái)判斷系統(tǒng)的分離效果，該方法一直沿用至今。本研究以中國(guó)藥典（2015 年版）二部中他唑巴坦原料藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為例，介紹如何鑒定其含量測(cè)定和有關(guān)物質(zhì)檢查方法中通過(guò)原位降解技術(shù)獲得的系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液中的主要雜質(zhì)，并按照雜質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制的一般流程［7］，將其合成并研制成為國(guó)家雜質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。

1 材 料

1.1 樣品與試劑

他唑巴坦雜質(zhì)A 原料（100 g，色譜純度98%，河北桑迪亞醫(yī)藥技術(shù)有限責(zé)任公司）；他唑巴坦對(duì)照品（99.5%，批號(hào)130511-201904，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；他唑巴坦雜質(zhì)A 對(duì)照品（定性使用，R089H0，美國(guó)藥典委員會(huì)）；乙腈、甲醇（色譜純，美國(guó)Fisher公司），其他試劑均為市售分析純，水為超純水。

1.2 儀 器

Waters 2695 Alliance 液相色譜儀（美國(guó)Waters公司）；QTrap6500 質(zhì)譜儀（美國(guó)Sciex 公司）；FT-IR EQUINOX 55 型紅外光譜儀、Ascend 500 核磁共振儀（德國(guó)Bruker 公司）；V20 型水分滴定儀（美國(guó)Mettler 公司）；FO410C 型馬弗爐（日本Yamato公司）。

2 方 法

2.1 中國(guó)藥典（2015 年版）他唑巴坦原料藥有關(guān)物質(zhì)檢查方法系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液中最大雜質(zhì)的鑒別

根據(jù)中國(guó)藥典（2015 年版）二部中他唑巴坦原料藥有關(guān)物質(zhì)檢查方法所描述的原位降解方法制備系統(tǒng)適用性溶液：取他唑巴坦對(duì)照品約25 mg至25 mL 量瓶中，加0.01 mol/L 氫氧化鈉溶液10 mL，30 ℃放置30 min，用0.01 mol/L 鹽酸溶液中和后，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，用磷酸調(diào)節(jié)pH 至4.0，按照含量測(cè)定色譜條件要求［色譜柱：Dikma，Inertsil ODS-2（4.6 mm × 250 mm，5 μm）；C/N 5020-01128；S/N 8AS11013；流 動(dòng) 相：乙 腈-0.03 mol/L 磷酸二氫鉀溶液-10%四丁基氫氧化銨溶液（190∶795∶15）（用磷酸調(diào)節(jié)pH 至4.0）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm，進(jìn)樣20 μL，進(jìn)行HPLC色譜分析，觀察產(chǎn)生的主要雜質(zhì)。

根據(jù)產(chǎn)生的主要雜質(zhì)，采用液相質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測(cè)定雜質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量，推測(cè)其可能的結(jié)構(gòu)。25 mL 量瓶?jī)?nèi)他唑巴坦的堿降解溶液用鹽酸溶液中和后，用乙腈-水（1∶5）的溶液稀釋至刻度。設(shè)計(jì)的色譜條件如下。色譜柱：Capcell PAK C18TYPE MGⅡ（4.6 mm×150 mm，5 μm）；檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm；流動(dòng)相A 相：0.1%甲酸水溶液，B 相：乙腈；流速：0.5 mL/min；梯度洗脫：0～0.01 min（95∶5）；0.01～5.00 min（95∶5）；5.00～17.00 min（38∶62）；17.00～17.10 min（95∶5）；17.10～22.00 min（95∶5）。

質(zhì)譜儀型號(hào)為6500QTrap；工作站為Analyst?軟件（Ver.1.6.2）。離子源：ESI，正離子模式。一級(jí)質(zhì)譜圖（Q1 scan）掃描的質(zhì)量范圍是50～500。對(duì)準(zhǔn)分子離子母離子進(jìn)行Enhanced Product Ion（EPI）掃描，得到二級(jí)質(zhì)譜圖。

2.2 雜質(zhì)的合成

根據(jù)確定的結(jié)構(gòu)式，設(shè)計(jì)合成路線進(jìn)行主要雜質(zhì)的合成。

2.3 雜質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制

2.3.1 結(jié)構(gòu)分析

（1）質(zhì)譜分析 取他唑巴坦雜質(zhì)A 原料適量，以乙腈-水（1∶5）為溶劑溶解并稀釋成約0.5 mg/mL的溶液，用于質(zhì)譜分析。質(zhì)譜儀型號(hào)為6500QTrap；工作站為Analyst?軟件。離子源：ESI，正離子模式。一級(jí)質(zhì)譜圖（Q1 scan）掃描的質(zhì)量范圍是50～500。對(duì)準(zhǔn)分子離子母離子進(jìn)行EPI 掃描，得到二級(jí)質(zhì)譜圖。根據(jù)準(zhǔn)分子離子峰［M+H］+判斷相對(duì)分子質(zhì)量。

（2）紅外分析 取他唑巴坦雜質(zhì)A 原料約1 mg，置瑪瑙研缽中與約干燥KBr 200 mg混合，緩緩研磨至細(xì)，壓片。采用紅外光譜儀測(cè)定各雜質(zhì)的紅外光譜，工作站為OPUS 光譜分析軟件（Ver.5.5）。

（3）核磁共振波譜分析 取他唑巴坦雜質(zhì)A約10 mg置于石英核磁管中，用D2O 0.5 mL為溶劑溶解，作為供試品溶液。采用配有CryoProbe Progdigy探頭的核磁共振儀對(duì)雜質(zhì)原料分別做1H NMR譜、13C NMR 譜、DEPT 90°譜、DEPT 135°譜、1H-1H COSY譜、HSQC譜和HMBC譜。

2.3.2 均勻性分析 從制備的2 900 瓶樣品中隨機(jī)抽取12 瓶樣品，每瓶稱取2 份，每份質(zhì)量約為10 mg，采用純度分析的液相色譜條件，以峰面積與對(duì)應(yīng)稱樣量之比為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)瓶間方差和瓶?jī)?nèi)方差的比較以判斷樣品的均勻性。如果兩者之比小于95%置信水平對(duì)應(yīng)F檢驗(yàn)的臨界值，則認(rèn)為樣品是均勻的。

2.3.3 穩(wěn)定性分析 考察樣品在實(shí)驗(yàn)色譜條件下溶液的穩(wěn)定性，為確定樣品的具體實(shí)驗(yàn)方案提供依據(jù)。目前標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)原料短期穩(wěn)定性考察主要是為樣品選擇合適的運(yùn)輸條件提供依據(jù)，為節(jié)約運(yùn)輸成本，首先考察了樣品在常溫（25 ℃）條件下0、3、5和10 d的穩(wěn)定性，每個(gè)實(shí)驗(yàn)條件考察3支獨(dú)立樣品。

2.3.4 對(duì)照品賦值分析

（1）純度分析 目前美國(guó)藥典（USP41-NF36）、中國(guó)藥典二部（2015 年版）和日本藥典（JP17）均收載了他唑巴坦原料的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，USP 與JP 色譜條件基本一致。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)他唑巴坦雜質(zhì)A 在酸性溶液中不穩(wěn)定，容易降解，而中國(guó)藥典和美國(guó)藥典他唑巴坦有關(guān)物質(zhì)檢查方法中流動(dòng)相和樣品溶劑均偏酸性，因此在其純度分析時(shí)未采用上述藥典方法，而是參考文獻(xiàn)［8］，最終采用10 mmol/L 醋酸銨水溶液-乙腈（98∶2）為流動(dòng)相和溶劑，色譜柱采用DIKMA，Inertsil ODS-2（4.6 mm×250 mm，5 μm）。采用Waters 2695 Alliance液相色譜儀。

（2）水分分析 精密稱取雜質(zhì)原料約30 mg，采用滴定儀，按中國(guó)藥典四部（2015 年版）通則0832 水分測(cè)定法第一法（費(fèi)休氏法）測(cè)定雜質(zhì)的水分含量，溶劑為甲醇。

（3）無(wú)機(jī)雜質(zhì)分析 熾灼殘?jiān)糠从硺悠分袩o(wú)機(jī)雜質(zhì)的量，采用中國(guó)藥典四部（2015 年版）通則0841熾灼殘?jiān)鼨z查法測(cè)定。

（4）對(duì)照品賦值 采用質(zhì)量平衡法對(duì)對(duì)照品進(jìn)行賦值。質(zhì)量平衡法，即測(cè)得的活性成分的含量加上有機(jī)雜質(zhì)、水分、殘留溶劑、無(wú)機(jī)雜質(zhì)的含量之和應(yīng)為100%。計(jì)算公式：含量（%）=（1-有機(jī)雜質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)）×（1-水的質(zhì)量分?jǐn)?shù)-揮發(fā)性物質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)-無(wú)機(jī)雜質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)）×100。

采用zg30 脈沖序列測(cè)定樣品溶液的1H NMR圖譜，測(cè)定溫度298 K，觀測(cè)頻率400.13 MHz，90°脈沖寬度11.07 μs，掃描次數(shù)16 次，延遲時(shí)間10 s。以樣品化學(xué)位移δ=7.794的信號(hào)鋒為定量峰，順丁烯二酸為內(nèi)標(biāo)（δ=5.907），測(cè)定待測(cè)物的含量，對(duì)質(zhì)量平衡法測(cè)定結(jié)果進(jìn)行確證。

3 結(jié) 果

3.1 中國(guó)藥典（2015 年版）他唑巴坦原料藥有關(guān)物質(zhì)檢查方法系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液中最大雜質(zhì)的鑒別

按照中國(guó)藥典二部中他唑巴坦原料藥有關(guān)物質(zhì)檢查方法規(guī)定的原位降解要求，制備系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液，其色譜圖如圖1所示。在相對(duì)他唑巴坦峰保留時(shí)間0.4左右的位置出現(xiàn)一個(gè)較大雜質(zhì)，目前中國(guó)藥典標(biāo)準(zhǔn)要求他唑巴坦峰與其之間的分離度應(yīng)不小于10。文獻(xiàn)［9］記載他唑巴坦在體內(nèi)會(huì)部分代謝為一種沒(méi)有活性的產(chǎn)物，結(jié)構(gòu)如圖2，該代謝產(chǎn)物也可以通過(guò)NaOH 水溶液降解產(chǎn)生，另外他唑巴坦粉末或者凍干粉末也會(huì)熱降解產(chǎn)生該雜質(zhì)［10］。經(jīng)檢索，USP41 已經(jīng)收載了該雜質(zhì)，命名為他唑巴坦有關(guān)物質(zhì)A（tazobactam related compound A，分子式：C7H12N4O4S；CAS：118175-11-4）。由此推測(cè)，中國(guó)藥典（2015 年版）中他唑巴坦有關(guān)物質(zhì)系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液所產(chǎn)生的最大雜質(zhì)可能為USP41 收錄的他唑巴坦有關(guān)物質(zhì)A。于是購(gòu)買USP該對(duì)照品進(jìn)行確認(rèn)，經(jīng)比對(duì)發(fā)現(xiàn)最大雜質(zhì)與他唑巴坦有關(guān)物質(zhì)A 有相同的紫外末端吸收、HPLC保留時(shí)間基本一致，質(zhì)譜數(shù)據(jù)顯示兩者均出現(xiàn)249的［M+H］+峰，初步確認(rèn)兩者為同一物質(zhì)。

3.2 最大雜質(zhì)原料的合成

根據(jù)文獻(xiàn)［8］記載的方法，按路線1 合成他唑巴坦雜質(zhì)A原料100 g，純度大于98%。

3.3 他唑巴坦雜質(zhì)A結(jié)構(gòu)確證

分別采用紅外、質(zhì)譜和核磁共振波譜對(duì)合成的他唑巴坦雜質(zhì)A的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了確證。

Figure 1 Chromatogram of the system applicability solution under the inspection item of tazobactam API related substances in Part 2 of Chinese Pharmacopoeia 2015

Figure 2 Structure of tazobactam impurity A

Scheme 1 Synthetic route of tazobactam impurity A

3.3.1 質(zhì)譜推斷 合成的他唑巴坦雜質(zhì)A 原料電噴霧電離質(zhì)譜（ESI-MS）顯示他唑巴坦雜質(zhì)A 與H+形成準(zhǔn)分子離子［M+H］+，質(zhì)荷比（m/z）為249.0，與其理論相對(duì)分子質(zhì)量248.1相符合。

3.3.2 紅外確證 紅外光譜（圖3）顯示，合成的他唑巴坦雜質(zhì)A 原料與USP 他唑巴坦有關(guān)物質(zhì)A標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)紅外圖譜基本一致。

3.3.3 核磁共振波譜確證 通過(guò)核磁共振波譜進(jìn)一步確證合成的他唑巴坦雜質(zhì)A 原料的結(jié)構(gòu)。他唑巴坦雜質(zhì)A 原料的氫譜、1H-1H COSY 譜、碳譜、DEPT（90°/135°）譜和HMBC 譜數(shù)據(jù)及解析詳見(jiàn)表1 和表2。他唑巴坦雜質(zhì)A 原料氫譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［11］報(bào)道基本一致。通過(guò)解析可知，他唑巴坦雜質(zhì)A 原料1H NMR 譜和13C NMR 譜中各峰的化學(xué)位移值與其化學(xué)結(jié)構(gòu)式：（2S，3S）-2-氨基-3-甲基-3-亞磺酸基-4-（1H-1，2，3-三氮唑-1-基）-丁酸相吻合，所有峰均能在結(jié)構(gòu)式中找到明確合理的指認(rèn)，與USP 他唑巴坦有關(guān)物質(zhì)A 對(duì)照品基本一致。

Figure 3 Infrared absorption spectrum of tazobactam impurity A and tazobactam related compound A contained in USP

Table 1 1H NMR(D2O)data analysis for tazobactam impurity A

Table 2 13C NMR(D2O)data analysis for tazobactam impurity A

3.4 他唑巴坦雜質(zhì)A原料均勻性和穩(wěn)定性分析

對(duì)均勻性評(píng)價(jià)指標(biāo)——24 份峰面積與對(duì)應(yīng)稱樣量之比做F檢驗(yàn)，在95%置信范圍內(nèi)，瓶間和瓶?jī)?nèi)F為0.61，小于F0.05（11，12）（2.79），證明瓶間與瓶?jī)?nèi)不存在顯著性差異，該原料的均勻性良好。

實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，采用中國(guó)藥典二部（2015 年版）他唑巴坦原料有關(guān)物質(zhì)檢查的色譜條件，平行實(shí)驗(yàn)5份樣品，他唑巴坦雜質(zhì)A 面積歸一化純度均值僅為88.1%（RSD=1.96%），與合成公司交付色譜純度（＞98%）存在較大差異，懷疑樣品發(fā)生降解。于是結(jié)合文獻(xiàn)［8］重新摸索樣品色譜純度測(cè)定條件，最終采用10 mmol/L醋酸銨水溶液-乙腈（98∶2）為流動(dòng)相和溶劑，等度洗脫，230 nm 為檢測(cè)波長(zhǎng)，測(cè)定不同穩(wěn)定性考察的樣品。以他唑巴坦雜質(zhì)A面積歸一化純度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，觀察不同時(shí)間結(jié)果的變化趨勢(shì)。結(jié)果顯示同一樣品溶液在8 h 內(nèi)的5 次進(jìn)樣，230 nm 處結(jié)果面積歸一化純度均值為99.1%（RSD=0.14%），且在紫外全波長(zhǎng)范圍內(nèi)210～400 nm 未檢出明顯雜質(zhì)峰，證明樣品在該溶液中穩(wěn)定。短期穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示他唑巴坦雜質(zhì)A 面積歸一化純度在0、3、5 和10 d 的均值均為99.1%，未發(fā)現(xiàn)降解趨勢(shì)，證明樣品在室溫下10 d內(nèi)穩(wěn)定。對(duì)于樣品的長(zhǎng)期穩(wěn)定性數(shù)據(jù)需要根據(jù)保存時(shí)間逐步考察并補(bǔ)充完善。

3.5 他唑巴坦雜質(zhì)A原料賦值

采用質(zhì)量平衡法計(jì)算他唑巴坦雜質(zhì)A 原料的含量。首先需要進(jìn)行純度分析，確定所含有機(jī)雜質(zhì)的多少。另外還需要分別確定水分、殘留溶劑和無(wú)機(jī)雜質(zhì)。根據(jù)原料的合成路線排除了殘留有機(jī)溶劑的可能，因此僅使用殘留溶劑數(shù)據(jù)庫(kù)［11］對(duì)未知有機(jī)溶劑進(jìn)行初篩，未檢測(cè)到任何影響定量的有機(jī)溶劑峰。最后由有機(jī)雜質(zhì)0.90%、水分1.24%和無(wú)機(jī)雜質(zhì)（熾灼殘?jiān)?.25%，計(jì)算出他唑巴坦雜質(zhì)A原料的含量為97.6%，與核磁共振波譜定量結(jié)果97.1%基本一致。

4 結(jié) 論

本研究對(duì)中國(guó)藥典（2015 年版）他唑巴坦質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中含量和有關(guān)物質(zhì)檢查項(xiàng)使用的原位降解方法得到的系統(tǒng)適用性溶液進(jìn)行成分分析，確定了其中主要雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)，并根據(jù)結(jié)構(gòu)合成制備了該雜質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，若使用該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與他唑巴坦直接配置系統(tǒng)適用性溶液將使得標(biāo)準(zhǔn)操作更加簡(jiǎn)便易行，同時(shí)文獻(xiàn)也檢索到該雜質(zhì)為他唑巴坦的降解產(chǎn)物，實(shí)驗(yàn)證明其在酸性環(huán)境下不穩(wěn)定，則該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制也為下一步提高他唑巴坦質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)奠定了基礎(chǔ)。