• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    注射用鹽酸米諾環(huán)素微球貯庫的制備及其性能研究

    2021-03-13 06:53:50程玉婷吳小紅
    中國藥科大學(xué)學(xué)報 2021年1期
    關(guān)鍵詞:米諾環(huán)素微球

    張 婷,廖 航,程玉婷,吳小紅*

    (1重慶醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院,重慶401147;2口腔疾病與生物醫(yī)學(xué)重慶市重點(diǎn)實驗室,重慶401147;3重慶市高校市級口腔生物醫(yī)學(xué)工程重點(diǎn)實驗室,重慶401147)

    慢性牙周炎是最常見的口腔疾病之一,其導(dǎo)致的持續(xù)牙槽骨丟失將引起牙齒松動[1]。鹽酸米諾環(huán)素(minocycline hydrochloride ,MH)是一種廣譜的四環(huán)素類抗生素,用于對抗引起周期性炎癥的大多數(shù)細(xì)菌[2]。除了抗菌活性外,鹽酸米諾環(huán)素已被證明可以抑制骨吸收和促進(jìn)骨形成[3]。研究表明這種抗生素質(zhì)量濃度為1 mg/mL,即血漿中的標(biāo)準(zhǔn)治療濃度,顯著增加了人類骨髓成骨細(xì)胞的增殖[4]。但是,Almazin 等[5]發(fā)現(xiàn)牙周袋中高濃度的抗生素可能直接或間接影響支持性牙周組織的活細(xì)胞,尤其是骨形成的成骨細(xì)胞。此外,高水平的鹽酸米諾環(huán)素會對細(xì)胞產(chǎn)生劑量依賴性的毒性作用,抑制成骨細(xì)胞的增殖和分化[4]。前期課題組也研究表明一定濃度的米諾環(huán)素可以促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖,而隨著濃度的增加這種促增殖作用開始下降[6]。因此,為了避免局部高濃度的抗生素,亞抗菌劑量的鹽酸米諾環(huán)素及其局部釋放的有效性成為最近研究的焦點(diǎn)[7]。前期本課題組制備鹽酸米諾環(huán)素PLGA 纖維膜改善米諾環(huán)素突釋,從而使其在抑菌的同時能促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖,但它第1 天的釋放仍約為20%[8]。

    蔗糖醋酸鹽異丁酸酯(sucrose acetate isobutyrate,SAIB)貯庫是一種很有前景的注射型緩釋系統(tǒng)[9],具有生物降解性和生物相容性[10],并且加入少量的溶劑(如乙醇),便可以顯著降低SAIB 的黏度。當(dāng)貯庫被輸送到體內(nèi)時,隨著溶劑從貯庫擴(kuò)散到周圍組織,從而緩慢釋放藥物,它就從液態(tài)變成了半固態(tài)。但是當(dāng)溶解在溶劑中的藥物濃度過高時,也可能出現(xiàn)初始的突釋[11]。Lin等[12]將PLGA微球與SAIB 貯庫相結(jié)合可將利培酮在第1 天的釋放降低到0.64%,前期本研究將PCL 微球與SAIB貯庫結(jié)合可將柚皮苷在第1 天的釋放降低到6.3%[13]。微球作為最常用的藥物遞送系統(tǒng)之一,制備它的方法有很多,其中靜電噴霧具有許多優(yōu)點(diǎn),如改善均勻性或單分散性、減少團(tuán)聚、高封裝效率和制備簡單[14-15]。PLGA是一種可生物降解的聚合物,應(yīng)用廣泛,具有良好的生物相容性和生物降解性,并且它有可能精確控制藥物釋放數(shù)天到數(shù)月的動力學(xué)過程[16-18]。因此,本研究旨在制備負(fù)載鹽酸米諾環(huán)素的PLGA 電噴微球,并分析其形態(tài)、表面潤濕性、藥物釋放及其降解等性質(zhì),并將微球與SAIB結(jié)合,以期獲得更好的緩釋作用。

    1 材 料

    1.1 原料與試劑

    聚乳酸-羥基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycolic acid),PLGA,n(LA)∶n(GA)=75∶25,濟(jì)南岱港生物材料有限公司;相對分子質(zhì)量80 kD];鹽酸米諾環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品、蔗糖醋酸鹽異丁酸酯(SAIB,相對分子質(zhì)量846.91,1.146 g/mL)(美國Sigma 公司)。其他試劑均為市售分析純。

    1.2 儀 器

    靜電紡絲儀(北京永康樂業(yè)科技發(fā)展有限公司);掃描電子顯微鏡(日本Jeol公司);偏光顯微鏡(日本Nikon 公司);酶標(biāo)儀(美國Thermo Scientific公司);接觸角測量儀(北京環(huán)球恒達(dá)科技有限公司);激光共聚焦顯微鏡(德國Leica 公司;圖像分析軟件ImageJ(美國國立衛(wèi)生研究院)。

    2 方 法

    2.1 鹽酸米諾環(huán)素微球的制備

    將PLGA 溶于氯仿,得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%的PLGA 溶液,然后將鹽酸米諾環(huán)素(相對于PLGA 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0%,2%)加入PLGA 溶液中,用磁力攪拌器恒溫攪拌2 h 充分混合。在室溫下,將所配置的溶液分別裝入21 號不銹鋼鈍性針頭的5 mL 注射器,針頭與高壓直流電源的正極相連,與針頭相距20 cm 的接收滾筒上接負(fù)極,滾筒上蓋著鋁箔紙,作為微球的接收器,制備得到空白微球(M)以及鹽酸米諾環(huán)素微球(minocycline hydrochloride microsphere,MH-M)。制備微球的電噴參數(shù)如下:8%PLGA溶液在14 kV的高壓電場中,以0.25 mL/h的推注速度,相對濕度控制在31%~33%,溫度控制在21~23 ℃。鋁箔紙上覆蓋載玻片收集微球,然后置于倒置相差顯微鏡下觀察其形態(tài)。電噴結(jié)束后,鋁箔紙置于恒溫箱中干燥48 h,揮發(fā)殘留的有機(jī)溶劑,收集到的微球轉(zhuǎn)移至小玻璃瓶于-20 ℃保存。

    2.2 鹽酸米諾環(huán)素微球的特征

    2.2.1 鹽酸米諾環(huán)素微球的大小與形態(tài) 收集到微球的鋁箔紙剪成1 cm×1 cm,固定在樣品臺上,旋轉(zhuǎn)蒸鍍儀噴金,使用掃描電鏡(SEM)進(jìn)行觀察;載玻片收集到的微球在偏振光顯微鏡下觀察,用ImageJ 軟件測量微球直徑并計數(shù)(每個樣本超過100 個),結(jié)果以表示;微球直徑的單分散性即粒徑分布一致性,用變異系數(shù)CV(%),CV 越低表明微球單分散性即粒徑分布一致性越佳。

    2.2.2 接觸角測試 用鋁箔紙收集到的微球直接進(jìn)行接觸角儀器檢測,每組3 個樣本,每個樣本重復(fù)測量3次,結(jié)果以xˉ±s表示。

    2.2.3 鹽酸米諾環(huán)素微球的載藥量以及包封率針對包封率測定,用超速離心法測定微球表面游離MH 的含量。稱取微球5 mg,精確到0.1 mg,溶于PBS 溶液1 mL 中,混勻形成樣品溶液,轉(zhuǎn)移到1.5 mL 超速離心管中,然后在13 000 r/min 離心10 min。提取上清液,利用酶標(biāo)儀在350 nm 波長處分析。重復(fù)3次,計算包封率。

    針對載藥量的測定,通過將微球5 mg 溶解在無水乙醇1 mL 中,超聲處理10 min 后直至樣品中聚合物完全溶解,然后在15 000 r/min離心20 min。最后提取上清液并利用酶標(biāo)儀在350 nm 波長處分析,從而來測定球體中的MH 含量。重復(fù)3 次,計算載藥量。

    2.2.4 鹽酸米諾環(huán)素微球的藥物分配 鹽酸米諾環(huán)素屬于第二代半合成的四環(huán)素族藥物,具有在一定條件下能夠被激發(fā)出綠色熒光的特性。因此,將電噴微球樣品置于玻片上,在激光掃描共聚焦顯微鏡下,使用375 nm的激發(fā)波長進(jìn)行觀察。

    2.3 鹽酸米諾環(huán)素/SAIB以及鹽酸米諾環(huán)素微球/SAIB的制備

    將SAIB 與EtOH 混合得到透明的SAIB-EtOH溶液(SAIB 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80%)。使用前,將鹽酸米諾環(huán)素0.1 mg 分散在上述SAIB-EtOH 系統(tǒng)中以產(chǎn)生鹽酸米諾環(huán)素/SAIB(MH-SAIB)貯庫。類似地,將鹽酸米諾環(huán)素微球5 mg在SAIB-EtOH溶液50 mg中旋轉(zhuǎn)5 min均勻混合,以獲得鹽酸米諾環(huán)素微球/SAIB(MH-M-SAIB)混合貯庫(約含鹽酸米諾環(huán)素0.1 mg)。

    2.4 體外釋放

    取鹽酸米諾環(huán)素微球5 mg(約含鹽酸米諾環(huán)素0.1 mg)以及MH-M-SAIB(約含鹽酸米諾環(huán)素0.1 mg)50 mg 分別 加入 含 有PBS 溶 液1 mL 的1.5 mL EP 管(pH 7.4,0.02% NaN3)。所有的樣本置于搖床中恒溫37 ℃水浴。于定點(diǎn)時間取樣,將各樣本溶液進(jìn)行13 000 r/min離心10 min后取上清液,采用酶標(biāo)儀測量藥物吸收度。所有的實驗重復(fù)3次。

    2.5 體外降解

    體外降解率是通過測定微球在PBS 中浸泡過程中的失重進(jìn)行測定[8]。因此,分別將空白微球以及鹽酸米諾環(huán)素微球5 mg 浸泡在PBS 1.5 mL中,并在37 ℃恒溫箱中保存60 d。在特定的時間間隔內(nèi)測定PBS 溶液pH,并與新鮮PBS 交換溶液,以確保pH 恒定為7.4。每個降解期后(7,15,30,45,60 d),樣品用去離子水洗滌,在冷凍干燥箱中干燥2 d,電子天平秤重,計算降解實驗后的體外降解率。降解率(%)=(W0-Wt)/W0× 100。其中,W0和Wt分別是降解期前后電噴微球的干燥重量。每個樣本組至少重復(fù)3次。

    2.6 孔隙率

    將SAIB 溶液注入水相,外水迅速擴(kuò)散到貯庫中,而溶劑則從基質(zhì)中擴(kuò)散到水相中。這導(dǎo)致富水區(qū)域的多孔網(wǎng)絡(luò)的形成,周圍是一個富含SAIB的系統(tǒng)??紫堵适峭ㄟ^測試擴(kuò)散到貯庫的液體的體積來確定的。將約分析樣品50 mg 注入PBS 1.5 mL 中,并置于37 ℃恒溫箱中。在特定時間(2,8,15,30,45 d)取PBS。然后,貯庫被凍干以除去吸收的液體。通過測量凍干前后的水位差,可以方便地確定貯庫吸收的液體量。因此,孔隙率可用公式(1)計算:

    式中:p為孔隙率,W1為SAIB 溶液的質(zhì)量,W2為吸收液體后貯庫的質(zhì)量,W3為貯庫凍干后的質(zhì)量,c為SAIB溶液中SAIB的濃度,ρ1為液體的密度,ρ2為SAIB的密度。每種溶液的試驗重復(fù)3次。

    2.7 統(tǒng)計分析

    數(shù)據(jù)以表示。單因素方差分析(ANOVA)和SNK-q 測驗用來確定統(tǒng)計顯著性。所有計算均使用SPSS軟件20.0版進(jìn)行,P<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

    3 結(jié)果與討論

    3.1 鹽酸米諾環(huán)素微球的特征

    圖1-A 及圖1-B 分別是微球的光學(xué)及電子顯微鏡圖。由圖可見微球大多數(shù)呈球形,較均勻,且表面相對光滑。同時,用ImageJ 測得微球直徑為(5.294 ± 1.222)μm,變異系數(shù)CV 為11.22%,微球的尺寸分布較窄,分布圖如圖1-D所示。

    接觸角測試是材料親水性能表征的重要指標(biāo)之一,經(jīng)測量微球接觸角為(95.98 ± 0.67)°(圖1-C),表明該材料表面較疏水,并且微球的載藥量和包封率分別為(1.689 ± 0.005)%和(69.57 ± 0.23)%,有研究表明親水性藥物與具有末端親水基團(tuán)的PLGA 結(jié)合所制得的載藥微球具有較高的包封率[19],因此有望通過增加該材料的親水性來增加鹽酸米諾環(huán)素的包封率。激光共聚焦顯微圖像見鹽酸米諾環(huán)素均勻分布于微球內(nèi)(圖2)。

    3.2 鹽酸米諾環(huán)素微球及微球貯庫的體外釋放

    鹽酸米諾環(huán)素微球的體外釋放曲線如圖3-A所示。微球第1 天的藥物釋放達(dá)60%,前3 天釋放接近66%,隨后每天以約2.7%的釋放速率持續(xù)至第7天。

    MH-M-SAIB 和MH-SAIB 貯庫在PBS 培養(yǎng)基中的體外藥物釋放曲線如圖3-B 所示。由圖可知,將鹽酸米諾環(huán)素微球裝入SAIB 貯庫后,第1 天藥物釋放率從61.24%下降到3.27%,然而MH-SAIB 貯庫仍然顯示出明顯的突釋(高達(dá)24.79%)。在最初的7 d里,MH-M-SAIB以及MH-SAIB都顯示出高濃度藥物釋放率,累計釋放18.15%和56.16%,前7 天的平均釋放率分別約為2.59%和8.02%(圖3-B)。7 d 后,藥物從MH-M-SAIB 以及MH-SAIB 貯庫中以約每天1.03%的釋放速率持續(xù)釋放,直至第42 天,總共釋放55.29%以及91.09%。體外藥物釋放實驗數(shù)據(jù)用常用的4 種釋放動力學(xué)模型擬合,即零級(方程式:Q= a + Kt)、一級(方程式:ln(1-Q)=a+Kt)、Higuchi(方程:Q=a+Kt1/2)和Ritger Peppas(方程:Q=Ktn)模型[20-22],研究了基于SAIB 貯庫的MH 藥物釋放動力學(xué),得到的模型方程以及參數(shù)見表1。在所有模型中,Ritger-Peppas模型具有較好的一致性,因此用于擬合MH-MSAIB 以及MH-SAIB 的溶出曲線,以評估MH 的藥物釋放,良好的擬合反映在表2 中。SAIB 貯庫MH釋放曲線的線性擬合表明存在兩個釋放階段(表2),斜率代表藥物釋放速率,從第1 天到第7 天,MH-SAIB 的藥物釋放速率大于MH-M-SAIB 貯庫,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),而第7 天后,MH-MSAIB 的藥物釋放速率稍大于SAIB 貯庫,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

    Figure 3 Release curves of MH-M(A)and sucrose acetate isobutyrate(SAIB)-based depot MH-SAIB and MH-M-SAIB(B)(xˉ± s,n = 3)

    Table 1 Parameters obtained by fitting four different models to the release data for SAIB-based depot drug release kinetics

    Table 2 Evaluation of drug release kinetics of SAIB-based depot according to the Ritger-Peppas equation

    局部應(yīng)用抗生素治療牙周炎的成功主要依賴于抗菌藥物的持續(xù)釋放[23],并且鹽酸米諾環(huán)素在適宜濃度內(nèi)能有效促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖,而高濃度反而會抑制成骨細(xì)胞的增殖。鹽酸米諾環(huán)素對密螺旋體的最小抑制濃度小于0.125 μg/mL[24],對放線桿菌的最小抑制濃度為0.25 μg/mL[25],同時,Almazin 等[5]發(fā)現(xiàn)鹽酸米諾環(huán)素質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL 時,對成骨細(xì)胞產(chǎn)生了毒性作用,本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)米諾環(huán)素質(zhì)量濃度為10 μg/mL 時,對成骨細(xì)胞的增殖作用開始下降[6]??傊粋€有效的藥物傳遞系統(tǒng)通常是將一種治療物質(zhì)引入體內(nèi),通過控制藥物在體內(nèi)釋放的速率、時間和位置來提高其有效性和安全性,并避免不良反應(yīng)[26]。因此,本實驗將鹽酸米諾環(huán)素第1天的釋放率降低到了3.7%,以后以約1.03%的釋放速率緩慢持續(xù)至42 d,不僅能達(dá)到鹽酸米諾環(huán)素的有效抑菌濃度,而且該濃度也未對成骨細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用,可做進(jìn)一步實驗驗證其成骨及抑菌效果。

    3.3 空白微球以及鹽酸米諾環(huán)素微球的降解

    已知PLGA降解遵循偽一級動力學(xué)[27]。由表3可知,降解曲線的方程擬合表明鹽酸米諾環(huán)素微球存在3 個降解階段,空白微球存在2 個降解階段,鹽酸米諾環(huán)素微球和空白微球的降解與偽一級方程擬合都得到了較好的一致性。由圖4可知,鹽酸米諾環(huán)素微球降解速率由大到小依次為45~60 d、0~7 d、7~45 d,空白微球的降解速率由大到小依次為45~60 d、0~45 d。這主要是因為,PLGA 體外降解是通過酯鍵的水解進(jìn)行,然而分子鏈上酯鍵的水解斷裂是無規(guī)則的,每個酯鍵都可能被水解,被水解的部位越多,相對分子質(zhì)量降低也就越快,然而PLGA 相對分子質(zhì)量只有降低到某一臨界值,才能溶解于水。因此在降解前期,微球表層分子鏈無規(guī)斷裂,形成極少量能溶于水的小分子鏈斷,相對分子質(zhì)量顯著降低,而微球無明顯質(zhì)量下降現(xiàn)象,但是隨著降解時間的延長,大量的小分子鏈斷開始在微球中形成,并擴(kuò)散溶解進(jìn)模擬體液,微球質(zhì)量損失速率加快。所以表現(xiàn)為體外降解前期相對分子質(zhì)量降低幅度較大,后期質(zhì)量損耗幅度大[28-30]。同時,在0~7 d,鹽酸米諾環(huán)素微球以及空白微球的降解率分別為8.66%和6.66%,鹽酸米諾環(huán)素微球的降解率大于空白微球,鹽酸米諾環(huán)素微球在0~7 d 的藥物釋放率(70.26%,約0.07 mg)表明,在0~7 d 時藥物大量釋放(由圖3-A 可知);而在7~45 d 以及45~60 d,鹽酸米諾環(huán)素微球以及空白微球的降解率都分別為21.34%以及18.66%,兩者之間無差異,這表明微球的降解速率與所含藥物與否沒有相關(guān)性??瞻孜⑶蚣胞}酸米諾環(huán)素微球在60 d 內(nèi)降解約50%,表明當(dāng)鹽酸米諾環(huán)素釋放結(jié)束后,該材料仍存于體內(nèi),因此有望進(jìn)一步研究得到釋放與降解時間的統(tǒng)一。

    Table 3 Evaluation of degradation kinetics of microspheres according to pseudo-first order equation

    Figure 4 Degradation image of MH-M and blank microspheres(M)(xˉ± s,n = 3)

    3.4 MH-M-SAIB以及MH-SAIB的孔隙率

    當(dāng)微球分散在基質(zhì)豐富的相并擴(kuò)散到PBS 緩沖液中時,貯庫顯示出不同的孔隙率(代表不同的擴(kuò)散速率)。圖5顯示了MH-M-SAIB以及MH-SAIB在PBS 介質(zhì)中的孔隙率變化。從2~45 d,MH-MSAIB 的孔隙率始終高于MH-SAIB,這可能是由于微球本身具有吸水性,從而導(dǎo)致更高的孔隙率。此外,在2~15 d 時,MH-M-SAIB 的孔隙率增長迅速,15 d 后則相對穩(wěn)定;而MH-SAIB 在2~8 d 時增長迅速,8~15 d 增長稍慢一些,15 d 后相對穩(wěn)定,這表明釋放行為可能與孔隙率的變化有關(guān)。在15 d 之前觀察到一個相對陡峭的變化率,這和MH-SAIB 和MH-M-SAIB 的快速藥物釋放有關(guān),而在15~45 d 之間觀察到緩慢的速率變化,對應(yīng)于穩(wěn)定和長期的釋放。并且MH-M-SAIB的孔隙率一直大于MH-SAIB,但是MH-M-SAIB 的藥物釋放速率卻低于MH-SAIB,這表明在SAIB 貯庫中,藥物釋放速度主要受溶解于SAIB貯庫中的藥物濃度影響。MH-M-SAIB 里的藥物大部分位于微球內(nèi)部以及表面,溶解于SAIB貯庫中的藥物濃度較低,并且藥物從SAIB 釋放出來擴(kuò)散路徑較長;而MH-SAIB所含藥物僅位于SAIB 貯庫內(nèi)部以及表面,溶解于SAIB 貯庫中的藥物濃度較高,并且藥物從SAIB 釋放出來的擴(kuò)散路徑較短,從而導(dǎo)致MH-SAIB 較MH-M-SAIB更快釋放[31]。

    Figure 5 Porosity of MH-M-SAIB and MH-SAIB(xˉ± s,n = 3)

    4 結(jié) 論

    本實驗通過靜電噴霧的方法,成功制備表面光滑,尺寸分布均勻的鹽酸米諾環(huán)素PLGA 微球,并將其與SAIB混合成功制備鹽酸米諾環(huán)素微球貯庫。同時,研究結(jié)果表明,鹽酸米諾環(huán)素微球貯庫能顯著降低藥物的突釋,達(dá)到持續(xù)穩(wěn)定的長期釋放,為后續(xù)進(jìn)一步研究鹽酸米諾環(huán)素微球貯庫的成骨效果及抑菌實驗奠定了基礎(chǔ)。

    猜你喜歡
    米諾環(huán)素微球
    多西環(huán)素漲至800元/kg,95%的原料暴漲,動保企業(yè)也快扛不住了!
    懸浮聚合法制備窄尺寸分布聚甲基丙烯酸甲酯高分子微球
    鹽酸米諾環(huán)素軟膏治療慢性牙周炎的效果探討
    過表達(dá)親環(huán)素J 促進(jìn)肝癌的發(fā)生
    西藥藥劑頭孢米諾的臨床應(yīng)用研究
    TiO2/PPy復(fù)合導(dǎo)電微球的制備
    可吸收止血微球在肝臟部分切除術(shù)中的應(yīng)用
    親環(huán)素A與慢性心力衰竭相關(guān)性的研究
    米諾環(huán)素治療老年醫(yī)院獲得性肺炎28例
    復(fù)凝法制備明膠微球
    河南科技(2014年22期)2014-02-27 14:18:07
    国产熟女午夜一区二区三区| 在线观看免费日韩欧美大片| 国产精品 国内视频| 精品熟女少妇八av免费久了| 人人澡人人妻人| 色老头精品视频在线观看| 午夜免费成人在线视频| 男女床上黄色一级片免费看| 最新的欧美精品一区二区| 国产成人免费观看mmmm| 亚洲av成人一区二区三| 欧美日韩亚洲高清精品| 国产高清激情床上av| 亚洲av第一区精品v没综合| 免费不卡黄色视频| 99国产精品99久久久久| 成年版毛片免费区| 天天影视国产精品| 叶爱在线成人免费视频播放| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 国产成人精品久久二区二区免费| videos熟女内射| 亚洲人成77777在线视频| 操出白浆在线播放| 亚洲欧美日韩高清在线视频 | 国产成人精品久久二区二区91| 99久久精品国产亚洲精品| 在线观看免费高清a一片| 美女视频免费永久观看网站| 岛国毛片在线播放| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 久久久久精品国产欧美久久久| 国产精品久久久久久精品电影小说| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 精品久久久久久久毛片微露脸| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 在线观看免费高清a一片| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| videosex国产| 国产97色在线日韩免费| 美国免费a级毛片| 97在线人人人人妻| 精品久久久久久久毛片微露脸| 人人妻人人澡人人看| 国产av国产精品国产| 美女视频免费永久观看网站| 久久久国产精品麻豆| 亚洲人成电影免费在线| av国产精品久久久久影院| 亚洲精品中文字幕在线视频| 午夜福利免费观看在线| 无人区码免费观看不卡 | 日本a在线网址| 亚洲精品乱久久久久久| 午夜福利影视在线免费观看| 久久久国产欧美日韩av| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 精品国产乱码久久久久久小说| 久久99热这里只频精品6学生| 999久久久精品免费观看国产| 国产精品二区激情视频| 欧美乱妇无乱码| 青青草视频在线视频观看| 久久久精品区二区三区| 亚洲第一青青草原| 国产精品成人在线| 91老司机精品| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 精品久久久久久久毛片微露脸| 老司机午夜十八禁免费视频| 国产成+人综合+亚洲专区| 久久久国产欧美日韩av| 国产免费福利视频在线观看| 91大片在线观看| 午夜两性在线视频| 久久av网站| 欧美成狂野欧美在线观看| 午夜免费鲁丝| 精品人妻1区二区| av线在线观看网站| 一区福利在线观看| 久久亚洲真实| 青青草视频在线视频观看| 欧美日韩黄片免| 老汉色av国产亚洲站长工具| 99久久精品国产亚洲精品| 亚洲专区字幕在线| 精品国产一区二区三区四区第35| 国产成人影院久久av| 国产片内射在线| 精品国产亚洲在线| 丁香欧美五月| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 午夜精品久久久久久毛片777| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 亚洲精品一二三| 欧美乱妇无乱码| 精品国内亚洲2022精品成人 | 国产深夜福利视频在线观看| 满18在线观看网站| 国产精品欧美亚洲77777| 一级黄色大片毛片| 日韩欧美三级三区| 99香蕉大伊视频| 中文字幕高清在线视频| 亚洲少妇的诱惑av| 黄频高清免费视频| 国产激情久久老熟女| 亚洲专区国产一区二区| 亚洲,欧美精品.| 波多野结衣一区麻豆| 91精品国产国语对白视频| 日韩欧美国产一区二区入口| 99国产综合亚洲精品| 中文字幕色久视频| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 蜜桃在线观看..| 亚洲天堂av无毛| 美女福利国产在线| 久久久国产欧美日韩av| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 久久香蕉激情| 一级片'在线观看视频| 黄片播放在线免费| 久久久久网色| 日韩成人在线观看一区二区三区| 18禁国产床啪视频网站| 欧美日韩成人在线一区二区| 老司机午夜福利在线观看视频 | 在线观看66精品国产| 韩国精品一区二区三区| 国产不卡av网站在线观看| 精品国产乱码久久久久久男人| 亚洲天堂av无毛| 欧美精品av麻豆av| 国产精品熟女久久久久浪| 久久人人97超碰香蕉20202| 日本精品一区二区三区蜜桃| 久久久久久久精品吃奶| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 人人澡人人妻人| 亚洲专区国产一区二区| 搡老岳熟女国产| 成年人免费黄色播放视频| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 男女边摸边吃奶| 欧美黄色淫秽网站| 天堂8中文在线网| 国产精品一区二区精品视频观看| 亚洲伊人色综图| 精品少妇黑人巨大在线播放| 免费看十八禁软件| 人妻久久中文字幕网| 99九九在线精品视频| 纯流量卡能插随身wifi吗| 久久av网站| 色精品久久人妻99蜜桃| 在线av久久热| 亚洲av成人一区二区三| 国产高清视频在线播放一区| 久久精品国产亚洲av香蕉五月 | a级毛片在线看网站| 亚洲欧洲日产国产| 免费日韩欧美在线观看| 午夜福利一区二区在线看| 91国产中文字幕| 丁香六月欧美| 久久狼人影院| 久久这里只有精品19| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 亚洲男人天堂网一区| 三级毛片av免费| 色老头精品视频在线观看| 男女床上黄色一级片免费看| 99热网站在线观看| 一级黄色大片毛片| 国产免费现黄频在线看| 亚洲欧洲日产国产| 久久久久久人人人人人| 国产伦人伦偷精品视频| 久久热在线av| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 成年人黄色毛片网站| 91九色精品人成在线观看| 精品人妻在线不人妻| 亚洲天堂av无毛| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 欧美午夜高清在线| 日本wwww免费看| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 十八禁网站网址无遮挡| 亚洲国产欧美在线一区| 国产精品久久久久久精品古装| 亚洲九九香蕉| 亚洲精品久久午夜乱码| 天天影视国产精品| 国产成人影院久久av| 亚洲成人手机| 日韩欧美三级三区| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 两个人免费观看高清视频| 精品国产乱码久久久久久小说| 国产精品国产高清国产av | 麻豆国产av国片精品| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 高清视频免费观看一区二区| 亚洲欧洲日产国产| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 夜夜爽天天搞| 日韩免费高清中文字幕av| 国产91精品成人一区二区三区 | 精品午夜福利视频在线观看一区 | 最近最新免费中文字幕在线| 男男h啪啪无遮挡| 日韩精品免费视频一区二区三区| 精品久久久久久电影网| 在线观看免费视频日本深夜| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 色综合欧美亚洲国产小说| 999精品在线视频| 一夜夜www| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 免费在线观看影片大全网站| 国产成人精品无人区| av国产精品久久久久影院| 99re在线观看精品视频| 日韩有码中文字幕| 麻豆成人av在线观看| 午夜福利免费观看在线| av天堂久久9| 日韩成人在线观看一区二区三区| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 老汉色∧v一级毛片| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 色视频在线一区二区三区| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 久久香蕉激情| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 性色av乱码一区二区三区2| 高潮久久久久久久久久久不卡| 国产日韩欧美在线精品| bbb黄色大片| 亚洲精品成人av观看孕妇| 久久中文字幕人妻熟女| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 午夜福利一区二区在线看| 操美女的视频在线观看| 亚洲精品中文字幕在线视频| 母亲3免费完整高清在线观看| 成人精品一区二区免费| 精品乱码久久久久久99久播| 人妻久久中文字幕网| 自线自在国产av| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 中文字幕精品免费在线观看视频| 国产主播在线观看一区二区| 丝袜人妻中文字幕| 高清在线国产一区| 黄色视频在线播放观看不卡| a级片在线免费高清观看视频| 一区福利在线观看| 亚洲国产欧美网| 少妇精品久久久久久久| 啪啪无遮挡十八禁网站| 伦理电影免费视频| 国产亚洲av高清不卡| 在线永久观看黄色视频| 性色av乱码一区二区三区2| 美女扒开内裤让男人捅视频| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 在线观看一区二区三区激情| 亚洲av欧美aⅴ国产| 精品第一国产精品| 日韩免费av在线播放| 亚洲人成77777在线视频| 91麻豆av在线| 黄色成人免费大全| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 欧美人与性动交α欧美软件| 搡老岳熟女国产| 国产精品偷伦视频观看了| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 午夜福利免费观看在线| 一级毛片女人18水好多| 久久久精品免费免费高清| 亚洲精品乱久久久久久| 丝瓜视频免费看黄片| 久久九九热精品免费| 国产精品98久久久久久宅男小说| 天堂中文最新版在线下载| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 亚洲av美国av| 欧美久久黑人一区二区| av在线播放免费不卡| av片东京热男人的天堂| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 老司机亚洲免费影院| 午夜福利免费观看在线| 国精品久久久久久国模美| kizo精华| 成人18禁在线播放| 精品一区二区三卡| 国产成人欧美在线观看 | 日韩视频一区二区在线观看| 精品高清国产在线一区| 亚洲精品粉嫩美女一区| 人人澡人人妻人| 他把我摸到了高潮在线观看 | 精品少妇黑人巨大在线播放| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 国产高清激情床上av| 夜夜夜夜夜久久久久| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 欧美日韩视频精品一区| 中文亚洲av片在线观看爽 | 正在播放国产对白刺激| 久热这里只有精品99| 少妇的丰满在线观看| 国产精品影院久久| 亚洲一区二区三区欧美精品| 色视频在线一区二区三区| 高清av免费在线| 亚洲成国产人片在线观看| 黑人操中国人逼视频| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 久久精品人人爽人人爽视色| 777米奇影视久久| 日韩一区二区三区影片| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 久久av网站| 两人在一起打扑克的视频| 久久久久网色| 十八禁网站网址无遮挡| 少妇的丰满在线观看| 久久久精品区二区三区| 天天添夜夜摸| 久久国产亚洲av麻豆专区| 国产91精品成人一区二区三区 | 国产在线免费精品| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 国产一区二区三区综合在线观看| 国产在线精品亚洲第一网站| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 色视频在线一区二区三区| 亚洲av美国av| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 高潮久久久久久久久久久不卡| 深夜精品福利| xxxhd国产人妻xxx| 亚洲精品粉嫩美女一区| 亚洲精品av麻豆狂野| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 久久99热这里只频精品6学生| 99国产精品免费福利视频| 人人澡人人妻人| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| videos熟女内射| 国产区一区二久久| 日韩成人在线观看一区二区三区| 亚洲综合色网址| 国产又色又爽无遮挡免费看| 欧美国产精品一级二级三级| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 欧美日本中文国产一区发布| 中文字幕高清在线视频| 亚洲性夜色夜夜综合| 色播在线永久视频| 叶爱在线成人免费视频播放| www日本在线高清视频| 久久人妻熟女aⅴ| 国产精品熟女久久久久浪| 亚洲七黄色美女视频| www日本在线高清视频| 大型av网站在线播放| 色老头精品视频在线观看| 亚洲黑人精品在线| 亚洲五月色婷婷综合| 十八禁人妻一区二区| 亚洲成人免费电影在线观看| 美女主播在线视频| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 国产在线一区二区三区精| 亚洲伊人久久精品综合| videos熟女内射| 成年女人毛片免费观看观看9 | 十八禁网站免费在线| 久久人妻av系列| 男女床上黄色一级片免费看| 真人做人爱边吃奶动态| 叶爱在线成人免费视频播放| 美女国产高潮福利片在线看| 这个男人来自地球电影免费观看| 国产成人欧美| 国产麻豆69| 亚洲美女黄片视频| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区 | 两人在一起打扑克的视频| 丝袜喷水一区| www.精华液| 亚洲精品一二三| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 成人亚洲精品一区在线观看| av不卡在线播放| 欧美在线一区亚洲| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 黄片大片在线免费观看| 久久久久久久大尺度免费视频| 精品国产一区二区久久| 精品亚洲成国产av| 人妻久久中文字幕网| 在线永久观看黄色视频| 高潮久久久久久久久久久不卡| 国产一区二区激情短视频| 99久久99久久久精品蜜桃| 免费观看av网站的网址| av免费在线观看网站| a在线观看视频网站| 美女视频免费永久观看网站| 色婷婷av一区二区三区视频| 亚洲国产看品久久| 久久人妻av系列| 国产午夜精品久久久久久| 热re99久久国产66热| 99精国产麻豆久久婷婷| 色老头精品视频在线观看| 国产黄色免费在线视频| 午夜视频精品福利| 在线av久久热| 99精品在免费线老司机午夜| av欧美777| 成人国语在线视频| 99九九在线精品视频| 激情视频va一区二区三区| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 欧美日韩av久久| 国产成人精品在线电影| 国产精品一区二区免费欧美| 美女午夜性视频免费| 午夜老司机福利片| 中文亚洲av片在线观看爽 | 亚洲一区二区三区欧美精品| 国产在视频线精品| 国产在线免费精品| av一本久久久久| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 欧美国产精品va在线观看不卡| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 99精品久久久久人妻精品| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 国产一卡二卡三卡精品| 高清av免费在线| 亚洲少妇的诱惑av| 中文字幕人妻熟女乱码| 精品国产亚洲在线| 久久精品成人免费网站| 亚洲色图av天堂| 高清黄色对白视频在线免费看| 亚洲av成人一区二区三| 高清视频免费观看一区二区| 多毛熟女@视频| 少妇精品久久久久久久| 99久久国产精品久久久| 一区二区三区激情视频| 满18在线观看网站| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 欧美精品亚洲一区二区| 美女主播在线视频| 日本欧美视频一区| 久久国产精品人妻蜜桃| 99精品欧美一区二区三区四区| 国产片内射在线| 黄色成人免费大全| 天天影视国产精品| aaaaa片日本免费| 亚洲精品中文字幕在线视频| 1024视频免费在线观看| 午夜福利视频精品| 久久久水蜜桃国产精品网| 在线播放国产精品三级| 搡老岳熟女国产| 在线av久久热| 丁香六月天网| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 一级毛片电影观看| 成年动漫av网址| 老司机午夜福利在线观看视频 | 十八禁网站免费在线| 9色porny在线观看| 人妻一区二区av| 久久久久久久久免费视频了| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 91大片在线观看| 宅男免费午夜| 日日爽夜夜爽网站| 国产福利在线免费观看视频| 黄色 视频免费看| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 亚洲第一青青草原| 国产在视频线精品| 国产色视频综合| 色在线成人网| 黄片播放在线免费| 国产伦人伦偷精品视频| 亚洲精品在线美女| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| a级片在线免费高清观看视频| 午夜91福利影院| 这个男人来自地球电影免费观看| 国产在线一区二区三区精| 一级毛片电影观看| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 日本一区二区免费在线视频| 国产成人系列免费观看| 色视频在线一区二区三区| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 天堂俺去俺来也www色官网| 夜夜夜夜夜久久久久| 18禁国产床啪视频网站| 午夜福利影视在线免费观看| 国产色视频综合| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 精品少妇久久久久久888优播| 欧美激情极品国产一区二区三区| 欧美日韩av久久| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 人人妻人人澡人人看| 午夜福利乱码中文字幕| 一区二区三区国产精品乱码| 午夜福利在线观看吧| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 成人18禁在线播放| 黄色视频,在线免费观看| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 高清视频免费观看一区二区| 国产精品熟女久久久久浪| 一区在线观看完整版| 国产又色又爽无遮挡免费看| 国产免费视频播放在线视频| 一级片免费观看大全| 好男人电影高清在线观看| 在线播放国产精品三级| 俄罗斯特黄特色一大片| 不卡一级毛片| 亚洲精品国产一区二区精华液| 女性生殖器流出的白浆| 一级a爱视频在线免费观看| 日本vs欧美在线观看视频| kizo精华| 99国产精品一区二区三区| 久9热在线精品视频| 在线观看免费视频网站a站| 精品少妇内射三级| 久久精品成人免费网站| 免费黄频网站在线观看国产| 精品国内亚洲2022精品成人 | 国产欧美日韩综合在线一区二区| 久久精品国产亚洲av香蕉五月 | 丁香欧美五月| 一级毛片精品| 久久精品成人免费网站| 波多野结衣av一区二区av| 日本av手机在线免费观看| 欧美在线一区亚洲| av天堂在线播放| 淫妇啪啪啪对白视频| 天天操日日干夜夜撸| 日韩欧美国产一区二区入口| 久久人妻av系列| 在线看a的网站| 亚洲专区中文字幕在线| 欧美大码av| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 久久影院123| 黄频高清免费视频| 亚洲全国av大片| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 久久精品国产亚洲av高清一级| 久久人人97超碰香蕉20202| 最新美女视频免费是黄的| 狠狠狠狠99中文字幕| 好男人电影高清在线观看| 最新美女视频免费是黄的| 在线看a的网站| 99久久人妻综合| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 欧美在线一区亚洲| 免费看a级黄色片| 精品少妇久久久久久888优播| 亚洲国产欧美一区二区综合| 久久久国产欧美日韩av| 中文字幕av电影在线播放| 18在线观看网站| 午夜福利欧美成人| 久久精品国产综合久久久| 久9热在线精品视频| 日韩欧美一区二区三区在线观看 | 另类精品久久| 亚洲国产中文字幕在线视频| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 少妇粗大呻吟视频|