外源激素對日本落葉松體細胞胚發(fā)生不同階段的影響*

吳曉雪 張艾婧 蓋 穎 蔣湘寧

(北京林業(yè)大學生物科學與技術學院 北京 100083)

體細胞胚胎發(fā)生具有繁殖系數(shù)高和植株再生率高以及不受季節(jié)限制等特點，是落葉松(Larix)遺傳改良的有利工具。近年來，由于日益嚴重的環(huán)境問題損害了落葉松的生長環(huán)境，導致落葉松在我國適宜的生長范圍不斷縮小，并且已經(jīng)出現(xiàn)了落葉松等木材的生產(chǎn)供應短缺等問題。因此，利用落葉松的體細胞胚發(fā)生技術進行遺傳改良從而繁育出具有良好的環(huán)境適應性的落葉松具有重要意義。Aderkas等(1987)首次用歐洲落葉松(Larixdecidua)雌配子體為外植體在LM基本培養(yǎng)基上誘導出胚性胚柄團，誘導率達90%，但未獲得植株再生；Klimaszewska(1989)利用雜種落葉松(Larix×eurolepis)的原生質體成功誘導出體細胞胚，并獲得再生植株；齊力旺(2000)成功誘導出華北落葉松(Larixprincipis-rupprechtii)的體細胞胚。到目前為止，歐洲落葉松、歐日雜種落葉松(Larix×leptoeuropaea)、美洲落葉松(Larixlaricina)、西方落葉松(Larixoccidentalis)、日本落葉松(Larixkaempferi)、華北落葉松、新疆落葉松(Larixsibirica)等落葉松屬樹種均已成功誘導出體細胞胚(Korlachetal., 1995; Lelu-Walteretal., 2009; Klimaszewskaetal., 1997; Thompsonetal., 1992; 呂守芳等, 2005; 齊力旺, 2000; Belousovaetal., 2008)。但是，落葉松體細胞胚胎發(fā)生仍然存在很多問題，例如胚性胚柄團的誘導受外植體類型的限制(僅子葉前期的未成熟合子胚誘導胚性胚柄團的效果好)、胚性胚柄團增殖率低、體細胞胚成熟率低等，并且懸浮細胞培養(yǎng)作為一種可以有效獲得快速增殖的胚性胚柄團的培養(yǎng)方式，目前在落葉松屬植物中的研究仍然非常有限(宋躍等, 2018; 呂守芳等, 2005)。

合適的外源激素可以有效提高胚性胚柄團和懸浮細胞的增殖率，提高成熟子葉胚的數(shù)量。2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)、6-BA(6-芐基腺嘌呤)、ABA(脫落酸)、IAA(吲哚-3-乙酸)、GA3(赤霉素)是植物體細胞胚發(fā)生過程中常用的激素。胚性胚柄團的增殖和懸浮細胞培養(yǎng)通常將2,4-D和6-BA配合使用，已有研究證實2,4-D和6-BA的相互作用可以有效維持細胞內(nèi)在環(huán)境的穩(wěn)定，從而影響胚性胚柄團的增殖和懸浮細胞的生長(崔凱榮等, 2017)。但王偉達等(2008)發(fā)現(xiàn)6-BA對雜種落葉松(Larixkaempferi×L.olgensis)胚性胚柄團增殖的影響并不顯著。另外，除2,4-D和6-BA這2種激素，齊力旺(2000)還發(fā)現(xiàn)在胚性胚柄團增殖階段添加少量的ABA有助于胚性的保持。在體細胞胚誘導與成熟階段，ABA與PEG(聚乙二醇)和AgNO3的組合使用可以為體細胞胚發(fā)生提供合適的脫水環(huán)境和氣態(tài)環(huán)境，但是部分誘導出的體細胞胚無法發(fā)育為正常的子葉胚；進一步的研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)源IAA和GA3可以有效調(diào)節(jié)體細胞胚向成熟子葉胚的正常發(fā)育(孫丹等, 2013)，而外源IAA和GA3是否具有相同的作用還有待進一步驗證。

外源激素對體細胞胚發(fā)生的影響十分復雜，因此本研究以日本落葉松胚性胚柄團為材料，研究外源激素對胚性胚柄團增殖和懸浮細胞生長的影響，IAA、GA3對體細胞胚誘導與成熟的影響。試驗結果為通過調(diào)節(jié)外源激素的方式促進胚性胚柄團增殖、懸浮細胞生長和體細胞胚發(fā)生提供數(shù)據(jù)支持，為落葉松的規(guī)模化繁育奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以實驗室保存的生長狀態(tài)良好、外觀白嫩的日本落葉松胚性胚柄團為試驗材料。胚性胚柄團由子葉前期的未成熟合子胚誘導而來。供試胚性胚柄團誘導培養(yǎng)基：1/2DCR(含谷氨酰胺400 mg·L-1+水解酪蛋白500 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1)；凝固劑：瓊脂 5 g·L-1；外源激素：2,4-D 1.5 mg·L-1+6-BA 0.50 mg·L-1。培養(yǎng)條件：(24±1)℃，暗培養(yǎng)。

1.2 胚性細胞生長曲線的繪制

1.2.1 胚性胚柄團增殖的生長曲線 首先將生長狀態(tài)良好的約0.5 g胚性胚柄團接種至1/2DCR+2,4-D 0.15 mg·L-1固體增殖培養(yǎng)基上，(24±1)℃，暗培養(yǎng)。在每個培養(yǎng)皿中接種3塊，每次3皿，每2天測定1次鮮質量，試驗重復3次，以繪制日本落葉松胚性胚柄團的生長曲線。然后，用FDA(熒光素雙醋酸酯)染色觀察對數(shù)期胚性胚柄團在光學顯微鏡下的活性和細胞的形態(tài)結構。

1.2.2 懸浮細胞培養(yǎng)的生長曲線 先將生長狀態(tài)良好的約1 g胚性胚柄團按質量體積比0.25%接種至1/2DCR+2,4-D 0.15 mg·L-1液體培養(yǎng)基中，(24±1)℃，黑暗條件下120 r·min-1震蕩培養(yǎng)。接著每2天測定1次鮮質量，試驗重復3次，繪制日本落葉松懸浮細胞的生長曲線。最后，用FDA染色觀察對數(shù)期懸浮細胞在光學顯微鏡下的活性和細胞的形態(tài)結構。

1.3 體細胞胚誘導與成熟

首先將胚性胚柄團接種至1/2DCR+ABA 20 mg·L-1+AgNO310 mg·L-1+PEG4000 120 g·L-1固體體細胞胚誘導培養(yǎng)基中，(24±1)℃，暗培養(yǎng)。然后，在光學顯微鏡下觀察誘導出的體細胞胚在各發(fā)育時期的形態(tài)，培養(yǎng)42天后得到成熟子葉胚。

1.4 胚性胚柄團增殖培養(yǎng)中2,4-D、6-BA、ABA濃度的選擇

選擇2,4-D、6-BA、ABA各 3個濃度采用正交設計L9(34)(表1)進行試驗。首先將約0.5 g胚性胚柄團接種至含不同激素組合(表1)的1/2DCR固體培養(yǎng)基中，每個培養(yǎng)皿中接種3塊，每次3皿，(24±1)℃，暗培養(yǎng)。然后根據(jù)1.2.1生長曲線結果在接種后7、14、21天分別對胚性胚柄團稱重，統(tǒng)計鮮質量變化。最后將在9個處理下(表1)增殖培養(yǎng)14天的胚性胚柄團稱重后轉接到1.3中固體體胚誘導培養(yǎng)基(1/2DCR+ABA20 mg·L-1+AgNO310 mg·L-1+PEG4000 120 g·L-1)中，42天后統(tǒng)計每g胚性胚柄團成熟子葉胚的數(shù)量。以上試驗均重復3次。

表1 日本落葉松胚性胚柄團增殖培養(yǎng)正交試驗因素及水平L9(34)

1.5 懸浮細胞培養(yǎng)中2,4-D、6-BA濃度的選擇

選擇2,4-D、6-BA各3個濃度采用析因設計(表2)進行試驗。先將約1 g胚性胚柄團按質量體積比0.25%接種至含2,4-D和6-BA不同濃度組合(表2)的1/2DCR液體培養(yǎng)基中，(24±1)℃，黑暗條件下120 r·min-1震蕩培養(yǎng)。再根據(jù)1.2.2生長曲線的結果取培養(yǎng)7、14、21天的懸浮細胞測定細胞鮮質量。最后，將在9個處理(表2)下培養(yǎng)14天的懸浮細胞稱重后轉接到1.3中固體體胚誘導培養(yǎng)基(1/2DCR+ABA20 mg·L-1+AgNO310 mg·L-1+PEG4000 120 g·L-1)上，42天后統(tǒng)計每g懸浮細胞的成熟子葉胚的數(shù)量。以上試驗均重復3次。

表2 日本落葉松懸浮細胞培養(yǎng)試驗因素及水平

1.6 體細胞胚誘導與成熟中GA3、IAA濃度的選擇

將胚性胚柄團稱重后接種在分別添加0、10、20、30、40 mg·L-1的GA3和IAA的固體體胚誘導培養(yǎng)基(1/2DCR+ABA 20 mg·L-1+AgNO310 mg·L-1+PEG4000 120 g·L-1)中，每個培養(yǎng)皿中接種3塊，每次3皿，(24±1)℃，暗培養(yǎng)。以添加0 mg·L-1的GA3和IAA分別作為對照組，培養(yǎng)42天后統(tǒng)計每g胚性胚柄團成熟子葉胚的數(shù)量，研究GA3和IAA對體細胞胚誘導與成熟的影響，試驗重復3次。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

每g胚性胚柄團成熟子葉胚的數(shù)量=成熟子葉胚的數(shù)量/誘導前胚性胚柄團鮮質量；

每g懸浮細胞成熟子葉胚的數(shù)量=成熟子葉胚的數(shù)量/誘導前懸浮細胞鮮質量。

數(shù)據(jù)采用SPSS軟件對胚性胚柄團生長曲線、懸浮細胞生長曲線、GA3和IAA對體細胞胚發(fā)生的影響進行單因素方差分析；對正交設計和析因設計試驗結果進行多因素方差分析，LSD法對分析結果進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 胚性細胞的生長曲線

日本落葉松胚性胚柄團增殖和懸浮細胞培養(yǎng)均符合Logistic函數(shù)，生長曲線呈“S”型(圖1)。胚性胚柄團增殖在前8天內(nèi)為延遲期，8～16天內(nèi)為對數(shù)期，16天后進入平臺期(圖1A)。對數(shù)期的日本落葉松胚性胚柄團呈現(xiàn)白色半透明狀(圖2A)，F(xiàn)DA染色后的胚性胚柄團置于光學顯微鏡下觀察到有綠色熒光產(chǎn)生(圖2B)，這證明胚性胚柄團具有較好的細胞活性，通過觀察還發(fā)現(xiàn)胚性胚柄團的細胞團排列緊密并且具有由胚柄細胞及其頂端胚團細胞組成的原胚團結構(圖2B)。懸浮細胞的生長曲線與胚性胚柄團相似，懸浮細胞生長在前8天內(nèi)為延遲期，8～18天內(nèi)為對數(shù)期，18天之后是平臺期(圖1B)。對數(shù)期懸浮細胞在培養(yǎng)基內(nèi)均勻分布(圖2F)，將懸浮細胞用FDA染色后在光學顯微鏡下觀察到有綠色熒光(圖2G)，證明對數(shù)期懸浮細胞具有較好的細胞活性；懸浮細胞的細胞形態(tài)結構與胚性胚柄團不同，懸浮細胞的細胞團排列松散，雖同樣具有原胚團結構，但是部分胚柄細胞與頂端胚團細胞發(fā)生分離，且細胞更加飽滿(圖2G)。

圖1 日本落葉松胚性細胞鮮質量生長曲線

根據(jù)以上結果可以選擇7、14、21天3個時間點分別代表胚性胚柄團增殖和懸浮細胞生長的延遲期、對數(shù)期和平臺期。雖然對數(shù)期的胚性胚柄團和懸浮細胞的形態(tài)略有差異，但二者都具有較好的細胞活性和原胚團結構，具備體細胞胚發(fā)生的潛力。因此，胚性胚柄團增殖和懸浮細胞培養(yǎng)具有進一步研究的價值，胚性細胞增殖曲線的建立為后續(xù)研究外源激素對胚性胚柄團增殖和懸浮細胞培養(yǎng)的影響提供了依據(jù)。

2.2 體細胞胚誘導與成熟

誘導出的體細胞胚先經(jīng)歷球形胚早、中、晚期(圖2 C-E)再經(jīng)歷子葉胚早、中、晚期(圖2 H-J)的發(fā)育，最終形成成熟子葉胚。早期球形胚在接種1～5天形成，這一時期的體胚具有光滑的圓丘狀突起，胚頭部分呈淡黃色(圖2C)；中期球形胚在接種5～14天形成，體胚體積增大，顏色加深(圖2D)；晚期球形胚在接種14～21天形成，胚的頂部光滑并且略顯凹陷(圖2E)。早期子葉胚在接種21～28天形成，胚頂端出現(xiàn)子葉結構(圖2H)；中期子葉胚在接種28～35天形成，此時體胚子葉伸長(圖2I)；接種35～42天，形成晚期子葉胚，體胚子葉逐漸張開(圖2J)，然后逐漸發(fā)育為成熟子葉胚。經(jīng)歷42天的培養(yǎng)，體細胞胚經(jīng)一系列形態(tài)變化后最終發(fā)育成熟。

圖2 日本落葉松體細胞胚發(fā)生過程的形態(tài)學觀察

2.3 2,4-D、6-BA、ABA對胚性胚柄團增殖的影響

根據(jù)生長曲線結果分析第7、14、21天所代表的延遲期、對數(shù)期、平臺期的正交設計試驗結果。首先由圖3A可知7～21天胚性胚柄團的鮮質量隨著培養(yǎng)時間增加總體呈增加趨勢，2,4-D 0.15 mg·L-1(水平1)與原始生長曲線符合并且是第14天(對數(shù)期)時鮮質量最高的組合。圖中的各個水平在第14天均低于水平1，可能是6-BA和ABA與2,4-D組合抑制了鮮質量的增長，甚至有些組合改變了胚性胚柄團鮮質量的生長曲線。根據(jù)表3結果可以發(fā)現(xiàn)2,4-D、6-BA、ABA對胚性胚柄團在第7、14、21天增殖的影響均顯著(P<0.05)，且7、14、21天的極差分析結果表明影響胚性胚柄團增殖因素的主次順序為2,4-D>6-BA>ABA。此外，對數(shù)期是胚性胚柄團旺盛生長的階段，表3結果還表明在14天最佳的組合為2,4-D 0.15 mg·L-1+ABA 0.50 mg·L-1，這與圖3A結果不一致。因此，為驗證最佳激素濃度，將0.5 g胚性胚柄團在含2,4-D 0.15 mg·L-1+ABA 0.50 mg·L-1(記為水平10)培養(yǎng)基和2,4-D 0.15 mg·L-1(水平1)的培養(yǎng)基上同時接種，試驗結果證實第14天(對數(shù)期)時水平10鮮質量為2.63 g，高于水平1的2.46 g，因此增殖培養(yǎng)基含2,4-D 0.15 mg·L-1+ABA 0.50 mg·L-1時最有利于鮮質量增長。

得到上述結論后，進一步驗證激素對胚性胚柄團體胚發(fā)生能力的影響。圖3B結果表明在不同激素組合的增殖培養(yǎng)基中增殖14天的胚性胚柄團再轉接至體胚誘導培養(yǎng)基中誘導體胚，體胚發(fā)生能力差異顯著(P<0.05)，2,4-D 0.15 mg·L-1(水平1)培養(yǎng)的胚性胚柄團體胚發(fā)生能力最好。根據(jù)極差結果首先獲得影響體胚發(fā)生能力的因素主次順序為2,4-D>6-BA>ABA，然后據(jù)均值的結果得到了在試驗限定范圍內(nèi)最優(yōu)水平為2,4-D 0.15 mg·L-1+ABA 0.50 mg·L-1(表3)。表3最優(yōu)水平的結果與圖3B結果不同，為了進一步驗證，將同時接種在2,4-D 0.15 mg·L-1+ABA 0.50 mg·L-1(記為水平10)培養(yǎng)基和2,4-D 0.15 mg·L-1(水平1)培養(yǎng)基的14天的胚性胚柄團轉接到體胚誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)42天，結果表明胚性胚柄團在2,4-D 0.15 mg·L-1+ABA 0.50 mg·L-1(水平10)增殖培養(yǎng)后誘導的成熟子葉胚數(shù)量為每g 104.38個,高于99.47個(水平1)，因此選擇含2,4-D 0.15 mg·L-1+ABA 0.50 mg·L-1的增殖培養(yǎng)基有利于體細胞胚發(fā)生。體胚發(fā)生能力的試驗結果與鮮質量結果一致，綜合2個試驗，選擇2,4-D 0.15 mg·L-1+ABA 0.50 mg·L-1為胚性胚柄團增殖的最佳激素組合。

表3 外源激素對日本落葉松胚性胚柄團增殖和體胚發(fā)生的影響①

圖3 不同激素處理的日本落葉松胚性胚柄團的增殖及體胚發(fā)生

2.4 2,4-D、6-BA對懸浮細胞生長的影響

根據(jù)生長曲線分析第7天、14天、21天所代表的延遲期、對數(shù)期、平臺期的析因設計試驗結果。據(jù)圖4A結果首先可知7～21天懸浮細胞的鮮質量隨時間增加總體呈增加趨勢，其次雖然2,4-D 0.15 mg·L-1(水平1)與原始生長曲線符合，但是在第14天時2,4-D 0.15 mg·L-1+6-BA 0.15 mg·L-1(水平2)的鮮質量最高。與水平1相比，水平2的鮮質量在第7天和第14天高于水平1，第21天時與水平1沒有顯著差異，并且因為水平2的鮮質量在第14天遠低于其在第21天的鮮質量，所以水平2在14天仍處于對數(shù)期，這可能是由于水平2中6-BA與2,4-D配合使用促進了細胞鮮質量的增加。此外，由表4發(fā)現(xiàn)2,4-D和6-BA對懸浮細胞在14天時的鮮質量增長影響顯著(P<0.05)，且根據(jù)極差結果影響作用表現(xiàn)為2,4-D>6-BA。根據(jù)均值結果，14天最優(yōu)組合為2,4-D 0.15 mg·L-1+6-BA 0.30 mg·L-1，這與圖4A中水平3濃度一致，但在圖5中水平3鮮質量低于2,4-D 0.15 mg·L-1+6-BA 0.15 mg·L-1(水平2)，因此14天最佳激素組合為2,4-D 0.15 mg·L-1+6-BA 0.15 mg·L-1。表4與圖4A結果的差異可能是由于均值的估算結果是以不考慮激素間的交互作用和主次順序為前提進行的。

在得到有利于懸浮細胞鮮質量增長的激素組合后，研究不同激素處理14天的懸浮細胞在同一體胚誘導培養(yǎng)基條件下的體胚發(fā)生能力。根據(jù)圖4B結果發(fā)現(xiàn)不同激素處理14天的懸浮細胞體胚發(fā)生能力差異顯著(P<0.05)，2,4-D 0.15 mg·L-1+6-BA 0.15 mg·L-1(水平2)培養(yǎng)的懸浮細胞體胚發(fā)生能力最好。根據(jù)表4極差結果首先可以得到影響懸浮細胞體細胞胚發(fā)生的主次順序為2,4-D>6-BA。然后，表4的均值結果表明在試驗限定范圍內(nèi)最優(yōu)水平為2,4-D 0.15 mg·L-1+6-BA 0.30 mg·L-1，這一激素組合與圖4B中水平3一致。在圖4B中2,4-D 0.15 mg·L-1+6-BA 0.30 mg·L-1(水平3)低于2,4-D 0.15 mg·L-1+6-BA 0.15 mg·L-1(水平2)，因此2,4-D 0.15 mg·L-1+6-BA 0.15 mg·L-1有利于懸浮細胞的體細胞胚發(fā)生。綜合鮮質量和體胚發(fā)生能力的結果，認為懸浮細胞培養(yǎng)最佳激素組合為2,4-D 0.15 mg·L-1+6-BA 0.15 mg·L-1。

表4 外源激素對日本落葉松懸浮細胞鮮質量及體胚發(fā)生的影響

圖4 不同激素處理的日本落葉松懸浮細胞的鮮質量及體胚發(fā)生

2.5 GA3、IAA對體細胞胚誘導與成熟的影響

GA3和IAA對成熟子葉期體細胞胚數(shù)量的影響顯著(P<0.05)(圖5A、B)，添加10～20 mg·L-1GA3或IAA時誘導出的成熟子葉胚數(shù)量顯著升高，但高水平的IAA和GA3會使體胚發(fā)生受到抑制。因此，添加 10～20 mg·L-1GA3或IAA 進行體細胞胚誘導與成熟為最佳選擇。

圖5 外源激素對日本落葉松成熟子葉期體細胞胚數(shù)量的影響

3 討論

3.1 外源激素與胚性胚柄團的增殖

2,4-D和6-BA是胚性胚柄團增殖培養(yǎng)中常用激素，這2種激素可以通過對細胞周期的調(diào)控來調(diào)節(jié)細胞分裂從而影響胚性胚柄團鮮質量(Tangetal., 2004; 宋建, 2008; Biswasetal., 2019)。另外，增殖培養(yǎng)中2,4-D和6-BA的配合使用還可以調(diào)控體細胞胚內(nèi)儲藏蛋白質的積累、氮代謝和IAA水平等方面，從而影響胚性胚柄團的體胚發(fā)生能力(王偉達等, 2008; 宋建, 2008)。王偉達等(2008)發(fā)現(xiàn)在含有2,4-D 0.10 mg·L-1+6-BA 0.10 mg·L-1+KT 0.05 mg·L-1的BM培養(yǎng)基中培養(yǎng)的雜種落葉松(Larixkaempferi×L.olgensis)的增殖率最高，胚性胚柄團的增殖速率隨2,4-D濃度的升高而降低，6-BA的濃度對胚性胚柄團增殖的影響不明顯。在本研究中2,4-D濃度在0.15 mg·L-1時日本落葉松胚性胚柄團鮮質量在對數(shù)生長期最高，在0.50 mg·L-1時胚性胚柄團鮮質量較低，而6-BA濃度在0～0.15 mg·L-1時胚性胚柄團鮮質量差異不顯著。

ABA作為一種重要的植物激素，參與調(diào)節(jié)落葉松的體細胞胚發(fā)生。有研究認為ABA與胚性能力的啟動或表達有關(Kanniahetal., 1987)，在增殖階段添加外源ABA不僅可以使內(nèi)源游離氨基酸和蛋白質含量發(fā)生變化，提高胚性胚柄團的胚性(Ronaldetal., 1990)，還可以通過調(diào)控內(nèi)源生長素的合成及細胞周期蛋白的表達來影響細胞分裂(Wangetal., 2008; 袁冰劍等, 2014)。在華北落葉松胚性胚柄團增殖研究中，在S+B培養(yǎng)基中加入0.10 mg·L-1ABA，加快了胚性胚柄團的增殖(齊力旺, 2000)，但后續(xù)有關ABA對落葉松胚性胚柄團在增殖過程中體細胞胚發(fā)生能力影響的研究和應用較少。在本研究中發(fā)現(xiàn)添加ABA 0.50 mg·L-1可以提高日本落葉松胚性胚柄團對數(shù)期的鮮質量，顯著影響了胚性胚柄團的增殖和體細胞胚發(fā)生能力。

本研究結果表明了ABA對胚性胚柄團的增殖影響顯著，而在增殖過程中所需要的2,4-D均處于較低濃度，這一結果與齊力旺(2000)和王偉達等(2008)的研究結果一致。但是，試驗得到的具體濃度有所不同，這可能是由于多種原因導致的。首先，試驗中使用的基本培養(yǎng)基存在差異，本試驗中使用的培養(yǎng)基為1/2DCR培養(yǎng)基，而王偉達等(2008)和齊力旺(2000)使用的培養(yǎng)基分別為BM培養(yǎng)基和S+B培養(yǎng)基，不同培養(yǎng)基會對胚性胚柄團的增殖產(chǎn)生影響(梁文斌等,2011)。其次，落葉松屬不同種之間存在著物種差異性，所研究的樹種不同導致胚性胚柄團對激素的響應不同(張海峰, 2016)。此外，本研究在試驗中選擇的幾種激素較以往有所差異，王偉達等(2008)在增殖培養(yǎng)基中添加了KT而非本試驗中的ABA，由于激素間存在復雜的相互作用(袁晶等，2005；Vanstraelenetal.，2012)，這一條件的不同可能也會影響了其他激素最合適的用量，導致試驗結果存在差異。過去對于胚性胚柄團增殖的研究，通常只測定其鮮質量的變化，本研究中補充了胚性胚柄團的體細胞胚發(fā)生能力受激素的影響，并在結果中發(fā)現(xiàn)有利于體胚發(fā)生和鮮質量增加的激素濃度一致，但此研究結果僅限于日本落葉松，在落葉松屬其他種中有利于體胚發(fā)生和鮮質量增加的激素濃度是否與此一致尚需通過試驗來進一步確定。

3.2 外源激素與懸浮細胞培養(yǎng)

懸浮細胞培養(yǎng)中適宜的激素水平是實現(xiàn)細胞連續(xù)穩(wěn)定增殖的前提。2,4-D和6-BA對懸浮細胞生長調(diào)控的機制與對胚性胚柄團增殖的機制相似(Tangetal., 2004; 宋建, 2008; Biswasetal., 2019; 王偉達等, 2008; 夏啟中等, 2005a; 2005b; Heetal., 2018)。唐巍等(1996)在含有 2,4-D 1 mg·L-1+6-BA 0.50 mg·L-1+ IBA 0.20 mg·L-1的DCR液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)出火炬松(Pinustaeda)懸浮細胞。宋躍等(2018)在2,4-D 0.15 mg·L-1+6-BA 0.05 mg·L-1+KT 0.05 mg·L-1的BM培養(yǎng)基中成功獲得了長白落葉松(Larixolgensis)和2種雜種落葉松胚性懸浮細胞，但并未研究外源激素對懸浮細胞的影響。本試驗中發(fā)現(xiàn)日本落葉松懸浮細胞在2,4-D 0.15 mg·L-1+6-BA 0.15 mg·L-1增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)14天后對數(shù)期的鮮質量最高，再轉入體細胞胚誘導培養(yǎng)基體細胞胚發(fā)生能力最高。

本研究得到的2,4-D和6-BA濃度與唐巍等(1996)的結果差異較大，約是其使用外源激素水平的1/10，而與宋躍等(2018)所使用的外源激素總體水平相近；造成這一現(xiàn)象的主要原因應是物種間的差異，宋躍等(2018)培養(yǎng)的懸浮細胞同為落葉松屬，而唐巍等(1996)培養(yǎng)的是火炬松。此外，本試驗中使用的基本培養(yǎng)基和激素與已報道的研究(趙德修等，2000；袁晶等，2005；Vanstraelenetal.，2012)并不完全相同，同樣會造成差異的存在。由于本試驗僅考慮了2,4-D和6-BA 2種激素對日本落葉松懸浮細胞的影響，得到的試驗結果有一定的局限性，因此在后續(xù)研究中可以增加如IBA、NAA、KT等其他激素對日本落葉松懸浮細胞的影響，以得到鮮質量增長和體胚發(fā)生能力更高的懸浮細胞。

3.3 外源激素與體細胞胚成熟

目前，針對外源GA3和IAA對針葉樹體細胞胚發(fā)生影響的研究較少。落葉松的體細胞胚誘導同樣受物種差異和培養(yǎng)基的影響(宋躍等，2018；孫婷玉等，2019)，因此，本試驗得到的 GA3和IAA最佳濃度與梁芬(2016)和王俊英等(2001)的結果不同。本研究基于日本落葉松所得的研究結果GA3或IAA 10～20 mg·L-1有利于體細胞胚發(fā)生，是否適用于落葉松屬其他樹種，還需要進一步通過試驗來確定。

4 結論

外源激素對日本落葉松胚性胚柄團的增殖、懸浮細胞培養(yǎng)、體細胞胚誘導與成熟具有重要的調(diào)節(jié)作用。胚性胚柄團的增殖和懸浮細胞的生長均符合“S”型生長曲線，適宜胚性胚柄團增殖和懸浮細胞生長的激素濃度分別為2,4-D 0.15 mg·L-1+ ABA 0.50 mg·L-1和2,4-D 0.15 mg·L-1+6-BA 0.15 mg·L-1，證實了ABA應用于胚性胚柄團增殖階段的可行性，為胚性胚柄團快速增殖提供了固體增殖培養(yǎng)和懸浮細胞培養(yǎng)2種方式。在體細胞胚成熟階段，證明了GA3和IAA對日本落葉松體細胞胚成熟的影響，并且證實10～20 mg·L-1GA3或IAA可以顯著提高成熟子葉胚的數(shù)量，隨GA3或IAA濃度升高對體細胞胚發(fā)生具有抑制作用。本研究通過研究外源激素對體細胞胚發(fā)生的影響，不僅提升了體細胞胚的質量，還為今后研究外源激素調(diào)控落葉松體細胞胚發(fā)生的生理機制提供了數(shù)據(jù)支持。