3D打印肝腫瘤模型及其白術(shù)和薏米藥敏試驗(yàn)*

徐怡朦 唐 靚 王 晗 楊亞冬 趙思雨 張文元

1 杭州醫(yī)學(xué)院生物工程研究所，浙江省杭州市 310013； 2 杭州醫(yī)學(xué)院保健食品研究所； 3 杭州醫(yī)學(xué)院衛(wèi)生學(xué)研究所

導(dǎo)致肝癌預(yù)后較差的一個(gè)重要原因就是肝癌細(xì)胞易產(chǎn)生耐藥性[1]。當(dāng)前臨床經(jīng)驗(yàn)采用手術(shù)以及放療和化療的方式進(jìn)行治療，雖然對(duì)抑制肝癌細(xì)胞的增生起到了一定的效果，但往往同時(shí)對(duì)患者的身體產(chǎn)生較大的毒副作用，甚至對(duì)正常細(xì)胞產(chǎn)生一定的殺傷力[2]。在這種背景下，中醫(yī)或中西醫(yī)結(jié)合抗癌研究非?；钴S。中藥抗癌作用具有多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)、多效應(yīng)的特點(diǎn)，同時(shí)毒副作用相對(duì)較低，能提高機(jī)體免疫力，不易產(chǎn)生耐藥性[3]。中醫(yī)藥治療或中西醫(yī)結(jié)合治療肝癌被越來越多的患者所接受，中醫(yī)藥治療重視全身的整體治療，對(duì)患者產(chǎn)生的副作用小，利于改善患者的生命質(zhì)量。隨著臨床經(jīng)驗(yàn)的不斷豐富，中藥治療肝癌的方式逐步得到臨床的認(rèn)可，在肝癌的治療中發(fā)揮了重要作用[4-5]。

白術(shù)[6-7]和薏米[8-9]作為傳統(tǒng)中藥被廣泛使用，它們的主要化學(xué)成分有揮發(fā)油、多糖、內(nèi)酯類等，具有抗腫瘤、抗炎、調(diào)節(jié)消化系統(tǒng)等藥理作用。臨床常應(yīng)用于胃腸道疾病、心血管疾病、免疫系統(tǒng)疾病、肝臟疾病等治療。肝癌是我國(guó)常見的惡性腫瘤，具有惡性程度高、進(jìn)展快的特點(diǎn)。3D生物打印作為新型高通量藥篩平臺(tái)已經(jīng)成為臨床前藥物篩選的新的選擇方向。3D細(xì)胞培養(yǎng)相對(duì)于2D平面培養(yǎng)，藥物反應(yīng)、抗藥性程度以及藥物滲透水平等各方面更接近于體內(nèi)真實(shí)情況[10]，更能準(zhǔn)確反映人體用藥反應(yīng)[11]。本研究采用3D生物打印技術(shù)構(gòu)建SMMC-7721細(xì)胞 3D水凝膠類肝癌模型，并進(jìn)行白術(shù)和薏米兩種中藥醇提液的藥敏試驗(yàn)，為臨床上肝癌中醫(yī)治療提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝癌SMMC-7721細(xì)胞購自上海中科院細(xì)胞庫。白術(shù)和薏米(圖1)購自安徽省亳州市網(wǎng)上藥店藥掌柜，符合2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》。低糖DMEM培養(yǎng)基(Gibco，Lot:8119261)，胰蛋白酶(Sigma-Aldrich，批號(hào)：T4049)，海藻酸鈉(Sigma-Aldrich,Lot#SLBD5697v)，明膠(Sigma-Aldrich,Lot#SLBB0914v)，無水CaCl2(分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司,Lot.No.20150507)，鈣黃綠素-AM(calcein-AM，CAM，Solarbio，LotNO405A)、碘化丙啶(propidium iodide，PI，Solarbio, LotN1025A)。3D生物打印機(jī)(BioScaffolder2.1，GESIM公司，德國(guó))，CO2培養(yǎng)箱(HEPA Class100，Thermo)，熒光倒置顯微鏡(IX73，Olympus，日本)，3111型CO2培養(yǎng)箱(Thermo)，酶標(biāo)儀(Thermo公司)。96孔培養(yǎng)板(Corning)，25cm2培養(yǎng)瓶(Corning)。

白術(shù) 薏米圖1 白術(shù)和薏米

1.2 中藥醇提方法 白術(shù)和薏米提取物由下述步驟提取。稱取生藥30g，用去離子水清洗1遍，加40℃的去離子水1 000ml浸泡0.5h。將其全部置于砂鍋內(nèi)煎，將粗制的水煎液倒入燒杯，放于恒溫磁力攪拌器上80℃加熱濃縮藥液至50ml，靜置至室溫后封口于4℃沉淀過夜。之后收集上清液用于進(jìn)一步提取。待冷卻至室溫后邊攪拌邊緩慢加入適量95%乙醇溶液，使乙醇終濃度達(dá)到80%，4℃冰箱靜置過夜。1 000g離心10min分離沉淀和上清。上清收集后上80℃加熱，使乙醇充分蒸發(fā)，最后得醇提的濃縮液5ml，生藥含量為2.4g/ml。將分離得到的上清用0.22μm濾膜抽濾除菌后置于玻璃瓶?jī)?nèi)，4℃保存。

1.3 中藥醇提液對(duì)2D肝癌細(xì)胞培養(yǎng)的增殖抑制率及細(xì)胞存活率 SMMC-7721細(xì)胞長(zhǎng)到80%～90%融合后，用0.25%胰蛋白酶消化傳代培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SMMC-7721細(xì)胞懸液，通過臺(tái)盼蘭染色、計(jì)數(shù)，確認(rèn)細(xì)胞存活率>90%。取SMMC-7721細(xì)胞懸液以1×105cells/ml濃度接種96孔板，每孔100μl，培養(yǎng)24h；棄上清，分別加入2種中藥提取物配制的6種濃度的藥液(1.2、0.48、0.24、0.16、0.12、0.096g/ml)，200μl/孔，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化，并拍照記錄；48h后，吸棄上清，每孔加入500μg/ml MTT 100μl，37℃靜置避光培養(yǎng)4h，棄上清，每孔加入150μl二甲基亞砜；室溫振蕩10min使沉淀結(jié)晶完全溶解，酶標(biāo)儀490nm波長(zhǎng)檢測(cè)每孔的吸光度OD值。根據(jù)吸光度計(jì)算不同時(shí)間不同濃度的中藥對(duì)細(xì)胞的增殖抑制率，增殖抑制率IR(%)=(無藥物對(duì)照組OD值-藥物處理組OD值)/(無藥物對(duì)照組OD值-空白組OD值)×100%。細(xì)胞存活率CSR(%)=(1-增殖抑制率)×100%。

1.4 3D生物打印技術(shù)構(gòu)建肝癌模型 SMMC-7721細(xì)胞水溶膠共混物的制備：1.5g海藻酸鈉干粉、0.5g明膠干粉加于20ml生理鹽水中，低速攪拌混勻，形成水溶膠。每天70℃、30min水浴間歇滅菌，連續(xù)3d。然后將滅菌后的水溶膠與SMMC-7721細(xì)胞懸液5∶1混合，輕柔混勻，經(jīng)300g離心3min，使氣泡消失。得到細(xì)胞密度為2×107cells/ml的SMMC-7721細(xì)胞水溶膠共混物(簡(jiǎn)稱7721細(xì)胞共混物)。

3D生物打印是基于微流連續(xù)擠出的生物繪圖技術(shù)，進(jìn)行結(jié)構(gòu)體的CAD建模與控制參數(shù)。擬構(gòu)建內(nèi)部結(jié)構(gòu)為網(wǎng)格狀的結(jié)構(gòu)體，尺寸大小為8mm×8mm×0.5mm，該網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)體由圓柱狀微絲逐層交錯(cuò)堆積形成，微絲交錯(cuò)構(gòu)成的孔隙大小設(shè)定為200μm×200μm。3D生物打印成形過程的主要控制參數(shù):成形溫度8℃，打印噴頭內(nèi)徑為0.15mm，打印速率為15mm/s，擠出壓力200kPa，上升層高為0.15mm，料桶溫度37℃，與打印噴頭相連。

進(jìn)行3D生物打印肝癌7721細(xì)胞結(jié)構(gòu)體：將7721細(xì)胞共混物置于3D生物打印機(jī)的料桶中，按照預(yù)先設(shè)定的CAD數(shù)字模型及成形參數(shù)，由空氣氣壓推動(dòng)柱塞水溶膠擠出成形。將7721細(xì)胞共混物擠出圓柱狀微絲，逐層交錯(cuò)堆積于無菌6孔培養(yǎng)板中，形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)體。擠出的共混物因明膠的溫度敏感性發(fā)生物理交聯(lián)，由溶膠轉(zhuǎn)變?yōu)槟z。打印后立即用5%CaCl2溶液交聯(lián)5min，海藻酸鈉轉(zhuǎn)變?yōu)楹Ｔ逅徕}凝膠，使支架結(jié)構(gòu)得以穩(wěn)固，低糖-DMEM培養(yǎng)基漂洗3次。獲得半透明網(wǎng)格狀帶氣孔的、有較高孔隙率的肝癌7721細(xì)胞—海藻酸鈉—明膠三維結(jié)構(gòu)體，即肝癌模型。

1.5 中藥對(duì)3D肝癌模型中肝癌細(xì)胞增殖力的作用 將打印好的細(xì)胞結(jié)構(gòu)體(肝癌模型)置于96孔板，用完全培養(yǎng)基(含10%FBS)200μl/孔培養(yǎng)，隔天換液。實(shí)驗(yàn)組：肝癌模型中的肝癌細(xì)胞培養(yǎng)5d后去除廢液，PBS清洗,取不同濃度(1.2、0.48、0.24、0.16、0.12、0.096g/ml)的醇提中藥，200μl/孔培養(yǎng)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。加藥后再培養(yǎng)48h，除去廢液，PBS清洗，作為實(shí)驗(yàn)組。而對(duì)照組不加藥液，于培養(yǎng)7d后除去廢液，PBS清洗。進(jìn)行如下活/死細(xì)胞染色并計(jì)算細(xì)胞存活率。

活/死細(xì)胞染色：根據(jù)制造商說明書，熒光活/死染色法用于確定充滿細(xì)胞的3D結(jié)構(gòu)中的細(xì)胞活力。將上述SMMC-7721細(xì)胞結(jié)構(gòu)體在PBS中輕輕清洗3次，然后浸入染色液中。以PBS配置1μM calcein-AM和2μM PI染色液，對(duì)活細(xì)胞(綠色)和死細(xì)胞(紅色)進(jìn)行30min的避光染色。采用熒光倒置顯微鏡分別在488nm(calcein-AM的激發(fā)波長(zhǎng))和543nm(PI的激發(fā)波長(zhǎng))處進(jìn)行圖像采集，并合并這2個(gè)激發(fā)波長(zhǎng)的圖像。每種樣品隨機(jī)抽取三個(gè)視野。細(xì)胞存活率=活細(xì)胞總數(shù)/(活細(xì)胞總數(shù)+死細(xì)胞總數(shù))×100%。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism8統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析,使用非線性回歸和方差分析，組間兩兩比較，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用mean±SD表示，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SMMC-7721細(xì)胞2D與3D形態(tài)對(duì)比觀察 生長(zhǎng)在2D平板上的SMMC-7721細(xì)胞保持單層，呈現(xiàn)扁平形態(tài)，與平板緊密貼壁(圖2)。3D打印的7721細(xì)胞—海藻酸鈉—明膠3D結(jié)構(gòu)體，為半透明網(wǎng)狀高孔隙度3D結(jié)構(gòu)(圖3)。

圖2 光鏡下2D平面生長(zhǎng)的SMMC-7721細(xì)胞(×100，標(biāo)尺=100μm)

圖3 剛打印的3D結(jié)構(gòu)體支架

倒置顯微鏡觀察新打印的3D結(jié)構(gòu)體SMMC-7721細(xì)胞(0h)，細(xì)胞呈球形，表面光滑，均勻分布于水凝膠中(氣孔除外)。打印48h后，細(xì)胞仍為光滑的球形，靠近孔的細(xì)胞因營(yíng)養(yǎng)豐富而迅速增殖為多細(xì)胞簇。箭頭表示細(xì)胞之間緊密相連。打印96h后，觀察到孔附近的細(xì)胞已增殖為束狀多細(xì)胞簇。箭頭表示束狀多細(xì)胞簇(圖4)。

圖4 培養(yǎng)0h、48h、96h的3D SMMC-7721細(xì)胞(×100，標(biāo)尺=100μm)

2.2 2D培養(yǎng)條件下中藥對(duì)SMMC-7721細(xì)胞增殖的抑制率 為了找到SMMC-7721的最佳TCM及其最佳濃度，本實(shí)驗(yàn)測(cè)試了白術(shù)、薏米醇提液對(duì)2D環(huán)境中細(xì)胞的抑制作用。在2D培養(yǎng)條件下，SMMC-7721細(xì)胞對(duì)不同中藥及其不同濃度的敏感性存在顯著差異，白術(shù)提取物對(duì)肝細(xì)胞癌有更好的效果。薏米提取物在低濃度時(shí)(0.096、0.12g/ml)，促進(jìn)了SMMC-7721細(xì)胞生長(zhǎng)。隨著提取物濃度的增加，白術(shù)和薏米提取物對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制率增加(圖5)。

圖5 2D培養(yǎng)條件下白術(shù)和薏米提取物對(duì)SMMC-7721細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率

2.3 3D培養(yǎng)條件下中藥對(duì)SMMC-7721細(xì)胞存活的影響 3D培養(yǎng)的SMMC-7721細(xì)胞分別用白術(shù)、薏米醇提液處理48h后，通過雙熒光活/死染色發(fā)現(xiàn)：當(dāng)白術(shù)濃度為1.2g/ml和0.48g/ml時(shí)，沒有SMMC-7721細(xì)胞存活，死細(xì)胞邊緣不規(guī)則，部分細(xì)胞已經(jīng)碎片化。在濃度為0.24g/ml和0.16g/ml時(shí)，發(fā)現(xiàn)少量活細(xì)胞，但細(xì)胞起皺。在濃度為0.12g/ml和0.096g/ml時(shí)，活細(xì)胞數(shù)量略有增加，但大量活細(xì)胞仍處于萎縮狀態(tài)(圖6)。

當(dāng)薏米濃度為1.2g/ml時(shí)，SMMC-7721活細(xì)胞比例高于其他低濃度組，甚至高于空白對(duì)照組，而其他低濃度組無顯著差異。薏米高濃度會(huì)增加細(xì)胞的存活率。這與2D中發(fā)生的情況相反(圖6)。

通過圖6合成圖7。在3D培養(yǎng)條件下，白術(shù)醇提液的藥效明顯強(qiáng)于薏米。藥物濃度與細(xì)胞抑制率呈顯著的線性關(guān)系。薏米醇提液的作用較弱，且濃度與細(xì)胞抑制率之間沒有顯著的線性關(guān)系(圖7)。

圖6 3D培養(yǎng)條件下白術(shù)和薏米提取物對(duì)SMMC-7721細(xì)胞存活的影響(×100倍)

根據(jù)細(xì)胞存活率=(1-增殖抑制率)×100%，將圖5與圖7合并為圖8。白術(shù)提取物在2D和3D培養(yǎng)條件下都對(duì)SMMC-7721細(xì)胞具有良好的殺傷作用，兩者間差異不顯著，并且藥物濃度與細(xì)胞抑制率呈顯著線性關(guān)系。而薏米提取物對(duì)SMMC-7721細(xì)胞殺傷效果差，其濃度與細(xì)胞抑制率無明顯線性關(guān)系。使用非線性回歸得出IC50值：白術(shù)在2D條件下IC50值為0.114 7g/ml，3D條件下為0.074 2g/ml；薏米在2D條件下IC50值為0.160 8g/ml，3D條件下無IC50值；方差分析進(jìn)行二種中藥的2D與3D存活率比較，P值均<0.000 1。

圖7 3D培養(yǎng)條件下SMMC-7721細(xì)胞在白術(shù)和薏米提取物作用下的存活率

在3D培養(yǎng)條件下，白術(shù)醇提液的藥效明顯強(qiáng)于薏米。藥物濃度與細(xì)胞抑制率呈顯著線性關(guān)系。薏米醇提液的作用較弱，且濃度與細(xì)胞抑制率之間沒有顯著的線性關(guān)系(圖8)。

圖8 白術(shù)和薏米提取物在2D和3D條件下分別對(duì)SMMC-7721細(xì)胞作用的存活率*P<0.05 **P<0.01 ***P<0.001 ****P<0.000 1

3 討論

當(dāng)前臨床經(jīng)驗(yàn)采用手術(shù)以及放療和化療的方式進(jìn)行肝癌的治療，化療在綜合治療中占有重要的地位，雖然對(duì)抑制肝癌細(xì)胞的增生起到了一定的效果，但往往同時(shí)對(duì)患者的身體產(chǎn)生較大的毒副作用，人體對(duì)化療藥物的個(gè)體差異性也大，當(dāng)臨床確定患者對(duì)應(yīng)用的藥物不敏感時(shí)，患者已經(jīng)承受了極大的痛苦及嚴(yán)重的不良反應(yīng)，甚至殺傷了正常細(xì)胞[12-13]。在這種背景下，醫(yī)學(xué)專家把希望寄托在中藥抗癌研究上，尋求中醫(yī)或中西醫(yī)結(jié)合治療，中醫(yī)藥領(lǐng)域抗癌的研究異?；钴S。中藥可以通過誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡[14]、細(xì)胞周期阻滯和遷移抑制等方式，對(duì)肝癌的治療產(chǎn)生明顯的作用[15]。同時(shí)，由于中藥性質(zhì)比較溫和，對(duì)患者身體的損傷較小，中藥或與放化療相配合，可以提高患者生存質(zhì)量、改善體質(zhì)、緩解臨床癥狀、減輕放化療副作用[16-17]，可在今后臨床治療肝癌中推廣應(yīng)用，中西醫(yī)結(jié)合治療已經(jīng)成為重要的治療手段[18-19]。利用中藥活性成分研發(fā)新藥是我國(guó)藥物研究的特色和捷徑，尋找有效的中藥對(duì)改善肝癌患者預(yù)后具有極其重要的意義[20-21]。

腫瘤細(xì)胞的耐藥現(xiàn)象是影響化療療效和患者預(yù)后的重要因素之一[22]，導(dǎo)致肝癌預(yù)后較差的一個(gè)重要原因就是肝癌細(xì)胞易產(chǎn)生耐藥性。建立適合的體外耐藥模型是耐藥研究的關(guān)鍵。經(jīng)驗(yàn)性化療存在一定盲目性，而通過檢測(cè)腫瘤對(duì)化療藥物的敏感度，可合理聯(lián)合用藥，以“個(gè)體化”化療取代盲目性化療。

三維(3D)生物打印技術(shù)可將細(xì)胞與材料一起混合打印，細(xì)胞可深入基質(zhì)材料內(nèi)部，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞3D定位與控制，構(gòu)建更接近體內(nèi)癌細(xì)胞病變的3D腫瘤模型[11,23]，促進(jìn)抗癌藥物的篩選。3D培養(yǎng)組織細(xì)胞對(duì)外界,尤其是對(duì)藥物的抵抗力增強(qiáng)，可更準(zhǔn)確地反映候選藥物的效果[24]。海藻酸鈉和明膠基本滿足支架3D打印材料的要求。海藻酸鈉是從天然褐藻中提取的多糖，與細(xì)胞外基質(zhì)中的糖胺聚糖相似，具有良好的水溶性和生物相容性。海藻酸鈉可與鈣離子快速結(jié)合，在原位形成穩(wěn)定的凝膠[24]，細(xì)胞損傷小。其凝膠狀的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)提供了足夠的附著表面，使肝癌細(xì)胞在更接近生理的環(huán)境中生長(zhǎng)，這有助于細(xì)胞保持活性并分泌大量基質(zhì)。明膠是一種對(duì)溫度敏感的天然高分子材料，具有良好的生物相容性和生物降解性[25]。

已有研究表明，白術(shù)和薏米具有廣泛的抗腫瘤藥理活性，能協(xié)同化療藥物的治療，常作為抗腫瘤中藥使用。在本實(shí)驗(yàn)中，白術(shù)醇提液無論是在2D還是3D條件下對(duì)7721細(xì)胞的殺傷力效果都很好，但是在3D條件下，醇提液的藥效減弱幅度較大。2D與3D差異顯著，總體原因可能是由于水凝膠和3D細(xì)胞狀態(tài)引起的細(xì)胞表達(dá)的分子差異，以及細(xì)胞微環(huán)境的變化，導(dǎo)致2D培養(yǎng)細(xì)胞和3D培養(yǎng)細(xì)胞之間顯著不同的藥物作用結(jié)果。與2D和3D細(xì)胞培養(yǎng)相比，3D打印的SMMC-7721水凝膠結(jié)構(gòu)的耐化學(xué)性明顯增強(qiáng)。結(jié)果表明，維度對(duì)化療的有效性起著重要的作用。