壯藥龍盤止咳方對(duì)急性氣管-支氣管炎幼鼠模型IL-4/IFN-γ 和基質(zhì)金屬蛋白酶的影響

鄒 敏，韋 杏，農(nóng)志飛，梅小平，甘 娜，寧碧彩，蘇文靜

（1.廣西國(guó)際壯醫(yī)醫(yī)院，廣西 南寧 530200； 2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530001；3.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023）

急性氣管-支氣管炎是一種兒童常見(jiàn)支氣管黏膜炎癥，氣候變化或季節(jié)交替時(shí)易患此病，是肺炎的前期表現(xiàn)［1］。壯醫(yī)作為傳統(tǒng)醫(yī)藥的重要組成，文獻(xiàn)中無(wú)此病名記載，根據(jù)其臨床表現(xiàn)，與壯醫(yī)文獻(xiàn)中“勒爺奔唉”“埃病”相類似。壯醫(yī)認(rèn)為此病為外邪侵襲（主要由風(fēng)邪為主），阻滯于氣道，使氣道不通暢或者臟腑功能失調(diào)，“咪缽”（肺）調(diào)節(jié)功能失職［2］。龍盤止咳方是一種挖掘于壯族民間的壯醫(yī)復(fù)方，對(duì)急性氣管-支氣管炎的治療積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)，但其作用機(jī)制尚不明確。研究表明，多種細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)參與了急性支氣管炎的病理過(guò)程［3］，其中包括輔助性Th1/Th2 細(xì)胞因子或基質(zhì)金屬蛋白酶之間的失衡［4］?；谏鲜鲅芯勘尘?，本研究通過(guò)觀察血清白介素-4（interleukin4，IL-4）和干擾素-γ（interferon-gamma，IFN-γ）、肺金屬基質(zhì)蛋白酶9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）和金屬蛋白酶組織抑制因子-1（tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1）含量改變以探索壯醫(yī)藥防治兒童急性氣管-支氣管炎的藥理學(xué)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 3～4 周齡Wistar 幼鼠60 只，購(gòu)自廣西中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，體質(zhì)量80～100 g。動(dòng)物合格證：SYXK 桂2019-0001。Wistar 幼鼠飼養(yǎng)在本醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，控制溫度（22±2）℃、濕度（80±5）%和12 h 光照/黑暗周期循環(huán)，可自由獲取食物和水。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)過(guò)本醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 試劑與儀器 大鼠IL-4 試劑盒（批號(hào)：EK0406）和IFN-γ（批號(hào)：EK0374）試劑盒為武漢博士德公司產(chǎn)品；TRIzol RNA 提取液（批號(hào)：15596018）為美國(guó)Invitrogen 公司產(chǎn)品；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：RR036A、RR096B）為日本Takara 公司產(chǎn)品；MMP9 和TIMP-1（批號(hào)：ab76003、ab211926）抗體為美國(guó)Abcam公司產(chǎn)品；RIPA 裂解液（批號(hào)：WB-0071）、ECL 化學(xué)發(fā)光試劑（批號(hào)：CSB-K11714CL）為北京鼎國(guó)生物公司產(chǎn)品。Synergy HT 型酶標(biāo)儀為美國(guó)biotek公司產(chǎn)品，7500 型熒光定量PCR 儀為美國(guó)ABI公司產(chǎn)品，Gel Doc XR+型化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)為新加坡Biorad 公司產(chǎn)品。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)藥物 壯藥龍盤止咳方：本方由龍脷葉10 g，魚腥草10 g，不出林5 g，柿葉5 g，盤龍參5 g 組成，制備成濃度為2 g 生藥/mL 的混懸液。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

60 只Wistar 幼鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、急性氣管-支氣管炎模型組（模型組），低、中、高劑量壯藥龍盤止咳方治療組和陽(yáng)性治療組。對(duì)照組不做任何處理，模型組，壯藥龍盤止咳方低、中、高劑量治療組和陽(yáng)性治療組均制備急性氣管-支氣管炎模型。急性氣管-支氣管炎模型制備［4］：用煙葉及刨花各50 g 煙熏幼鼠，每天2 次，每次煙霧刺激30 min，共1 周。造模后壯藥龍盤止咳方低、中、高劑量組分別給予龍盤止咳方10、20、30 mL/（kg·d）治療1 周，陽(yáng)性治療組給予小兒宣肺止咳顆粒10 mL/（kg·d）治療1 周。治療1 周后腹腔注射10%水合氯醛麻醉幼鼠后，斷頭處死，采集幼鼠血清，打開(kāi)胸腔，分離肺組織。

1.3 指標(biāo)檢測(cè)

1.3.1 ELISA 法檢測(cè)血清IL-4 和IFN-γ 含量 收集幼鼠外周血，1500 r/min 離心15 min，收集血清-70 ℃保存。ELISA 操作步驟依照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.3.2 Real-time PCR 檢測(cè)MMP-9 和TIMP-1 mRNA 含量 用TRIzol RNA 提取幼鼠肺組織總RNA，并逆轉(zhuǎn)成cDNA，引物序列采用Primer 3.0 軟件設(shè)計(jì)，由上海生工生物公司合成，引物序列見(jiàn)表1。采用SYBR Green 法測(cè)定肺組織中MMP-9 和TIMP-1的相對(duì)mRNA 含量，具體步驟依照說(shuō)明書進(jìn)行。

表1 引物序列

1.3.3 蛋白免疫印跡檢測(cè)MMP-9 和TIMP-1 蛋白含量 用RIPA 提取幼鼠肺組織總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度后煮沸使蛋白變性，凝膠電泳分離總蛋白后并轉(zhuǎn)移至PVDF 膜。封閉后一抗按1∶2000 相應(yīng)稀釋比孵育4 ℃過(guò)夜，二抗室溫孵育后化學(xué)發(fā)光顯色拍照，并利用灰度軟件定量分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

通過(guò)SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示計(jì)量資料，采用單因素方差分析進(jìn)行多組間比較，兩兩比較用LSD-t 檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組幼鼠一般情況和體質(zhì)量變化情況比較

幼鼠在模型制備過(guò)程中逐漸出現(xiàn)扎堆瞇眼、咳嗽流涕、呼吸急促、反應(yīng)遲鈍、食欲減退、毛發(fā)無(wú)光澤等表現(xiàn)。與對(duì)照組比較，模型組幼鼠體質(zhì)量較輕（P＜0.05），經(jīng)壯藥龍盤止咳方或小兒宣肺止咳顆粒治療后幼鼠體質(zhì)量較模型組增加（P＜0.05），各治療組之間幼鼠體質(zhì)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 各組幼鼠體質(zhì)量變化情況

2.2 各組幼鼠血清IL-4 和IFN-γ 含量變化

與對(duì)照組比較，模型組幼鼠血清IL-4 升高，IFN-γ 降低（P＜0.05）；與模型組比較，低、中、高劑量組和陽(yáng)性治療組幼鼠血清IL-4 降低，IFN-γ 升高（P＜0.05）；與陽(yáng)性治療組比較，中、低劑量壯藥龍盤止咳方組幼鼠血清IL-4 和IFN-γ 含量無(wú)明顯變化（P＞0.05），高劑量組幼鼠血清IL-4 降低，IFN-γ 升高（P＜0.05）；隨著壯藥龍盤止咳方劑量的增加，幼鼠血清呈現(xiàn)IL-4 降低，IFN-γ 升高的趨勢(shì)。結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 各組血清IL-4 和IFN-γ 含量變化

2.3 各組幼鼠肺組織MMP-9 和TIMP-1 mRNA含量變化

與對(duì)照組比較，模型組幼鼠肺組織MMP-9 mRNA 含量升高，TIMP-1 mRNA 含量降低（P＜0.05）；與模型組比較，低、中、高劑量組和陽(yáng)性治療組幼鼠肺組織MMP-9 mRNA 含量降低，TIMP-1 mRNA 含量升高（P＜0.05）；與陽(yáng)性治療組比較，中、低劑量壯藥龍盤止咳方組幼鼠肺組織MMP-9和TIMP-1 mRNA 含量無(wú)明顯變化（P＞0.05），高劑量組幼鼠肺組織MMP-9 mRNA 含量降低，TIMP-1 mRNA 含量升高（P＜0.05）；隨著壯藥龍盤止咳方劑量的增加，幼鼠肺組織呈現(xiàn)MMP-9 mRNA 含量降低，TIMP-1 mRNA 含量升高的趨勢(shì)。結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 各組肺組織MMP-9 和TIMP-1 的mRNA 表達(dá)變化

2.4 各組幼鼠肺組織MMP-9 和TIMP-1 蛋白含量變化

與對(duì)照組比較，模型組幼鼠肺組織MMP-9蛋白含量升高，TIMP-1 蛋白含量降低（P＜0.05）；與模型組比較，低、中、高劑量組和陽(yáng)性治療組幼鼠肺組織MMP-9 蛋白含量降低，TIMP-1 蛋白含量升高（P＜0.05）；與陽(yáng)性治療組比較，低劑量組幼鼠肺組織MMP-9 蛋白含量升高，高劑量組幼鼠肺組織TIMP-1 蛋白含量升高（P＜0.05）；隨著壯藥龍盤止咳方劑量的增加，幼鼠肺組織呈現(xiàn)MMP-9 蛋白含量降低，TIMP-1 蛋白含量升高的趨勢(shì)（P＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 各組肺組織MMP9 和TIMP-1 蛋白表達(dá)變化

3 討論

急性氣管-支氣管炎是兒童常見(jiàn)的呼吸道疾病，其主要臨床表現(xiàn)為咳嗽、咯痰，常年均可發(fā)病，在氣候變化、季節(jié)交替時(shí)更易發(fā)病?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，受寒、過(guò)度疲勞或營(yíng)養(yǎng)不良時(shí)，機(jī)體抵抗力下降，氣管-支氣管生理防御機(jī)能也減弱［5］，在各種因素的作用下，可誘發(fā)本病。

研究報(bào)道，IL-4/IFN-γ 在急性氣管-支氣管炎的病理生理學(xué)基礎(chǔ)上發(fā)揮作用［6］，炎癥反應(yīng)過(guò)程存有輔助Th1/Th2 細(xì)胞因子之間的失衡。IL-4 和IFN-γ 分別是Th2 和Th1 分泌的兩種互為拮抗作用的細(xì)胞因子［7］，IL-4 作為一種多種生物學(xué)活性的淋巴因子，能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子表達(dá)，從而增強(qiáng)淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)合而引起炎癥細(xì)胞對(duì)局部組織浸潤(rùn)［8］，并對(duì)肺泡巨噬細(xì)胞具有趨化作用，使其產(chǎn)生花生四烯酸和超氧陰離子的能力增強(qiáng)，從而減輕炎癥反應(yīng)［9］。而IFN-γ 是目前作用機(jī)制比較明顯的促炎細(xì)胞因子，是單核/巨噬細(xì)胞主要且強(qiáng)有力的激活因子，促進(jìn)細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒反應(yīng)［10］；IFN-γ 還可增強(qiáng)腫瘤壞死因子對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的多種功能，研究表明，IFN-γ 的高表達(dá)加劇支氣管炎的炎癥反應(yīng)［11］?；|(zhì)金屬蛋白酶在氣道炎癥的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中也起到了重要作用，近年來(lái)認(rèn)為MMPs/TIMPs 比例失衡與支氣管炎的發(fā)生密切相關(guān)［12］。MMP-9 是MMPs 家族中的重要一員，在ECM 的降解、炎癥反應(yīng)及氣道重構(gòu)等多種生理病理過(guò)程中均扮演了重要角色。組織中MMP-9 的含量增加，可促進(jìn)ECM 的降解速度，基底膜斷裂，進(jìn)而促進(jìn)炎癥細(xì)胞溢出擴(kuò)散，聚集于呼吸道壁及呼吸道腔，加重其炎性反應(yīng)［13］，從而促進(jìn)肺部炎性疾病的發(fā)生發(fā)展。免疫復(fù)合物誘導(dǎo)MMP-9 基因缺陷小鼠，使其引起肺損傷，研究顯示，基因缺陷組小鼠肺部受損嚴(yán)重度小于對(duì)照組，揭示了MMPs 在肺組織損傷中起到了重要作用［14］。TIMP-1 是MMP-9 特異性生理性抑制物，可以抑制MMP-9 的生物學(xué)效應(yīng)，阻斷MMP-9 與底物結(jié)合，從而減少對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的降解。MMP-9/TIMP-1 比值的高低對(duì)呼吸道結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定起決定性作用，MMP-9 和TIMP-1 的動(dòng)態(tài)平衡目前被公認(rèn)為是反應(yīng)氣道及肺組織破壞與修復(fù)的標(biāo)志［15］。

本研究表明，急性氣管-支氣管炎幼鼠模型體質(zhì)量減輕，IL-4 升高/IFN-γ 降低、MMP-9 升高和TIMP-1 降低（P＜0.05），表明模型制備成功，且利用小兒宣肺止咳顆粒治療作為藥物治療的陽(yáng)性組，明確藥物治療能夠減低IL-4、升高IFN-γ，降低MMP-9 和升高TIMP-1 水平。

壯醫(yī)認(rèn)為此病為外邪侵襲（主要由風(fēng)邪為主），阻滯于氣道，使氣道不暢，“咪缽”（肺）調(diào)節(jié)功能失職，臨床以熱證、實(shí)證多見(jiàn)。因?yàn)橥庑扒忠u常以風(fēng)為先導(dǎo)，風(fēng)為陽(yáng)邪，化熱最速，小兒又為純陽(yáng)之體，陽(yáng)氣偏盛，感邪更易化熱，加上小兒先天肺脾虛弱，痰易滋生，若素有食積內(nèi)熱，或心肝火熱，或外感熱邪稽留，則可煉液成痰，痰熱互結(jié)，阻于氣道，肺失清肅發(fā)為痰熱咳嗽［16］。壯醫(yī)藥治療本病也有非常顯著的療效，但未見(jiàn)有相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道，這可能與壯醫(yī)藥的民族區(qū)域性有關(guān)，大多以口授身傳的方式傳授，影響了大家對(duì)壯醫(yī)的了解。壯藥治療各種疾病已有數(shù)千年的歷史，為廣西人民的醫(yī)療衛(wèi)生保障做出不可磨滅的貢獻(xiàn)，所以一些民間壯醫(yī)專家留下來(lái)的有效驗(yàn)方，值得我們進(jìn)一步深入研究，填補(bǔ)壯醫(yī)在此領(lǐng)域的空白。

本研究壯藥龍盤止咳方挖掘于壯族民間，它結(jié)合廣西環(huán)境氣候濕熱偏盛及小兒外感咳嗽以風(fēng)熱犯肺證為主的特點(diǎn)而選擇用藥，組成了具有“祛毒通氣、化痰止咳”作用的壯藥龍盤止咳方。本方由龍脷葉10 g，魚腥草10 g，不出林5 g，柿葉5 g，盤龍參5 g 組成。方中龍脷葉通氣道谷道、潤(rùn)肺止咳，主要用于埃?。人裕?，胸悶；魚腥草清熱解毒、排膿消癰、利尿通淋，可用于肺癰吐膿，痰熱咳喘；不出林通氣道、清熱毒、除濕毒，用于埃?。人裕?，比耐來(lái)（咳痰）；柿子葉調(diào)氣道、通龍路、止血，可用于埃病（咳嗽）；盤龍參通氣道、清熱毒、止咳化痰、消腫散結(jié)，主要用于埃?。人裕?，陰虛內(nèi)熱。諸藥合用奏“祛毒通氣、化痰止咳”之功，即解毒祛邪，調(diào)氣、通暢氣道，使得天地人三氣同步而達(dá)到治療兒童急性氣管-支氣管炎的功效。

研究表明，不同劑量的壯藥龍盤止咳方均能使得模型幼鼠體質(zhì)量增加（P＜0.05），但與陽(yáng)性治療組幼鼠體質(zhì)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。壯藥龍盤止咳方也能減低IL-4、升高IFN-γ，降低MMP-9 和升高TIMP-1，隨著壯藥龍盤止咳方劑量的增加，幼鼠IL-4 和MMP-9 降低，IFN-γ 和TIMP-1 升高（P＜0.05）。而與陽(yáng)性治療組比較，中、低劑量的壯藥龍盤止咳方治療組幼鼠各項(xiàng)指標(biāo)無(wú)明顯變化（P＞0.05），高劑量組幼鼠IL-4 減低、IFN-γ升高，MMP-9 降低和TIMP-1 升高（P＜0.05）。表明壯藥龍盤止咳方能夠達(dá)到小兒宣肺止咳顆粒同樣的治療效果，且高劑量的龍盤止咳方能夠更加顯著地抑制急性氣管-支氣管炎幼鼠模型的炎癥反應(yīng)。

綜上所述，本研究通過(guò)制備急性氣管-支氣管炎幼鼠模型，運(yùn)用免疫學(xué)及分子生物學(xué)等現(xiàn)代技術(shù)對(duì)各組幼鼠干預(yù)后炎癥反應(yīng)指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定與分析，客觀評(píng)價(jià)壯藥龍盤止咳方對(duì)急性氣管-支氣管炎幼鼠的干預(yù)效應(yīng)。后續(xù)將進(jìn)一步探討壯藥龍盤止咳方對(duì)急性氣管-支氣管炎的作用機(jī)制，為臨床推廣應(yīng)用提供理論依據(jù)。