銀杏內(nèi)生鏈格孢菌培養(yǎng)條件初探*

莊 華

（1.陜西省土地工程建設(shè)集團有限責(zé)任公司，陜西 西安 710075；2.陜西省土地工程技術(shù)研究院有限責(zé)任公司，陜西 西安710021；3.自然資源部退化及未利用土地整治工程重點實驗室，陜西 西安 710075；4.陜西省土地整治工程技術(shù)研究中心，陜西 西安 710075；5.陜西地建土地工程質(zhì)量檢測有限責(zé)任公司，陜西 西安 710082）

植物內(nèi)生真菌是與植物組織共生的一類真菌，它們可以產(chǎn)生與宿主類似的且具有生理活性的代謝產(chǎn)物[1]。近年來隨著銀杏栽培規(guī)模擴大，銀杏葉部病害的發(fā)生日趨嚴重，而內(nèi)生鏈格孢菌是銀杏葉部重要的內(nèi)生真菌之一[2-3]。本實驗初步探索不同營養(yǎng)、光照、pH值等培養(yǎng)條件下對鏈格孢菌菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響，為進一步研究銀杏鏈格孢菌奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

銀杏鏈格孢菌來自本實驗室，實驗前進行活化[4-5]。

1.1.2 供試植物

小麥、青稞、十大功勞和銀杏新鮮葉片。

1.1.3 PSA培養(yǎng)基

按文獻[3-4]的方法配制：胡蘿卜（去皮）200g，蔗糖20g，瓊脂20g，水1000mL。具體制作方法是：將200g胡蘿卜切成小條放入鋁鍋中，加入1000mL水，煮沸20～30min左右至胡蘿卜軟而不爛時，用6～8層紗布過濾，取濾汁于鍋中，補水至1000mL，加入瓊脂熔化，再加入糖攪拌均勻，趁熱分裝于試管中。

1.2 方法

1.2.1 接種培養(yǎng)及菌餅的制作

按文獻[4-5]的方法進行。在恒溫培養(yǎng)箱25℃培養(yǎng)60h～72h。當(dāng)菌絲體布滿培養(yǎng)皿后，在無菌條件下取直徑為7mm菌餅。

1.2.2 含不同植物葉片汁液的培養(yǎng)基制備及其對菌落生長的影響測定

分別稱取3-5g小麥、青稞、十大功勞和銀杏的新鮮葉片，切碎對應(yīng)放入500ml三角瓶中，再分別加入200ml蒸餾水，將三角瓶在微波爐加熱煮沸約30min，待冷卻后，用紗布過濾至三角瓶中，并稱取瓊脂粉3.5g，搖勻后加熱至瓊脂完全溶后定容，用三角瓶分成2份，一份加庶糖2g為一組，一份為不加蔗糖為一組。分別將菌餅接種到制備的2種不同處理培養(yǎng)基中，每組做6個重復(fù)，放置在25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h后，量取菌落直徑并計算菌絲生長速率[4]觀察并記錄菌落生長。

1.2.3 不同光照條件設(shè)定及對菌絲生長和孢子萌發(fā)的影響測定

接種的菌餅分別在直射光下、散射光下、黑暗條件下25℃培養(yǎng)，48h后量取菌落直徑，每組做6個重復(fù)。凹玻片懸滴法檢測孢子萌發(fā)：用無菌水將培養(yǎng)物制成孢子懸浮液，在XSP-2CB雙模顯微鏡（10×10）下觀察孢子濃度后，放置在25℃培養(yǎng)箱中，相對濕度90%-100%的條件下培養(yǎng)12h后統(tǒng)計分生孢子的萌發(fā)率，每組做6個重復(fù)。

1.2.4 不同pH值培養(yǎng)基制備及對菌絲生長和孢子萌發(fā)的影響測定

PSA培養(yǎng)基滅菌后待60℃-70℃時，測量其pH值后，相應(yīng)的用0.1mol/L HCl或0.1mol/L NaOH溶液調(diào)pH梯度分別為2～13，迅速倒皿，待其凝固后把菌餅分別接到制備的不同pH值培養(yǎng)基上，在25℃下培養(yǎng)72h后測量并記錄菌落直徑，每組做6個重復(fù)。按1.2.3中配制孢子懸浮液，pH調(diào)節(jié)到2～13的不同pH值梯度，采用凹玻片懸滴法，將培養(yǎng)物放在25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h，統(tǒng)計分生孢子的萌發(fā)率，每組做6個重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 含不同植物葉片汁液的培養(yǎng)基對菌絲生長和產(chǎn)孢的影響

含不同植物葉片汁液培養(yǎng)基培養(yǎng)的銀杏鏈格孢菌的生長特性見表1。實驗發(fā)現(xiàn)沒有加糖處理的菌落生長表現(xiàn)為菌絲體稀疏,同時，菌落的直徑偏小且產(chǎn)孢量也較少，而加糖的菌絲密度呈現(xiàn)出密集狀態(tài),表現(xiàn)為絮狀。顯而易見，糖分對鏈格孢菌菌絲體生長及分生孢子的產(chǎn)生具有促進作用。從表1結(jié)果可知,以含小麥、青稞、十大功勞等植物葉片汁液培養(yǎng)基的生長較差,而含銀杏葉片汁液培養(yǎng)基的生長情況明顯比前面幾種植物好，這也說明該菌在銀杏中寄生更加適合，由此說明，銀杏鏈格孢菌對培養(yǎng)基中不同營養(yǎng)成分具有一定的選擇性或適應(yīng)性。

表1 鏈格孢菌在含不同植物葉片汁液培養(yǎng)基上的生長特性

2.2 不同光照條件對菌絲生長和孢子萌發(fā)的影響

不同光照條件下處理后，菌絲體在散射光、黑暗條件下生長及孢子萌發(fā)優(yōu)于直射光處理。日平均生長速率和分生孢子萌發(fā)率結(jié)果見表2、表3。

表2 菌絲體在不同光照條件下的日平均生長速率

表3 分生孢子在不同光照條件下的萌發(fā)率

2.3 不同pH值對菌絲生長和孢子萌發(fā)的影響

pH值在5～9范圍時，菌絲體生長表現(xiàn)最適宜，當(dāng)pH值為5時生長明顯增快，70～72h后菌落直徑42.5～47.3mm，全皿可見；當(dāng)pH值為2時，發(fā)現(xiàn)只有在菌餅上有菌落。當(dāng)pH值為10～12范圍時，菌絲生長較緩慢，72h后迅速生長，試驗結(jié)果見表4。

表4 菌絲體在不同pH值下的生長速率及孢子萌發(fā)率

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)不同的培養(yǎng)條件對銀杏鏈格孢菌菌絲生長及孢子萌發(fā)有著很大差異，溫度、濕度和光照等培養(yǎng)條件影響其生長和繁殖[6-8]，菌絲體生長速率及孢子萌發(fā)率在直射光條件下弱于在散射光和黑暗條件下，這可能是菌絲體在生長過程中直射光光源太強，抑制了菌絲體的生長。同時，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌可能會產(chǎn)生酸性代謝產(chǎn)物而降低了培養(yǎng)基的pH值[9-10]。含不同植物的汁液培養(yǎng)基對銀杏鏈格孢菌的生長明顯有差異，但都能產(chǎn)生菌絲體，說明銀杏鏈格孢菌的營養(yǎng)范圍比較廣泛。了解內(nèi)生真菌的基本生長特性很有必要，本研究旨在為進一步研究銀杏鏈格孢菌奠定基礎(chǔ)。同時，為深入挖掘內(nèi)生真菌的資源利用提供重要技術(shù)支撐。