RYBP通過激活PARP-1 誘導(dǎo)Parthanatos增加食管鱗癌細(xì)胞對(duì)YM155的敏感性

柯 悅，李宇星，師小博，郭 偉，劉笑笑，王玉琛，阮琴利，潘紀(jì)元，楊曉平

(西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院：1. 腫瘤放療科；2. 胸外科，陜西西安 710004)

食管癌是常見的消化道惡性腫瘤，其發(fā)病率及死亡率分別位列全球惡性腫瘤的第7位和第6位。食管癌發(fā)病率具有明顯的地理分布差異，且兩種主要病理類型——鱗狀細(xì)胞癌和腺癌的病因完全不同。在許多低收入國家，如亞洲和撒哈拉以南的非洲地區(qū)，鱗狀細(xì)胞癌占食管癌總數(shù)的90%以上[1]。漸進(jìn)性吞咽困難是食管癌最主要的臨床表現(xiàn)，由于缺乏特異的癥狀和體征，許多患者在確診時(shí)已處于中晚期。對(duì)于不可手術(shù)切除的局部晚期食管癌，根治性同步放化療是其標(biāo)準(zhǔn)的治療方案。盡管如此，食管癌的5年總生存率為15%～25%[2]。因此，在傳統(tǒng)放化療的基礎(chǔ)上，尋找更有效的抗腫瘤藥物和潛在的分子靶點(diǎn)在食管癌未來的治療中十分關(guān)鍵。

RYBP(RING1 and YY1-binding protein)是多梳蛋白(Polycomb Group, PcG)家族成員之一，是一類在染色質(zhì)水平抑制靶基因轉(zhuǎn)錄的蛋白，在促進(jìn)凋亡、個(gè)體發(fā)育、細(xì)胞增殖、腫瘤發(fā)生發(fā)展及調(diào)節(jié)免疫等過程中發(fā)揮重要作用[3]。RYBP能與Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白(fas-associated protein with death domain, FADD)，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)8，Caspase-10相互作用促進(jìn)細(xì)胞死亡[4]，并與人類3型纖維連接蛋白和1型錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域蛋白(fibronectin type3 and ankyrin repeat domains protein1, FANK1)和凋亡素基因(apoptin)相互作用從而特異性誘導(dǎo)腫瘤相關(guān)凋亡[5-6]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，RYBP能通過下調(diào)G1-S期相關(guān)基因表達(dá)水平，從而抑制食管鱗癌增殖能力[7]。此外，對(duì)原發(fā)性肝癌、非小細(xì)胞肺癌的研究發(fā)現(xiàn)，RYBP能通過調(diào)節(jié)BCL2-Associated X的蛋白質(zhì)(Bax)，多聚ADP核糖聚合酶-1[poly(ADP-ribose)polymerase-1, PARP-1]，Caspase 8等誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并增加化療藥物的敏感性[8-9]。

YM155是存活素(survivin)的一種小分子轉(zhuǎn)錄抑制劑。在多種惡性腫瘤，如成人T細(xì)胞白血病、卵巢癌、腎癌中，YM155單用或聯(lián)合使用能抑制腫瘤生長，誘導(dǎo)凋亡，增加抵抗細(xì)胞的敏感性，并延長荷瘤裸鼠的生存[10-12]。研究顯示，YM155能通過激活PARP-1，進(jìn)而催化合成多聚ADP核糖[Poly-(ADP)ribose, PAR]，線粒體通透性改變，以及早期凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis-inducing factor, AIF)核漿轉(zhuǎn)位導(dǎo)致Parthanatos，從而抑制食管鱗癌細(xì)胞及荷瘤裸鼠移植瘤生長[13]。Parthanatos是一種依賴于PARP-1激活導(dǎo)致的細(xì)胞死亡，由Harraz命名(Thanatos：希臘神話中的死亡之神)，是一種新的細(xì)胞死亡形式，主要發(fā)生在中風(fēng)、心力衰竭、糖尿病、帕金森病及缺血再灌注等疾病[14-15]。既往研究顯示，RYBP過表達(dá)在原發(fā)性肝癌、肺癌中可致PARP-1激活從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[8-9]。而在食管癌中，RYBP過表達(dá)能否激活PARP-1，能否導(dǎo)致細(xì)胞通過Parthanatos途徑死亡從而增加食管鱗癌對(duì)YM155的敏感性是本研究探索的關(guān)鍵問題。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系及培養(yǎng)食管鱗癌細(xì)胞系KYSE170是由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院趙曉航教授課題組提供。細(xì)胞培養(yǎng)于含100 mL/L胎牛血清的1640培養(yǎng)基，放置在37 ℃，50 mL/L CO2培養(yǎng)箱內(nèi)。

1.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及過表達(dá)細(xì)胞系建立①將KYSE170細(xì)胞種在6孔板上，培養(yǎng)至90%左右；②根據(jù)RYBP及pCMV6質(zhì)粒(Origene，美國)濃度分別計(jì)算出所需加入質(zhì)粒體積(1 μg)；③配制轉(zhuǎn)染試劑：取10個(gè)1.5 mL管，分別加入150 μL Opi MEM，每2個(gè)管為一組，分別加入等體積的lipofectamine 2000(Invitrogen，美國)及質(zhì)粒標(biāo)記為A、B，常溫下放置5 min；④將每組中的A、B管混合，室溫放置40 min。用PBS清洗培養(yǎng)基2遍后，每孔加入700 μL Opti MEM，將混合溶液分別加入培養(yǎng)基中；⑤6 h后，加入200 mL/L FBS的1640完全培養(yǎng)基。放入細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)；⑥轉(zhuǎn)染24 h后，將細(xì)胞消化傳代至10 cm培養(yǎng)皿內(nèi)，待細(xì)胞貼壁后，使用含800 mg/mL的G418培養(yǎng)基進(jìn)行篩選至少2周，直至形成單克隆進(jìn)行培養(yǎng)，至細(xì)胞長滿保種并進(jìn)行后續(xù)鑒定。

1.3 蛋白提取及Western blotting檢測蛋白表達(dá)①細(xì)胞全蛋白采用RIPA裂解液(RIPA∶PMSF=100∶1)裂解細(xì)胞；細(xì)胞核蛋白、包漿蛋白及線粒體蛋白提取采用亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組提取試劑盒(Calbiochem，德國)提??；②上述蛋白提取液用BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒(赫特，中國)定量；③使用SDS-PAGE凝膠配置試劑盒配置8%～12%分離膠和4%濃縮膠，將30 μg蛋白質(zhì)上樣進(jìn)行凝膠電泳；④采用濕轉(zhuǎn)法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，110 V恒壓轉(zhuǎn)70 min；⑤采用80 mL/L脫脂牛奶室溫下封閉3 h后孵育相應(yīng)一抗：anti-RYBP(1∶1 000，Abcam，美國)，anti-PARP-1(1∶1 000，Cell Signaling Technology，美國)，anti-AIF(1∶500，Santa Cruz Biotechnology，美國)，anti-PAR(Merck Millipore，美國)，anti-β-actin(1∶3 000，Sigma-Aldrich，美國)，anti-Lamin B(1∶500，Santa Cruz Biotechnology，美國)，anti-GAPDH(1∶500，Santa Cruz Biotechnology，美國)；⑥洗膜后孵育辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗1 h并再次洗膜；⑦顯色。

1.4 CCK-8法檢測YM155對(duì)細(xì)胞抑制率將分別轉(zhuǎn)染RYBP質(zhì)粒和對(duì)照空載質(zhì)粒后的細(xì)胞以10 000個(gè)/孔的密度接種于96孔板，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后加入YM155，設(shè)置不同濃度梯度(2.216 5×10-3、4.432 9×10-3、8.865 8×10-3、17.731 6×10-3、35.463 2×10-3μg/mL)。加藥后繼續(xù)培養(yǎng)24和48 h，在終止實(shí)驗(yàn)前2 h每孔加入10 μL CCK-8試劑，于37 ℃，50 mL/L CO2避光孵育2 h，使用酶標(biāo)儀測量450 nm處的光密度值(D)。以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡將已轉(zhuǎn)染后的KYSE170細(xì)胞，加入8.865 8×10-3μg/mL YM155分別處理24、48 h，分別收集上清中和貼壁細(xì)胞，離心并使用預(yù)冷PBS清洗細(xì)胞備好樣品，后使用細(xì)胞凋亡試劑盒(B&D，美國)說明書操作，進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 免疫熒光實(shí)驗(yàn)①將已轉(zhuǎn)染的細(xì)胞培養(yǎng)至70%～90%時(shí)以5×105個(gè)/孔于6孔板內(nèi)進(jìn)行爬片，待細(xì)胞貼壁后，加入8.865 8×10-3μg/mL YM155處理12 h后更換為正常培養(yǎng)基，用室溫的2 mL PBS清洗2次。②40 g/L多聚甲醛固定30 min，PBS清洗甲醛3次。③0.1% Triton X-100 2 mL室溫覆蓋爬片10 min后，用1×PBS洗滌。④20 mL/L BSA溶液封閉30 min，1×PBS洗滌。⑤100 μL一抗于濕盒內(nèi)，4 ℃靜置孵育過夜。⑥用PBS洗3次后加入稀釋好的熒光標(biāo)記二抗，將玻片置于濕盒內(nèi)，避光，室溫孵育30 min。⑦PBS漂洗3次后使用DAPI封片，熒光顯微鏡下照相(熒光顯微鏡，Nikon ECLIPSE 80i C-SHG1，日本)。

2 結(jié) 果

2.1 過表達(dá)RYBP對(duì)YM155敏感性的影響分別用2.216 5×10-3、4.432 9×10-3、8.865 8×10-3、17.731 6×10-3、35.463 2×10-3μg/mL的YM155處理KYSE170-RYBP及KYSE170-Ctrl細(xì)胞24、48 h，CCK-8法檢測細(xì)胞存活率，計(jì)算IC50并繪制藥物劑量-抑制率柱狀圖。結(jié)果顯示，YM155處理24 h后，KYSE170-RYBP組和KYSE170-Ctrl的IC50分別為2.749 7×10-3μg/mL、17.810 5×10-3μg/mL；YM155處理48 h后，兩組的IC50分別為2.206 3×10-3μg/mL、17.759 1×10-3μg/mL(圖1，表1)。提示RYBP過表達(dá)能顯著增加YM155對(duì)食管鱗癌細(xì)胞KYSE170的抑制率。

圖1 不同濃度YM155分別處理24 h(A)，48 h(B)后KYSE170-Ctrl及KYSE170-RYBP細(xì)胞的抑制率Fig.1 The inhibition ratio of KYSE170-Ctrl and KYSE170-RYBP cells after indicated concentration of YM155 treatment for 24 (A) and 48 (B) hours*P<0.01, **P<0.001。

表1 YM155分別處理24及48 h KYSE170-Ctrl及KYSE170-RYBP細(xì)胞的IC50值Tab.1 IC50 of KYSE170-Ctrl and KYSE170-RYBP after YM155 treatment for 24 and 48 hours

2.2 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞死亡形式采用8.865 8×10-3μg/mL YM155分別處理KYSE170-Ctrl及KYSE170-RYBP 24、48 h后，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞死亡形式及百分比，結(jié)果顯示，KYSE170-RYBP組較KYSE170-Ctrl組的細(xì)胞死亡比例明顯增加，且存在凋亡及壞死兩種死亡形式(圖2)。

圖2 YM155處理后檢測細(xì)胞死亡形式及百分比Fig.2 Cell death pattern and percentage after YM155 treatment*P<0.01。

2.3 過表達(dá)RYBP后細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)水平的變化在食管鱗癌細(xì)胞KYSE170中外源性過表達(dá)RYBP，Western blotting檢測PARP1的表達(dá)水平明顯升高，而p53、Caspase8表達(dá)未見明顯增加(圖3A)。使用8.865 8×10-3μg/mL YM155分別處理12、24 h后，提取細(xì)胞總蛋白進(jìn)行Western blotting檢測，結(jié)果顯示，PARP-1的表達(dá)水平隨藥物作用時(shí)間明顯增加并出現(xiàn)活化切割條帶，KYSE170-RYBP組表達(dá)量及活化程度高于對(duì)照組；Caspase8的表達(dá)量在YM155作用24 h時(shí)出現(xiàn)活化，但未見明顯Caspase3的活化(圖3B)。

圖3 過表達(dá)RYBP后(A)，8.865 8×10-3μg/mL YM155處理24 h后(B)免疫印跡法檢測細(xì)胞死亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平變化Fig.3 Expression of cell death related protein after RYBP overexpression (A), and 8.865 8×10-3μg/mL YM155 treatment for 24 hours (B)

2.4 YM155處理后細(xì)胞組分蛋白質(zhì)水平的變化經(jīng)YM155處理后，分別提取線粒體及細(xì)胞核蛋白，Lamin B作為細(xì)胞核內(nèi)參，GAPDH作為線粒體蛋白內(nèi)參。結(jié)果顯示，經(jīng)YM155處理后，AIF由線粒體進(jìn)入細(xì)胞核，PAR在細(xì)胞核內(nèi)積累，且在RYBP過表達(dá)組上述變化更為顯著(圖4)。

圖4 YM155處理后細(xì)胞組分蛋白中AIF(A，B)，PAR(C，D)的表達(dá)水平變化Fig.4 Expressions of AIF (A, B) and PAR (C, D) in cytosolic fraction protein after YM155 treatment

2.5 YM155處理后免疫熒光檢測PAR及AIF表達(dá)為進(jìn)一步驗(yàn)證YM155處理后細(xì)胞內(nèi)AIF及PAR的改變，選擇KYSE170-RYBP細(xì)胞，并經(jīng)YM155處理12 h后進(jìn)行免疫熒光檢測。結(jié)果顯示，較未加藥組，YM155處理使PAR于細(xì)胞核內(nèi)聚積，AIF則部分由細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核(圖5)。

圖5 YM155處理后免疫熒光檢測AIF(A)，PAR(B)表達(dá)Fig.5 Translocation of AIF (A) and accumulation of PAR (B) in KYSE170-RYBP cell lines after YM155 treatment

3 討 論

放化療是不可手術(shù)的局部進(jìn)展期食管癌的主要治療手段，傳統(tǒng)的化療藥物包括鉑類、氟尿嘧啶及紫杉醇類，由于毒性及耐藥性導(dǎo)致其臨床應(yīng)用受到限制，使食管癌的整體預(yù)后仍較差。新型小分子抑制劑YM155在多種惡性腫瘤中顯示出良好的抗腫瘤作用，目前已有多項(xiàng)相關(guān)的Ⅱ期臨床試驗(yàn)正在開展。RYBP是一種在染色質(zhì)水平通過表觀遺傳修飾調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄因子，在胚胎發(fā)育過程發(fā)揮重要功能。近年來多項(xiàng)研究顯示，RYBP在多種惡性腫瘤中發(fā)揮著抗腫瘤效應(yīng)。本課題組前期通過構(gòu)建外源性過表達(dá)RYBP的食管鱗癌細(xì)胞系，證實(shí)RYBP能通過抑制細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換從而抑制食管鱗癌細(xì)胞增殖能力[7]。

本研究在前期研究構(gòu)建的RYBP過表達(dá)食管鱗癌細(xì)胞系及其對(duì)照組細(xì)胞中檢測凋亡相關(guān)蛋白，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)RYBP后能明顯增加PARP-1表達(dá)，但Caspase8及p53表達(dá)未見明顯增加。進(jìn)一步通過YM155處理細(xì)胞后，經(jīng)CCK8及流式分析檢測發(fā)現(xiàn)過表達(dá)RYBP組細(xì)胞對(duì)YM155的敏感性高于對(duì)照組，且細(xì)胞死亡形式包含凋亡及壞死兩種形式。為進(jìn)一步明確細(xì)胞的死亡途徑，使用YM155處理細(xì)胞后經(jīng)分別提取線粒體及細(xì)胞核蛋白，免疫印跡法顯示細(xì)胞核中PAR積累增多，AIF由線粒體進(jìn)入細(xì)胞核，且RYBP過表達(dá)組的上述效應(yīng)更為顯著。免疫熒光結(jié)果也證實(shí)這一假設(shè)。提示YM155處理后細(xì)胞經(jīng)Parthanatos途徑死亡，而RYBP可能是其死亡途徑中一個(gè)關(guān)鍵的調(diào)節(jié)蛋白。

在正常生理?xiàng)l件下，當(dāng)DNA受到損傷時(shí)，PARP-1通過識(shí)別有缺口的DNA，與之結(jié)合并激活，催化底物煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide, NAD+)轉(zhuǎn)化成為ADP核糖基化蛋白受體，后者與核受體蛋白結(jié)合形成多聚ADP核糖鏈，達(dá)到一定長度后降解產(chǎn)生聚ADP核糖，介導(dǎo)堿基切除修復(fù)復(fù)合物[(X射線交錯(cuò)互補(bǔ)修復(fù)基因(X-ray repair cross complementing group 1, XRCC1)為腳手架，與聚合酶β、DNA連接酶Ⅲ結(jié)合形成的復(fù)合物]參與DNA單鏈斷裂處的修復(fù)[16]。而在病理?xiàng)l件下，如中風(fēng)、缺血再灌注損傷或藥物作用下，PARP-1大量激活，并觸發(fā)Parthanatos。既往研究顯示，YM155能通過激活PARP-1誘導(dǎo)食管癌發(fā)生Parthanatos[13]。本研究及多項(xiàng)研究均發(fā)現(xiàn)，在惡性腫瘤中，RYBP過表達(dá)后能明顯增加PARP-1的表達(dá)水平，但在本研究發(fā)現(xiàn)未能激活Caspase家族，而RYBP是通過何種方式激活PARP-1，并在YM155的作用下增加食管鱗癌的Parthanatos，仍需進(jìn)一步的研究。

4 結(jié) 論

RYBP能通過激活PARP-1/AIF/PAR增加食管鱗癌細(xì)胞對(duì)YM155的敏感性，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生Parthanatos。