基于全方特征圖譜質(zhì)量表征的芩連制劑質(zhì)量評價研究

彭 平，熊少哲，張 蓓，易劍平，杜 菁，楊 璇，范國強，顧海鷗，王志斌*

1.北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠，北京 100079

2.中國北京同仁堂（集團）有限責任公司，北京 100079

芩連制劑所涉及的中成藥有芩連片、芩連膠囊、芩連丸，其處方由黃芩、連翹、黃連、川黃柏、赤芍、甘草6 味藥味組成，具有清熱解毒、消腫止痛的功效，其中芩連片收載于《中國藥典》2020年版，3 個劑型的芩連藥物處方制法均為黃芩、連翹、川黃柏、甘草合并提取，黃連、赤芍粉碎，混合后經(jīng)不同制劑工藝而得。

現(xiàn)有中成藥質(zhì)量標準中，對其原料的質(zhì)量控制包括黃連、赤芍藥味的顯微鑒別項，黃連、黃芩、赤芍藥味的薄層鑒別項，黃芩藥味的含量測定項。其中對黃連、川黃柏藥物的薄層鑒別項以鹽酸小檗堿為對照，缺失專屬性同時缺少對主要指標成分的定量測定[1]；對連翹、甘草藥味缺少相應的質(zhì)量控制方法。有文獻報道采用RP-HPLC 等色譜方法建立了芩連片中黃芩苷、鹽酸小檗堿、芍藥苷、甘草苷、連翹苷等指標性成分的含量測定方法，進一步完善了芩連片復方藥物的質(zhì)量控制[2-6]，但研究發(fā)現(xiàn)不同芩連制劑中指標性成分含量差異較大，普通液相色譜法受限于最低檢測限和測定回收率范圍，難以實現(xiàn)對芩連制劑整體質(zhì)量表征的廣泛測定；且現(xiàn)有研究方法對組方藥物質(zhì)量的控制還有遺漏，不能有效控制川黃柏、赤芍藥味的特征性質(zhì)量。

經(jīng)過對芩連制劑處方藥味原料質(zhì)量研究的相關(guān)文獻分析發(fā)現(xiàn)，赤芍、川赤芍及其易混品白芍藥材質(zhì)量差異成分包括芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、1,2,3,4,6-五-O-倍酰-D-葡萄糖（PGG）[7-10]，黃連和川黃柏及關(guān)黃柏質(zhì)量差異成分是鹽酸黃柏堿、鹽酸巴馬汀[11-13]，綜合連翹、黃芩、甘草藥材的《中國藥典》指標性成分連翹苷、連翹酯苷A、甘草苷、甘草酸、黃芩苷、漢黃芩苷以及鹽酸小檗堿，共計12 個指標性成分含量是芩連片質(zhì)量評價的主要指標[14-19]。因此，本實驗將采用分離效能和靈敏度均較高的UPLC-PDA 色譜法[20]，以芩連片為研究載體，建立其特征圖譜質(zhì)量表征方法，同時測定芩連片中12個指標成分的含量，并應用于該類中成藥的質(zhì)量評價之中，為其質(zhì)量表征與控制提供方法支持。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters Acquity HClass 超高效液相色譜儀，包括四元溶劑管理器，PAD 檢測器，在線溫度控制器，樣品管理器，Empower 工作站，美國Waters 公司；KQ-250 DE 型數(shù)控超聲波清洗機，昆山超聲儀器有限公司；Mettler ML 204 型電子分析天平、Mettler XP 205 型電子分析天平，瑞士梅特勒-托利集團；0.22 μm 微孔濾膜，天津津騰實驗設(shè)備有限公司。

1.2 材料

試藥：乙腈，默克公司，色譜純；甲酸，分析純，天津光復精細化工研究所；乙酸銨，分析純，南開大學精細化學實驗廠；超純水，Milli-Q 超純水儀制備。

對照品：鹽酸小檗堿（質(zhì)量分數(shù)86.7%，批號110713-201814）、鹽酸巴馬汀（質(zhì)量分數(shù)86.8%，批號110732-201611）、鹽酸黃柏堿（質(zhì)量分數(shù)95.8%，批號111895-201303）、黃芩苷（質(zhì)量分數(shù)93.3%，批號110715-201318）、漢黃芩苷（質(zhì)量分數(shù)98.5%，批號112002-201702）、甘草酸按（質(zhì)量分數(shù)93.0%，批號110731-201619）、甘草苷（質(zhì)量分數(shù)93.7%，批號111610-201106）、芍藥苷（質(zhì)量分數(shù)95.1%，批號110736-201943）、連翹酯苷A（質(zhì)量分數(shù)94.1%，批號 111810-201405）、鹽酸黃連堿（質(zhì)量分數(shù)95.1%，批號112026-201601）均購自中國食品藥品檢定研究院；芍藥內(nèi)酯苷（質(zhì)量分數(shù)≥98%，批號YZ3O10H101115）、連翹苷（質(zhì)量分數(shù)98%，批號Z17A8X34077）、表小檗堿（質(zhì)量分數(shù)98%，批號W06M8Z30708）、連翹酯素（質(zhì)量分數(shù)97%，批號YZ3O10H101115）、PGG（質(zhì)量分數(shù)98%，批號P28M9F54631）購自上海源葉生物科技有限公司。

研究用飲片：黃連Coptis chinensisFranch、黃柏Phellodendron chinenseSchneid（川黃柏）、連翹Forsythia suspensa(Thunb.) Vahl（青翹）、黃芩Scutellaria baicalensisGeorgi、甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.、赤芍Paeonia lactifloraPall.均由北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司提供，由北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司工程師劉博譞鑒定，均符合《中國藥典》2020年版要求。

芩連制劑中成藥樣品：芩連片，北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠（S1、S2）、牡丹江靈泰藥業(yè)股份有限公司（S3）、哈爾濱三木制藥廠（S4、S5）、山東孔府制藥有限公司（S6）；芩連膠囊，成都迪康藥業(yè)股份有限公司（S7、S8）、吉林敖東集團力源制藥股份有限公司（S9、S10）；芩連丸，四川旭華制藥有限公司（S11）均為市場購買，生產(chǎn)廠家分別編號M1～M7。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品處理方法

2.1.1 對照品溶液的制備 分別用70%甲醇配制供定量用的對照品溶液，取連翹酯苷A、鹽酸黃柏堿、芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、甘草苷、黃芩苷、PGG、連翹苷、鹽酸小檗堿、巴馬汀、甘草酸、漢黃芩苷對照品適量，精密稱定，加70%甲醇制成含連翹酯苷A 20 μg/mL、鹽酸黃柏堿15 μg/mL、芍藥內(nèi)酯苷20μg/mL、芍藥苷350 μg/mL、甘草苷20 μg/mL、黃芩苷450 μg/mL、PGG 25 μg/mL、連翹苷20 μg/mL、鹽酸小檗堿250 μg/mL、巴馬汀30 μg/mL、甘草酸50 μg/mL、漢黃芩苷100 μg/mL 的混合對照品溶液，即得。

2.1.2 供試品溶液的制備 取裝量差異項下芩連制劑成品約10 g，磨成細粉，取約0.5 g，精密稱定，置于具塞三角瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流處理90 min，放冷，用提取溶劑補足減失的質(zhì)量，用0.22 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.2 芩連制劑特征圖譜質(zhì)量表征方法

2.2.1 色譜條件 色譜柱為Waters Cortecs T3 柱（100 mm×2.1 mm，1.6 μm）；柱溫30 ℃；流動相乙腈（含0.02%甲酸，A）-（10 moL/L 乙酸銨-0.09%甲酸緩沖液，B），梯度洗脫：0～10 min，10%～12%A；10～11 min，12%～15% A；11～18 min，15%～16% A；18～32 min，16% A；32～35 min，16%～19% A；35～40 min，19%～21% A；40～45 min，21%～50% A；45～48 min，50%～90% A；48～52 min，90%A；52～55 min，90%～10% A；55～60 min，10% A；體積流量0.3 mL/min；檢測波長230 nm（連翹酯苷A 含量測定檢測波長330 nm）；進樣體積1 μL。

2.2.2 系統(tǒng)適用性 取對照品溶液和供試品溶液適量，在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定，結(jié)果見圖1、2，結(jié)果表明，理論塔板數(shù)按黃芩苷峰計均大于30 000，12 個主要指標性成分色譜峰的分離度均大于1.5，表明系統(tǒng)適用性符合相關(guān)測定要求。

2.2.3 特征峰指認 分別取芩連制劑處方6 味藥物，采用已建立的樣品處理方法，在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定，標記了38 個含量較高且色譜分離效果穩(wěn)定的特征色譜峰，采用對照品標記了其中15 個主要色譜峰化學結(jié)構(gòu)。其中包括黃連特征峰3個，黃柏特征峰1 個，黃連、黃柏同源特征峰6 個，赤芍特征峰7 個，連翹特征峰8 個，黃芩特征峰11個，甘草特征峰2 個。結(jié)果見表1。

圖1 芩連制劑樣品 (S1) 的全方特征指紋圖譜Fig.1 Whole prescription characteristic spectrum of Qinlian preparation sample (S1)

圖2 12 個指標成分混合對照品溶液色譜圖Fig.2 Chromatograms of solutions of 12 index ingredients mixed control solution

2.2.4 指標性成分含量測定專屬性考察 按照芩連制劑處方配比，分別配制芩連制劑缺黃芩、缺黃連和黃柏、缺黃柏、缺黃連、缺連翹、缺赤芍、缺甘草陰性樣品，按照芩連制劑供試品處理方法處理各芩連制劑陰性樣品溶液，在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定，見圖3、4。在本色譜條件下，檢測波長為230 nm 下赤芍中指標性成分芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、PGG 色譜峰處無明顯干擾，黃連中指標性成分鹽酸巴馬汀色譜峰處無明顯干擾，黃柏中指標性成分鹽酸黃柏堿色譜峰處無明顯干擾，黃柏和黃連中指標性成分鹽酸小檗堿色譜峰處無明顯干擾，連翹中指標性成分連翹苷色譜峰處無明顯干擾，甘草中指標性成分甘草苷、甘草酸色譜峰處無明顯干擾，黃芩中指標性成分黃芩苷、漢黃芩苷色譜峰處無明顯干擾；檢測波長330 nm 下連翹中指標性成分連翹酯苷A 色譜峰無明顯干擾。

表1 芩連制劑特征圖譜中38 個特征峰信息Table 1 Information of 38 characteristic peaks in characteristic map of Qinlian preparation

2.2.5 精密度考察 取同一芩連制劑供試品溶液，在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定，連續(xù)進樣6 針測定，記錄芩連制劑特征圖譜中38 個特征峰峰面積和保留時間，得芩連制劑供試品溶液特征圖譜中38個特征峰峰時間和峰面積的精密度結(jié)果，各色譜峰相對保留時間和峰面積RSD 值均小于3%，表明儀器精密度符合要求。

2.2.6 穩(wěn)定性考察 取同一芩連制劑供試品溶液，在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定，分別于超聲處理后0、3、6、9、12、24 h 進樣，記錄芩連制劑特征圖譜中38 個特征圖譜峰面積，得芩連制劑供試品溶液特征圖譜中38 個特征峰峰面積和相對保留時間的穩(wěn)定性結(jié)果，各色譜峰峰面積RSD 值均小于5%，表明方法穩(wěn)定性符合要求。

圖3 檢測波長230 nm 下芩連制劑陰性樣品與混合對照品液相色譜圖對比圖Fig.3 Chromatograms of negative samples of Qinlian preparation under detection wavelength of 230 nm compared with those of mixed controls

圖4 檢測波長330 nm 下芩連制劑陰性樣品與連翹酯苷A 對照品液相色譜圖對比圖Fig.4 Chromatograms comparison of negative sample of Qinlian preparation with forsythoside A standard under detection wavelength of 330 nm

2.2.7 線性關(guān)系考察 分別配制質(zhì)量濃度為連翹酯苷A 897.0 μg/mL、鹽酸黃柏堿804.7 μg/mL、芍藥內(nèi)酯苷576.6 μg/mL、芍藥苷739.9 μg/mL、甘草苷816.7 μg/mL、PGG 1 059.3 μg/mL、連翹苷982.4μg/mL、鹽酸小檗堿982.5 μg/mL、巴馬汀733.6μg/mL、甘草酸77.9 μg/mL、漢黃芩苷439.2 μg/mL的對照品溶液儲備液，分別取各對照品儲備液采用70%甲醇溶液稀釋2、2.5、5、10、20、50、100、200 倍進樣，配制質(zhì)量濃度為287.1 μg/mL 黃芩苷對照品溶液分別進樣0.2、0.6、0.8、1.0、1.4、1.8、2.2 μL，以進樣量為橫坐標（X），對照品峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線。建立色譜峰峰面積對進樣量的回歸方程（表2），結(jié)果表明，各指標成分在檢測的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.8 重復性考察 分別取芩連片、芩連膠囊、芩連丸樣品各6 份，分別按樣品處理方法制備樣品溶液，在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定，記錄芩連制劑特征圖譜中38 個指標性成分色譜峰面積，得芩連制劑供試品溶液特征圖譜中38 個特征峰峰面積和相對保留時間的重復性結(jié)果，各特征峰面積和相對保留時間RSD 值均小于5%，采用外標法計算樣品中12 個指標性成分含量，結(jié)果見表3。

表2 12 個指標性成分線性回歸方程Table 2 Linear regression equation of 12 exponential components

2.2.9 加樣回收率考察 取已知指標性成分含量的3 種芩連制劑粉末各6 份，每份250.0 mg，參考“2.2.8”項下重復性含量測定結(jié)果，按照中間質(zhì)量濃度加樣回收率測定方法，分別加入25 mL 含有相應對照品質(zhì)量濃度的70%甲醇，稱定質(zhì)量，加熱回流處理90 min，放冷，用70%甲醇溶液補足減失的質(zhì)量，用0.22 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定。根據(jù)“2.2.8”項下重復性考察測得的各成分的量，計算各成分的加樣回收率和RSD，結(jié)果見表4，12 個指標性成分回收率在83.58%～106.76%。

2.3 多批次芩連制劑質(zhì)量測定結(jié)果

2.3.1 芩連制劑特征圖譜質(zhì)量表征結(jié)果 取11 批不同廠家生產(chǎn)芩連制劑樣品，按照已建立的樣品處理方法，在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定。各研究用樣品均可檢出38 個特征色譜法，各樣品特征圖譜結(jié)果見圖5。記錄峰面積值，以黃芩苷色譜峰（峰20）為參比峰（s），計算38 個色譜峰相對峰面積比值，見表5。

2.3.2 芩連制劑中12 個指標成分的含量測定結(jié)果采用已建立的分析方法，測定11 份芩連制劑中12個指標性成分質(zhì)量分數(shù)，結(jié)果見表6。

表3 芩連制劑指標性成分含量測定重復性結(jié)果Table 3 Repeatability results of determination of index components in Qinlian preparation

表4 芩連制劑指標性成分含量測定回收率考察結(jié)果Table 4 Test results of recoveries for determination of index compounds of Qinlian preparation

圖5 11 批芩連制劑樣品特征圖譜Fig.5 Sample characteristics profiles of 11 batches of Qinlian preparation

表5 11 批芩連制劑樣品特征圖譜相對峰面積測定結(jié)果Table 5 Determination of relative peak area of 11 batches of samples from Qinlian preparation

續(xù)表5

表6 11 份芩連制劑中12 個指標性成分含量測定結(jié)果Table 6 Determination of 12 index ingredients in 11 samples of Qinlian preparation

2.4 多批次芩連制劑樣品質(zhì)量分析

2.4.1 芩連制劑樣品整體質(zhì)量分析 采用SIMCA 13.0 統(tǒng)計分析軟件PCA-X，OPLS-DA 分析方法，以芩連制劑特征圖譜中38 個特征峰的相對峰面積比值及其12 個指標性成分含量為質(zhì)量表征數(shù)據(jù)，分析11 份芩連制劑質(zhì)量分布狀況。

如圖6所示，在無監(jiān)督模型下（PCA-X），11批次芩連制劑整理質(zhì)量分布按聚集程度分為3 類：第1 類包括S1～S3（片劑）、S6～S8（片劑、膠囊劑）、S11（丸劑）；第2 類包括S4～S5（片劑）；第3 類包括S9～S10（膠囊劑）。

圖6 無監(jiān)督模型下11 批次芩連制劑特征圖譜質(zhì)量表征分布散點圖Fig.6 Scatter plot of quality characterization profiles of 11 batches of Qinlian preparation under unsupervised model

圖7 以生產(chǎn)廠家為分類的有監(jiān)督模型下11 批次芩連制劑特征圖譜質(zhì)量表征分布散點圖Fig.7 Scatter plot of quality characterization distribution of 11 batches of Qinlian preparations under a supervised model classified by manufacturer

圖8 以生產(chǎn)廠家為分類的有監(jiān)督模型下11 批次芩連制劑特征成分VIP 得分圖Fig.8 VIP score chart of characteristic components of 11 batches of Qinlian preparations under a supervised model classified by manufacturer

如圖7所示，在以生產(chǎn)廠家為分類的監(jiān)督模型下（OPLS-DA），11 批芩連制劑整體質(zhì)量分布趨勢，與無監(jiān)督模型下一致（第1 類：S1～S2 廠家1，S3廠家2，S6 廠家4，S7～S8 廠家5，S11 廠家7；第2 類：S4～S5 廠家3；第3 類：S9～S10 廠家6）；如圖8所示，質(zhì)量差異成分VIP 值得分高于1.0 的指標成分有13 個，依次為（VIP 值1.6～1.0 從大到?。悍?2（黃芩）、2（赤芍）、36［連翹（連翹酯素）］、21［赤芍（PGG）］、8（黃連、川黃柏）、3（連翹）、25（黃連）、38（黃芩）、7［赤芍（芍藥內(nèi)酯苷）］、30（連翹）、27（黃芩）、24（黃連）、4（黃連、川黃柏）；質(zhì)量分類的相關(guān)成分主要來源于：黃芩（峰22、38、27），赤芍［峰2、21（PGG）、7（芍藥內(nèi)酯苷）］，連翹［峰36（連翹酯素）、30）］，黃連（峰24），黃連-川黃柏（峰8、4），連翹-赤芍（峰3）。

2.4.2 芩連制劑樣品指標性成分的含量分析 根據(jù)指標性成分來源，分別對11 批芩連制劑中各藥味指標性成分含量進行分析，統(tǒng)計11 批次芩連制劑中各指標性成分含量范圍，計算最大含量和最小含量倍量關(guān)系，見表5；12 個指標成分含量差異范圍為2～71 倍，根據(jù)各指標成分含量范圍最大值與最小值的差量倍數(shù)依次從大到小排序為芍藥內(nèi)酯苷（71.38倍）＞連翹酯苷A（43.24 倍）＞連翹苷（18.64倍）＞PGG（16.50 倍）＞芍藥苷（6.70 倍）＞甘草酸（4.58 倍）＞鹽酸黃柏堿（4.90 倍）＞鹽酸巴馬?。?.26 倍）＞漢黃芩苷（3.19 倍）＞鹽酸小檗堿（3.14 倍）＞甘草苷（2.68 倍）＞黃芩苷（2.24倍）；指標性成分含量差異大于5 倍的藥味來源主要是：連翹（連翹酯苷A 和連翹苷）、赤芍（芍藥內(nèi)酯苷、PGG 和芍藥苷）。

3 討論

3.1 芩連制劑質(zhì)量差異表征分析

芩連片、芩連膠囊、芩連丸3 種制劑中成藥處方組成相同，導致其質(zhì)量差異的主要因素有：原料質(zhì)量、提取次數(shù)、提取時間、提取溶劑量、干燥方式、輔料添加量等。因此，不同批次的芩連制劑特征圖譜及其12 個指標性成分含量，都表現(xiàn)為以廠家為主的質(zhì)量聚類分布。

從芩連制劑的整體質(zhì)量分布分析結(jié)果看，以廠家為主的質(zhì)量聚類分布相關(guān)因子，主要來源于黃芩（峰22、38、27）、赤芍［峰2、21（PGG）、7（芍藥內(nèi)酯苷）］、連翹［峰36（連翹酯素）、30）］、黃連（峰24）、黃連-川黃柏（峰8、4）、連翹-赤芍（峰3）。

從芩連制劑的指標性成分含量差異上看，不同廠家的生產(chǎn)工藝均由黃芩、川黃柏、甘草、連翹4味飲片同時提取制備，而黃芩、甘草、川黃柏指標性成分含量差異范圍（2～5 倍）明顯低于連翹指標性成分連翹酯苷A 含量差異（43.24 倍）；同樣，不同劑型的芩連制劑中赤芍和黃連均為粉碎后與提取物混合制備藥物，而赤芍指標性成分芍藥內(nèi)酯苷含量差異（71.38 倍）明顯高于其它黃芩、甘草、川黃柏、黃連的含量差異范圍。結(jié)合連翹和赤芍原料飲片及其中藥材的質(zhì)量特征可知，青翹和老翹不同規(guī)格的連翹中連翹酯苷A 含量差異較大，赤芍和易混藥材白芍中芍藥內(nèi)酯苷含量差異較大，芩連制劑中這兩個成分含量的顯著差異，應與原料中藥材的質(zhì)量差異相關(guān)。

3.2 芩連制劑特征圖譜分析方法

在分析方法建立的過程中，通過甲酸、磷酸等不同流動相的對比考察，不同體積流量考察，發(fā)現(xiàn)赤芍成分與黃連、黃柏成分相互干擾嚴重，受流動相pH 值變化影響較大；小檗堿等生物堿成分拖尾較為嚴重，不易與連翹苷等成分分離檢測；經(jīng)實驗選定了乙腈（含0.02%甲酸）-（10 mol/L 乙酸銨-0.09%甲酸緩沖液）為流動相，實現(xiàn)了目標測定成分較為穩(wěn)定的分離效果。研究最終采用UHPLCDAD 法建立了芩連制劑特征圖譜質(zhì)量表征方法，在已有文獻報道的基礎(chǔ)上，提高了指標性成分定量范圍的寬度和準確度，并首次建立了對芩連制劑組方6 味中藥的12 個關(guān)鍵指標性成分含量的同時測定，為芩連制劑的質(zhì)量評價提供的研究基礎(chǔ)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突