通絡(luò)益腎方對(duì)糖尿病腎病大鼠線粒體功能障礙的保護(hù)作用

李小會(huì) ，賈國(guó)華，王 琦，雷根平，谷浩榮，陳麗名

（1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西咸陽(yáng) 712000；2.北京王府中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院腎病科，北京 102209；3.河南省靈寶市中醫(yī)院，河南靈寶 472500；4.陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，陜西咸陽(yáng) 712000）

糖尿病腎?。―iabetic Nephropathy，DN）以蛋白尿及腎功能受損為特征，是導(dǎo)致終末期腎衰竭的主要病因。足細(xì)胞受損是DN 蛋白尿的始發(fā)機(jī)制，線粒體功能障礙在DN足細(xì)胞損傷中起核心作用。DN 時(shí)活性氧（Reactive oxygen species，ROS）過(guò)量產(chǎn)生，出現(xiàn)氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)，最終累及足細(xì)胞線粒體［1］，啟動(dòng)并促進(jìn)了DN 的發(fā)生發(fā)展。前期研究證實(shí)通絡(luò)益腎方是治療DN 的有效方劑［2-9］，本研究通過(guò)觀察DN 大鼠足細(xì)胞線粒體功能的變化及通絡(luò)益腎方的干預(yù)效果，以闡明該方的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF 級(jí)SD 大鼠，雄性，260 只，體質(zhì)量（200±20）g，購(gòu)自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（陜）2012—003。

1.2 試劑與藥物 通絡(luò)益腎方由生地、山萸肉、山藥、茯苓、制附子、酒大黃、桃仁、全蝎、水蛭、澤瀉組成。藥材由陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院提供，由陜西中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室彭亮副教授鑒定為正品。大鼠用藥劑量進(jìn)行折算，加水煎煮2 次，質(zhì)量濃度為2.38 g／mL。纈沙坦膠囊（北京諾華制藥有限公司，批號(hào)X1870），制備成混懸液（1.44 mg／mL）；鏈脲佐菌素（美國(guó)Sigma 公司，STZ，批號(hào)X1966）；Trizol RNA 分離試劑盒（美國(guó)Invitrogen 公司，批號(hào)15596-026）；SYBR Mix、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本Takara公司，批號(hào)RR036 A、10102ES）；JC-10 試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)CA1310）。

1.3 儀器 Tecai G2 Spirit 透射電鏡（美國(guó)FEI 公司）；Lightcycler96 反應(yīng)儀（法國(guó)Eppendorf 公司）；流式細(xì)胞儀（美國(guó)Beckman Coulter 公司）；羅康血糖儀（德國(guó)羅氏有限公司）。

2 方法

2.1 建模 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，3%戊巴比妥鈉（30 mg／kg）腹腔注射麻醉行右腎切除，1 周后 STZ 腹腔注射（45 mg／kg）；注射72 h 后，連續(xù)3 d 檢測(cè)血糖，若血糖濃度≥16.7 mol／L 則為大鼠糖尿病形成；3 周后測(cè)24 h UPr≥30 mg／L，為DN 成模，此時(shí)為實(shí)驗(yàn)的開(kāi)始，記為0 周。正常對(duì)照組予假手術(shù)，僅對(duì)皮膚和肌肉切開(kāi)縫合，不切除腎臟，并注射枸櫞酸緩沖液。期間正常對(duì)照組5 只大鼠死亡；DN 造模組不達(dá)標(biāo)5 只、死亡4 只，剩余201 只。

2.2 分組及給藥 大鼠成模后隨機(jī)分為模型組（61 只，蒸餾水），纈沙坦組［47 只，纈沙坦（14.4 mg／kg）］，中藥早期給藥組（47 只），中藥中期給藥組23 只、中藥晚期給藥組23 只均予通絡(luò)益腎方水煎液灌胃（23.8 g／kg）。早期給藥組成模后即開(kāi)始灌胃，中期給藥組、晚期給藥組分別于成模后第9 周、22 周開(kāi)始灌胃給藥。正常對(duì)照組大鼠45 只予蒸餾水灌胃及基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)。糖尿病腎病模型大鼠喂養(yǎng)高脂飼料（基礎(chǔ)飼料75%、蛋黃粉5%、豬油20%）。治療每日1 次，共持續(xù)26 周。定期監(jiān)測(cè)血糖。

2.3 標(biāo)本采集 第9、22 周分別處死正常對(duì)照組、纈沙坦組、模型組、中藥早期給藥組各10 只大鼠。余大鼠于26周末處死取材。3% 戊巴比妥鈉（30 mg／kg）腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈取血，離心分離血清，-20 ℃保存。分離左腎皮質(zhì)，用于透射電鏡、實(shí)時(shí)熒光定量PCR 及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。

2.4 指標(biāo)檢測(cè)

2.4.1 生化檢測(cè) 考馬斯亮蘭法檢測(cè)24 h U-Pr，全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血尿素氮、血肌酐。

2.4.2 透射電鏡觀察足細(xì)胞超微結(jié)構(gòu) 腎組織0.1 mol／L PBS 漂洗，4 ℃、1%鋨酸溶液固定；PBS 漂洗，脫水，包埋，切片，染色，透射電鏡觀察、拍片。

2.4.3 RT-PCR 測(cè)定腎組織TFAM、 PGC-1a mRNA 表達(dá)引物由Primer 5.0 輔助設(shè)計(jì)，序列見(jiàn)表1。PCR 擴(kuò)增條件為95 ℃、5 min，95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，40 cycles。2-△△Ct計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列

2.4.4 腎小球線粒體膜電位 JC-10 染色及流式細(xì)胞儀檢測(cè)。腎皮質(zhì)剪成1 mm3小塊，無(wú)EDTA 胰酶消化，100 μm濾網(wǎng)過(guò)濾，1 000 r／min 離心5 min，收集細(xì)胞沉淀，加入JC-10 在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱孵育20 min；室溫1 000 r／min離心5 min，上機(jī)檢測(cè)。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 19.0 錄入數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以（）表示，多組間比較采用One-way ANOVA 法，以P＜0.05示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 通絡(luò)益腎方對(duì)DN 大鼠24 h U-Pr、腎功能的影響 模型組大鼠24 h U-Pr、Scr、BUN 在實(shí)驗(yàn)期間持續(xù)升高（P＜0.01），提示DN 病情進(jìn)展。與模型組比較，中藥早期組9、22、26 周時(shí)24 h U-Pr、Scr、BUN 均降低（P＜0.05，P＜0.01），中期組22、26 周時(shí)上述指標(biāo)亦下降（P＜0.05、 P＜0.01），晚期組26 周時(shí)24 h U-Pr 下降（P＜0.05）。26 周時(shí)，與中藥早期組比較，中期組、晚期組24 h U-Pr、Scr、BUN 升高（P＜0.01）。提示通絡(luò)益腎方可顯著降低DN 大鼠24 h U-Pr，改善腎功能，但早期干預(yù)效果優(yōu)于中、晚期。見(jiàn)表2、圖1～2。

表2 通絡(luò)益腎方對(duì)24 h U-Pr 的影響（，n＝10）

表2 通絡(luò)益腎方對(duì)24 h U-Pr 的影響（，n＝10）

注：與正常對(duì)照組比較，※※P＜0.01；與模型組比較，◆P＜0.05，◆◆P＜0.01；與纈沙坦組比較，△P＜0.05；與中藥早期組比較，∧P＜0.05，∧∧P＜0.01。

圖1 通絡(luò)益腎方對(duì)糖尿病腎病模型大鼠腎功能的影響（，n＝10）

3.2 通絡(luò)益腎方對(duì)足細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)的影響 正常對(duì)照組大鼠足細(xì)胞線粒體形態(tài)飽滿、規(guī)則，呈圓形、卵圓形或桿狀，嵴清晰完整。模型組可見(jiàn)不同程度的腎小球基底膜增厚，線粒體腫脹、破損、數(shù)量減少，嵴紊亂，隨時(shí)間延長(zhǎng)線粒體損傷程度逐漸加重，可見(jiàn)線粒體重度腫脹甚或破裂，數(shù)量明顯減少，嵴斷裂或消失。各給藥組線粒體損傷程度均減輕，尤以中藥早期組與纈沙坦組線粒體損傷程度最輕。見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠不同時(shí)期腎小球足細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)比較（×50 000）

3.3 通絡(luò)益腎方對(duì)TFAM、 PGC-1α mRNA 的影響 模型組9、22、26 周時(shí)TFAM、 PGC-1α mRNA 表達(dá)均較正常對(duì)照組降低（P＜0.01），且隨時(shí)間的延長(zhǎng)呈持續(xù)下調(diào)趨勢(shì)。與模型組比較，中藥早期組各時(shí)間點(diǎn)TFAM、 PGC-1α mRNA 表達(dá)均升高（P＜0.01）；中藥中期組、晚期組26 周時(shí)上述指標(biāo)上調(diào)（P＜0.05）。26 周時(shí)，中期組、晚期組表達(dá)均較中藥早期組降低（P＜0.01）。見(jiàn)圖3。

圖3 通絡(luò)益腎方對(duì)糖尿病腎病模型大鼠TFAM、 PGC-1α mRNA 表達(dá)的影響（，n＝10）

3.4 通絡(luò)益腎方對(duì)腎小球線粒體膜電位的影響 與正常對(duì)照組比較，模型組線粒體膜電位水平呈時(shí)間依賴性下降（P＜0.01）。與模型組比較，纈沙坦組、中藥早期組22 周、26 周時(shí)膜電位均升高（P＜0.05，P＜0.01）。26 周時(shí)與中藥早期組比較，中藥中期組、晚期組膜電位水平降低（P＜0.01）。說(shuō)明通絡(luò)益腎方可提高DN 大鼠線粒體膜電位水平，且早期干預(yù)效果優(yōu)于中、晚期。見(jiàn)圖4。

圖4 通絡(luò)益腎方對(duì)糖尿病腎病模型大鼠線粒體膜電位的影響（，n＝10）

4 討論

足細(xì)胞損傷、凋亡是DN 蛋白尿發(fā)生和腎小球硬化的中心靶點(diǎn)［10］。足細(xì)胞內(nèi)有豐富的線粒體，為其完成各項(xiàng)功能提供能量支持。DN 時(shí)腎臟氧化應(yīng)激損傷與線粒體功能障礙密切相關(guān)［10-11］。長(zhǎng)期高糖高脂環(huán)境損傷足細(xì)胞線粒體，使ROS 大量積聚，線粒體發(fā)生氧化應(yīng)激，線粒體功能損傷，ATP 產(chǎn)生減少，膜電位下降，線粒體通透性增大，導(dǎo)致足細(xì)胞凋亡、腎小球硬化。因此，改善線粒體功能、糾正其功能紊亂已成為治療DN 的新策略。

線粒體膜電位是評(píng)估線粒體功能的重要指標(biāo)。膜電位異常可導(dǎo)致ATP 生成障礙，線粒體通透性增高而誘發(fā)細(xì)胞凋亡。膜電位水平下降是細(xì)胞凋亡的先兆［12］，而抑制膜電位的下降則可抑制細(xì)胞凋亡。足細(xì)胞損傷時(shí)其膜電位水平顯著降低［13］；白藜蘆醇可升高高糖培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞線粒體膜電位而抑制小管上皮細(xì)胞的凋亡［14］。本研究中，模型組大鼠線粒體損傷隨時(shí)間延長(zhǎng)持續(xù)加重，線粒體膜電位水平持續(xù)下降。各中藥組線粒體損傷程度均減輕，但早期給藥組線粒體損傷程度最輕，線粒體膜電位水平顯著升高（P＜0.01），優(yōu)于中期及晚期給藥組（P ＜0.01 或P ＜0.05）。說(shuō)明通絡(luò)益腎方可保護(hù)線粒體結(jié)構(gòu)，升高線粒體膜電位，且早期干預(yù)優(yōu)于中期和晚期。

過(guò)氧化物酶增殖物激活受體γ 輔助活化因子1（peroxisome proliferator activated receptor gamma coactivator-1，PGC-1ɑ）可促進(jìn)線粒體的生成，恢復(fù)線粒體膜電位，清除ROS、抑制氧化應(yīng)激［15-17］。生理情況下，PGC-1α 在腎臟中高表達(dá)。急性腎損傷時(shí)PGC-1α 表達(dá)下調(diào)［18］，線粒體合成減少，腎臟缺氧而發(fā)生腎間質(zhì)纖維化。醛固酮誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷中PGC-1α 表達(dá)下調(diào)、線粒體破壞和細(xì)胞凋亡，增加PGC-1α 表達(dá)后可以改善［19］。替米沙坦通過(guò)激活PGC-1α 降低氧化應(yīng)激反應(yīng)發(fā)揮腎保護(hù)機(jī)制［20］。提示PGC-1α 異常與腎臟病密切相關(guān)。線粒體轉(zhuǎn)錄因子A（mitochondrial transcription factor A，TFAM）是PGC-1α 的下游靶基因，能維持線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）的空間構(gòu)象，調(diào)控 mtDNA 的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄激活及損傷修復(fù)［21］。PGC-1α／TFAM信號(hào)通路可促進(jìn)線粒體增殖，提高線粒體功能［22］。本研究中，模型組大鼠PGC-1α、 TFAM mRNA 表達(dá)呈時(shí)間依賴性遞減（P＜0.01），通絡(luò)益腎方早期組PGC-1α、 TFAM mRNA 表達(dá)均較模型組升高（P＜0.01）。說(shuō)明通絡(luò)益腎方能促進(jìn)DN 大鼠線粒體的生物合成，但早期干預(yù)優(yōu)于中晚期。本研究結(jié)果從線粒體功能障礙角度闡明了通絡(luò)益腎方的作用機(jī)制，以期為該方的科學(xué)、合理應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。