美麗芍藥根中黃酮類(lèi)成分及其生物活性

梁文娟，尹 迪，郗建宇，孫春吉，王洪玲

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明 650201；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源與民族藥研究中心，江西南昌 330004）

芍藥科世界上僅一屬，中國(guó)是芍藥科起源、演化、分化發(fā)展和多樣性中心，研究我國(guó)境內(nèi)特有的芍藥屬植物資源對(duì)該屬植物的保護(hù)，開(kāi)發(fā)和利用有現(xiàn)實(shí)的意義［1-2］。美麗芍藥Paeonia mairei Levl.為芍藥科芍藥屬多年生草本植物，《中國(guó)植物志》 記載分布于云南東北部、貴州西部、四川中南部、甘肅和陜西南部，模式標(biāo)本采自云南巧家［3］。最新研究發(fā)現(xiàn)美麗芍藥資源儲(chǔ)備急劇下降，作為芍藥屬植物的涉危種，其野生資源在我國(guó)境內(nèi)東部和西部分布差異巨大且有擴(kuò)大趨勢(shì)［4］。芍藥屬植物大多可供藥用，且收錄于歷代本草和歷版 《中國(guó)藥典》，傳統(tǒng)藥材白芍、赤芍和牡丹皮多在歷代疏肝解郁復(fù)方中出現(xiàn)；對(duì)該屬植物藥理活性的研究主要集中在中樞神經(jīng)和心血管系統(tǒng)保護(hù)、止痛等作用上［5-6］。而中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙受多種激素影響，其中褪黑素水平下降就與神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生相關(guān)；褪黑素功能的發(fā)揮受褪黑素受體的介導(dǎo)，褪黑素受體激動(dòng)劑對(duì)調(diào)控機(jī)體生物學(xué)功能有重要作用［7-8］，課題組前期從川赤芍中發(fā)現(xiàn)的激動(dòng)褪黑素受體1 的活性成分paeoveitol D［9］，從天然產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)褪黑素受體激動(dòng)劑具有現(xiàn)實(shí)的可行性。美麗芍藥的根可藥用，具有行瘀活血、止痛之效，在云南當(dāng)?shù)赜幸欢ǖ挠盟幓A(chǔ)［3］。作為一個(gè)珍惜的特有種，關(guān)于美麗芍藥的研究報(bào)道較少［4，10-11］。本實(shí)驗(yàn)對(duì)采自云南巧家美麗芍藥干燥根70%乙醇提取物進(jìn)行化學(xué)成分研究，共分離鑒定出9 個(gè)化合物，主要涉及黃酮類(lèi)、小分子酚酸、三萜類(lèi)和甾體成分，其中化合物1～6 為首次從該植物中分離得到，化合物3～4 對(duì)褪黑素受體1 具有激動(dòng)作用。

1 材料

島津LC-MS-IT-TOF 質(zhì)譜（日本島津公司）；Brucker DRX-500、Brucker AM-400 核磁共振儀（德國(guó)Brucker 公司）；薄層色譜硅膠、柱層析硅膠（200～300 目，青島美高集團(tuán)有限公司）；反相C18硅膠材料（日本Fuji 公司）；MCI CHP-20P gel 填料（日本三菱化學(xué)公司）；葡聚糖凝膠LH-20（美國(guó)Pharmacia 公司）。分析純石油醚、二氯甲烷、丙酮、甲醇、乙醇（天津化學(xué)試劑有限公司）；純凈水（美國(guó)Millipore 公司）；顯色劑為自制H2SO4（10%）乙醇溶液。鈣流檢測(cè)試劑盒Wash Free Fluo-8（上海HD Biosciences Co.Ltd 公司，HD03-0010）。FLIPR 多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Molecular Devices 公司）。褪黑素（CAS 73-31-4，美國(guó)Topscience 公司），作為陽(yáng)性對(duì)照。樣品于2016 年9 月采自云南巧家，由中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所張書(shū)東副研究員鑒定為美麗芍藥Paeonia mairei Levl.，標(biāo)本存放于云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院（編號(hào)20160926）。

2 提取與分離

美麗芍藥干燥根3.5 kg，經(jīng)粉碎后用70% 乙醇，回流提取3 次，每次1 h，提取液經(jīng)減壓濃縮至小體積，將濃縮液過(guò)D101 大孔樹(shù)脂，分別用水、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇洗脫得水部位（Fr1.210 g）、30% 乙醇部位（Fr2.72 g）、50% 乙醇部位（Fr3.32 g）、70% 乙醇部位（Fr4.23 g）。Fr4 經(jīng)硅膠柱，以石油醚-丙酮梯度洗脫，得5 個(gè)部分Fr4-1～Fr4-5。Fr4-1 經(jīng)MCI 甲醇-水（0 ∶100、30 ∶70、50 ∶50、90 ∶10）梯度洗脫得4 個(gè)部分Fr4-1-1～Fr4-1-4。其中Fr4-1-2 經(jīng)硅膠柱以二氯甲烷-甲醇-水（95 ∶5 ∶0、90 ∶10 ∶0.1、80 ∶20 ∶0.2、70 ∶30 ∶0.3）梯度洗脫，再經(jīng)Sephadex LH-20 甲醇洗脫得化合物4（4 mg）、5（4 mg）；Fr4-1-3 經(jīng)硅膠柱石油醚-丙酮（95 ∶5、90 ∶10、80 ∶20、70 ∶30、50 ∶50、30 ∶70、10 ∶90）梯度洗脫，再經(jīng)Sephadex LH-20 甲醇洗脫得2（5 mg）、8（5 mg）。Fr4-2 經(jīng)Rp-18 柱甲醇-水（20 ∶80、30 ∶70、40 ∶60、50 ∶50、60 ∶40）洗脫得5 個(gè)部分Fr4-2-1～Fr4-2-5，F(xiàn)r4-2-4 經(jīng)硅膠柱二氯甲烷-甲醇-水（95 ∶5 ∶0、90 ∶10 ∶0.1、80 ∶20 ∶0.2、70 ∶30 ∶ 0.3）梯度洗脫得化合物3（3 mg）、6（3 mg），F(xiàn)r4-2-5 過(guò)Sephadex LH-20（甲醇）洗脫得化合物7（4 mg）。Fr4-5 經(jīng)硅膠柱二氯甲烷-甲醇-水（95 ∶5 ∶0、90 ∶10 ∶0.1、80 ∶20 ∶0.2、70 ∶30 ∶0.3）梯度洗脫，其中Fr4-5-2 經(jīng)石油醚-丙酮（10 ∶90、20 ∶80、30 ∶70、50 ∶50、100 ∶0）梯度洗脫，再經(jīng)Sephadex LH-20 多次純化，得化合物1（4 mg）、9（6 mg）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：黃色無(wú)定型粉末，C16H14O6，ESIMS m／z：303.1 ［M+H］+。1H-NMR（CD3OD，500 MHz） δ：6.92（3H，overlapped，H-2′，5′，6′），5.90（1H，d，J ＝2.2 Hz，H-6），5.87（1H，d，J ＝2.2 Hz，H-8），5.31（1H，dd，J ＝12.7，3.1 Hz，H-2），3.86（3H，s，-OCH3），3.06（1H，dd，J ＝17.1，12.7 Hz，H-3a），2.71（1H，dd，J ＝17.1，12.7 Hz，H-3b）；13C-NMR（CD3OD，125 MHz） δ：80.3（d，C-2），44.1（t，C-3），197.6（s，C-4），165.5（s，C-5），97.0（d，C-6），168.4（s，C-7），96.2（d，C-8），164.9（s，C-9），103.4（s，C-10），133.1（s，C-1′），114.5（d，C-2′），149.3（s，C-3′），147.8（s，C-4′），112.5（d，C-5′），119.0（d，C-6′），56.4（q，-OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［12］對(duì)照基本一致，故鑒定為橙皮素。

化合物2：黃色無(wú)定型粉末，C16H12O7，ESIMS m／z：317.1 ［M+H］+。1H-NMR（CD3OD，500 MHz） δ：7.86（1H，d，J ＝2.1 Hz，H-2′），7.73（1H，dd，J ＝8.5，2.1 Hz，H-6′），6.93（1H，d，J ＝8.5 Hz，H-5′），6.42（1H，d，J ＝2.1 Hz，H-8），6.19（1H，d，J ＝2.1 Hz，H-6），3.94（3H，s，-OCH3）；13C-NMR（CD3OD，125 MHz） δ：149.2（s，C-2），137.5（d，C-3），177.6（s，C-4），155.5（s，C-5），98.2（d，C-6），168.4（s，C-7），96.0（d，C-8），164.3（s，C-9），103.5（s，C-10），123.1（s，C-1′），114.5（d，C-2′），147.3（s，C-3′），147.9（s，C-4′），113.5（d，C-5′），119.5（d，C-6′），57.3（q，-OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［13］對(duì)照基本一致，故鑒定為異鼠李素。

化合物3：黃色無(wú)定型粉末，C15H10O5，ESIMS m／z：271.1 ［M+H］+。1H-NMR（CD3OD，500 MHz） δ：7.88（2H，d，J ＝8.8 Hz，H-2′，6′），6.95（2H，d，J ＝8.8 Hz，H-3′，5′），6.64（1H，s，H-3），6.48（1H，d，J ＝2.1 Hz，H-8），6.23（1H，d，J ＝2.1 Hz，H-6）；13C-NMR（CD3OD，125 MHz） δ：166.1（s，C-2），104.2（d，C-3），183.8（s，C-4），159.4（s，C-5），100.2（d，C-6），165.9（s，C-7），95.2（d，C-8），163.3（s，C-9），105.4（s，C-10），123.3（s，C-1′），129.7（d，C-2′，6′），117.2（s，C-3′，5′），159.0（s，C-4′）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［12］對(duì)照基本一致，故鑒定為芹菜素。

化合物4：黃色無(wú)定型粉末，C15H12O5，ESIMS m／z：273.1 ［M+H］+。1H-NMR（CD3OD，500 MHz） δ：7.30（2H，d，J ＝8.5 Hz，H-2′，6′），6.81（2H，d，J ＝8.5 Hz，H-3′，5′），5.88（2H，overlapped，H-6，8），5.33（1H，dd，J ＝13.0，3.0 Hz，H-2），3.10（1H，dd，J ＝17.1，3.0 Hz，H-3b），2.68（1H，dd，J ＝17.1，3.0 Hz，H-3a）；13C-NMR（CD3OD，125 MHz） δ：80.5（d，C-2），44.0（t，C-3），197.8（s，C-4），165.5（s，C-5），97.0（d，C-6），168.3（s，C-7），96.1（d，C-8），164.9（s，C-9），103.3（s，C-10），131.1（s，C-1′），129.0（d，C-2′，6′），116.3（s，C-3′，5′），162.8（s，C-4′）。

以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［14］對(duì)照基本一致，故鑒定為柚皮素。

化合物5：黃色無(wú)定型粉末，C21H20O10，ESIMS m／z：433.1 ［M+H］+。1H-NMR（CD3OD，500 MHz） δ：8.01（2H，d，J ＝8.7 Hz，H-2′，6′），6.95（2H，d，J ＝8.7 Hz，H-3′，5′），6.64（1H，s，H-3），6.29（1H，s，H-6），4.45（1H，brd，s，H-1″），4.92（2H，overlapped，H-6″），3.72（1H，m，H-5″），3.44（1H，m，H-3″），3.30（1H，m，H-4″），3.21（1H，m，H-2″）；13C-NMR（CD3OD，125 MHz）δ：167.1（s，C-2），104.5（d，C-3），184.8（s，C-4），158.8（s，C-5），100.1（d，C-6），165.1（s，C-7），106.6（s，C-8），163.3（s，C-9），106.2（s，C-10），124.3（s，C-1′），130.9（d，C-2′，6′），117.8（s，C-3′，5′），163.4（s，C-4′），81.0（d，C-1″），76.0（d，C-2″），73.5（d，C-3″），73.0（d，C-4″），83.7（d，C-5″），63.8（t，C-6″）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［15］對(duì)照基本一致，故鑒定為牡荊素。

化合物6：黃色無(wú)定型粉末，C15H10O6，ESIMS m／z：285.3 ［M-H］-。1H-NMR（CD3OD，500 MHz） δ：7.40（2H，overlapped，H-2′，6′），6.91（1H，d，J ＝8.1 Hz，H-5′），6.56（1H，s，H-3），6.45（1H，d，J ＝2.0 Hz，H-8），6.21（1H，d，J ＝2.0 Hz，H-6）；13C-NMR（CD3OD，125 MHz） δ：166.2（s，C-2），104.1（d，C-3），183.8（s，C-4），159.4（s，C-5），100.2（d，C-6），165.9（s，C-7），95.1（d，C-8），163.2（s，C-9），105.4（s，C-10），123.7（s，C-1′），114.3（d，C-2′），147.1（s，C-3′），151.0（s，C-4′），117.0（d，C-5′），120.4（d，C-6′）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［16］對(duì)照基本一致，故鑒定為木犀草素。

化合物7：白色結(jié)晶，熔點(diǎn)為244～246 ℃，C9H10O5，ESI-MS m／z：197.1 ［M-H］。1H-NMR（CD3OD，400 MHz） δ：7.05（2H，s，H-3，7），4.24（2H，q，J ＝14.2，7.2 Hz，H-1′），1.30（3H，t，J ＝7.2 Hz，H-2′）；13C-NMR（CD3OD，100 MHz），δ：168.5（s，C-1），121.6（s，C-2），109.9（d，C-3，C-7），146.3（s，C-4，C-6），139.6（s，C-5），61.7（t，C-1′），14.5（q，C-2′）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn) ［17］對(duì)照基本一致，故鑒定為沒(méi)食子酸乙酯。

化合物8：白色粉末，C30H48O3，ESI-MS m／z：455.4 ［M-H］-。1H-NMR（CDCl3，400 MHz） δ：5.23（1H，t，J ＝3.4 Hz，H-12），3.23（1H，m，H-3），2.84（1H，dd，J ＝10.0，5.9 Hz，H-18），1.52（3H，s，H-27），1.15（3H，s，H-30），1.04（3H，s，H-29），0.94（3H，s，H-26），0.91（3H，s，H-25），0.89（3H，s，H-24），0.83（3H，s，H-23）；13C-NMR（CDCl3，125 MHz） δ：28.3（t，C-1），27.5（t，C-2），78.7（d，C-3），38.2（s，C-4），55.3（d，C-5），18.3（t，C-6），32.3（t，C-7），38.6（s，C-8），47.2（d，C-9），37.1（s，C-10），23.1（t，C-11），122.5（d，C-12），143.8（s，C-13），46.5（s，C-14），27.0（t，C-15），23.4（t，C-16），47.4（s，C-17），41.1（d，C-18），46.1（t，C-19），32.5（s，C-20），33.1（t，C-21），33.8（t，C-22），28.2（q，C-23），15.6（q，C-24），15.3（q，C-25），17.0（q，C-26），25.9（q，C-27），182.0（s，C-28），30.5（q，C-29），23.6（q，C-30）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［18］對(duì)照基本一致，故鑒定為齊敦果酸。

化合物9：白色針晶（石油醚），Liebermann-Burchard 反應(yīng)陽(yáng)性，與β-谷甾醇對(duì)照品共薄層，在3 種不同的展開(kāi)系統(tǒng)中展開(kāi)，Rf值及顯色行為一致。故鑒定為β-谷甾醇。

4 激動(dòng)褪黑素受體1 活性篩選

化合物對(duì)褪黑素（MT1）受體1 活性實(shí)驗(yàn)在HEK293 細(xì)胞模型上完成。采用添加dulbecco’s 改良的eagle 培養(yǎng)基，G418（600 μg／mL）和10% 胎牛血清的培養(yǎng)基放置于37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞接種在Matrigel? 包被2×104／384 孔黑色板上并在CO2中培養(yǎng)24 h；化合物激動(dòng)褪黑素受體的實(shí)驗(yàn)在鈣流檢測(cè)試劑盒Wash Free Fluo-8上完成。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)FLIPR 多功能酶標(biāo)儀讀取。EC50值通過(guò)GraphPad Prism 5 由軟件計(jì)算得出。對(duì)采自云南的美麗芍藥中所分離得到的6 個(gè)黃酮類(lèi)化合物進(jìn)行激動(dòng)褪黑素受體1 的活性實(shí)驗(yàn)，以褪黑素作為陽(yáng)性對(duì)照（EC501.80 nmol／L），重復(fù)3 次，結(jié)果顯示在100 μmol／L 濃度下，化合物3～4 對(duì)褪黑素受體1 有一定的激動(dòng)作用。激動(dòng)率分別為（7.16±1.14）%、（14.72±4.52）%，化合物1～2、5～6 在100 μmol／L 濃度下不顯示出明顯活性，激動(dòng)率分別為（4.35±1.27）%、（-0.31± 4.57）%、（-1.63±0.99）%、（-0.76±1.74）%。

5 討論

本研究對(duì)采自云南巧家的美麗芍藥干燥根70%乙醇部位進(jìn)行化學(xué)成分研究，共分離鑒定出9個(gè)化合物，其中黃酮類(lèi)化合物1～6 為首次從該植物中分離鑒定。研究表明橙皮素及其衍生物可增加海馬腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的水平，提高小鼠學(xué)習(xí)記憶能力從而抑制阿爾茲海默癥［19］。木犀草素可以激活正常的大鼠海馬中的cAMP 應(yīng)答元件結(jié)合蛋白從而保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)的學(xué)習(xí)記憶能力［20］。柚皮素具有抗炎、抗氧化、抗癌、鎮(zhèn)咳等作用［21］。本研究對(duì)美麗芍藥中分離得到的6 個(gè)黃酮類(lèi)化合物進(jìn)行激動(dòng)褪黑素受體1 的活性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示在100 μmol／L 濃度下，化合物3～4 對(duì)褪黑素受體1有一定的激動(dòng)作用。