蟾酥酒制對(duì)蟾蜍甾烯含量變化及透皮吸收的影響

李丹丹 ，陳吳越 ，周昊言，呂 翔，周 婧?，馬宏躍?，王恒斌，狄留慶，段金廒

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇省方劑高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室／江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過(guò)程協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇南京 210023；2.雷允上藥業(yè)集團(tuán)有限公司，江蘇蘇州 215009）

動(dòng)物藥蟾酥含有復(fù)雜的化學(xué)成分，包括蟾蜍甾烯類(lèi)、蟾毒色胺類(lèi)、吲哚生物堿類(lèi)、甾醇類(lèi)以及氨基酸、多肽類(lèi)等成分［1-3］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明蟾酥及其活性成分具有抗腫瘤［4-5］、強(qiáng)心［6］、鎮(zhèn)痛［7］、抗菌［8］及抗炎［9］等作用，臨床常用于惡性腫瘤、心血管等疾病治療［10-11］。除了口服使用外，蟾酥外用治療癌痛、瘡瘍、皮膚感染、帶狀皰疹疼痛、牙痛等［12-13］，歷史悠久，特色鮮明，療效出眾。

蟾酥藥材多為片酥，臨床調(diào)劑或者成藥制劑前，需要進(jìn)行炮制（或粉碎）處理。傳統(tǒng)炮制方法［14］，包括宋代鐵上焙焦（《太平圣惠方》 ）、酒燉（《婦人良方大全》 ）；明代有湯浸（《普濟(jì)方》 ）、乳汁制等。目前2020 年版《中國(guó)藥典》（一部）規(guī)定蟾酥粉炮制方法為酒制［15］，取蟾酥，搗碎，加白酒浸漬，時(shí)常攪動(dòng)至呈稠膏狀，干燥，粉碎。每10 kg 蟾酥，用白酒20 kg［16］。片酥質(zhì)地堅(jiān)硬，粉碎困難，古代酒制的主要目的是便于片狀蟾酥粉碎，隨著現(xiàn)代科技的發(fā)展，實(shí)際生產(chǎn)中由于酒制方法繁瑣，常使用打粉機(jī)進(jìn)行粉碎處理。蟾酥酒制除了便于粉碎外，是否還具有其他方面的功用，目前尚未知曉。考慮到蟾酥中甾烯類(lèi)成分具有較好的脂溶性，相比水溶性物質(zhì)更容易透皮吸收，是蟾酥外用的重要功效物質(zhì)。前期課題組對(duì)商品蟾酥含量測(cè)定結(jié)果顯示脂蟾毒配基、沙蟾毒精、華蟾毒它靈、蟾毒它靈、華蟾酥毒基是市售藥材及飲片中含量較高的成分。但目前對(duì)這幾種蟾蜍甾烯類(lèi)成分在酒制前后含量變化的研究缺乏一定的系統(tǒng)性。且鮮有對(duì)蟾酥酒制前后甾烯成分外用透皮吸收的研究。本實(shí)驗(yàn)選擇蟾酥中6 種含量較高且具活性的蟾蜍甾烯成分為指標(biāo)，采用HPLC 法對(duì)酒制前后該類(lèi)成分進(jìn)行定量分析，并通過(guò)體外Franz 擴(kuò)散池法測(cè)定酒制前后其透皮吸收比率，探究酒制對(duì)蟾酥中蟾蜍甾烯類(lèi)成分的影響，以期為蟾酥炮制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

Agilent 1290 高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent 公司）；TK-12D 型透皮擴(kuò)散試驗(yàn)儀（上海鍇凱科技貿(mào)易有限公司）。對(duì)照品蟾毒靈、脂蟾毒配基、華蟾酥毒基實(shí)驗(yàn)室制備，純度＞98.0%；沙蟾毒精（180427）、華蟾毒它靈（180318）、蟾毒它靈（180419），純度均＞98.0%，均購(gòu)于北京普天同創(chuàng)生物科技有限公司。甲醇、乙腈為色譜純，購(gòu)于德國(guó)Merck 公司。24 批蟾酥藥材購(gòu)自全國(guó)不同產(chǎn)地（江蘇、安徽、山東、吉林、重慶），經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院馬宏躍教授鑒定為蟾蜍的干燥分泌物。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，雄性豚鼠，體質(zhì)量250～300 g，購(gòu)自南京市江寧區(qū)青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng)，許可證號(hào)SCXK（蘇）2017-0011。

2 方法

2.1 溶液制備

2.1.1 對(duì)照品溶液 精密稱(chēng)取脂蟾毒配基、華蟾酥毒基、蟾毒靈、沙蟾毒精、蟾毒它靈、華蟾毒它靈對(duì)照品粉末適量，加入甲醇制備成質(zhì)量濃度為10 mg／mL 的對(duì)照品貯備液。取適量貯備液，逐級(jí)稀釋成不同質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液，4 ℃下離心（14 000 r／min）20 min，取上清。

2.1.2 樣品溶液 精密稱(chēng)定蟾酥粉末（過(guò)24 目篩）15 mg，置具塞錐形瓶中，加入甲醇溶液定容，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲提取1 h。放冷，再稱(chēng)定質(zhì)量，用甲醇溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻后，4 ℃下離心（14 000 r／min）20 min，取上清，經(jīng)0.22 μm 微孔有機(jī)濾膜過(guò)濾，即得。

2.2 酒制樣品溶液 根據(jù)2020 年版《中國(guó)藥典》規(guī)定，參照袁旭江等［17］正交優(yōu)化后的蟾酥酒制工藝進(jìn)行炮制，蟾酥打粉（過(guò)24 目篩）后加入白酒（紅星二鍋頭，20180916）60 ℃下浸漬12 h（蟾酥和白酒比例為1 ∶2），攪拌至稠膏狀，80 ℃干燥后粉碎，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備蟾酥酒制品溶液。

2.3 體外透皮實(shí)驗(yàn) 將實(shí)驗(yàn)豚鼠處死后，8%硫化鈉脫毛，剝離豚鼠皮膚并除去皮下脂肪、血管，生理鹽水沖洗，冷藏備用，實(shí)驗(yàn)前檢查皮膚完整性。采用TK-12D 藥物透皮擴(kuò)散儀研究蟾酥的透皮吸收。接收池中含有10% 乙醇的生理鹽水。接收池用磁力攪拌器在以（37 ± 0.5）℃，以400 r／min 勻速攪拌。在給藥60 min 后，取下給藥區(qū)域皮膚，用10%乙醇洗去皮膚表面藥物殘留。將皮膚磨碎，甲醇超聲提取，離心取上清液過(guò)膜，測(cè)定皮膚內(nèi)滲入的蟾酥甾烯含量。

2.4 色譜條件 色譜條件參照《蟾酥商品藥材的品質(zhì)評(píng)價(jià)及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)草案建立》［18］中優(yōu)化條件，采用Waters XBridge C18色譜柱（100 mm×4.6 mm，3.5 μm）；流動(dòng)相乙腈（A）-0.2% 磷酸水（B），梯度洗脫（0～6 min，20%～25% A；6～12 min，25%～30% A；12～24 min，30%～35% A；24～34 min，35%～40% A；34～35 min，40%～90% A；35～37 min，90% A；37～38 min，90%～20% A；38～42 min，20% A）；柱溫35 ℃；體積流量0.7 mL／min；檢測(cè)波長(zhǎng)296 nm。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 蟾酥酒制前后特征圖譜分析 取蟾酥供試品溶液（S1～S24）、蟾酥酒制品供試溶液（J1-J24），通過(guò)液相色譜進(jìn)樣分析，將各批次蟾酥色譜圖、蟾酥酒制品色譜圖導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012 版）。以S1 為參照?qǐng)D譜，時(shí)間窗設(shè)為0.1 s，采用中位數(shù)法生成對(duì)照?qǐng)D譜。由圖1 可知，蟾酥和蟾酥酒制品HPLC 特征圖譜基本一致，二者均具有16 個(gè)共有峰，但部分化學(xué)成分峰面積存在一定差異，即質(zhì)量有所不同。

3.2 方法學(xué)考察

3.2.1 線性關(guān)系考察 取“2.1.1”項(xiàng)下稀釋不同倍數(shù)的混合對(duì)照品溶液，在“2.4”項(xiàng)條件下進(jìn)樣，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

3.2.2 精密度試驗(yàn) 取“2.1.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，在“2.4”項(xiàng)條件下進(jìn)樣6 次，測(cè)得沙蟾毒精、蟾毒它靈、華蟾毒它靈、蟾毒靈、脂蟾毒配基、華蟾酥毒基RSD 分別為0.24%、0.71%、0.40%、0.36%、0.29%、0.42%，表明儀器精密度良好。

3.2.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取樣品TJ-2 粉末6 份，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，在“2.4”項(xiàng)條件下進(jìn)樣，測(cè)得沙蟾毒精、蟾毒它靈、華蟾毒它靈、蟾毒靈、脂蟾毒配基、華蟾酥毒基RSD 分別為 1.46%、0.74%、1.39%、0.45%、0.45%、0.46%，表明該方法重復(fù)性良好。

3.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取樣品TJ-2 粉末，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，在“2.4”項(xiàng)條件下，分別于0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣，測(cè)得沙蟾毒精、蟾毒它靈、華蟾毒它靈、蟾毒靈、脂蟾毒配基、華蟾酥毒基RSD 分別為0.72%、2.33%、0.31%、0.49%、0.36%、0.47%，表明樣品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.2.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱(chēng)取6 份TJ-2 粉末，置于具塞錐形瓶中，分別精密加入一定量的對(duì)照品溶液，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備溶液，在“2.4”項(xiàng)條件下進(jìn)樣，測(cè)得沙蟾毒精、蟾毒它靈、華蟾毒它靈、蟾毒靈、脂蟾毒配基、華蟾酥毒基加樣回收率（RSD）分別為100.54%（3.10%）、103.34%（2.90%）、99.75%（3.61%）、102.03%（2.56%）、98.72%（1.57）%、101.19%（2.14）%。

3.3 酒制前后樣品含量測(cè)定 在“2.4”項(xiàng)條件下，HPLC-UV 含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖2，24 批蟾酥中6種蟾蜍甾烯的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為14.39%，酒制后平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為13.87%，下降率3.62%。蟾酥經(jīng)過(guò)酒制后，6 種蟾蜍甾烯類(lèi)成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)略有下降，下降比率從1.63%～7.29%。下降比率接近或大于5%的分別是沙蟾毒精和脂蟾毒配基。

圖2 24 批蟾酥酒制前后6 種甾烯含量測(cè)定結(jié)果Fig.2 Results of content determination of six bufadienolides in twenty-four batches of toad venom before and after processing

3.4 蟾酥酒制前后對(duì)體外透皮吸收的影響 蟾酥酒制前后體外透皮吸收結(jié)果見(jiàn)表2，結(jié)果表明，與蟾酥相比，酒制蟾酥后6 種蟾蜍甾烯類(lèi)成分的透皮吸收率均有所下降，其中沙蟾毒精和脂蟾毒配基下降率最大，分別為26.19%、20.72%。

4 討論

蟾酥臨床用藥前需要進(jìn)行炮制處理。2020 年版《中國(guó)藥典》 中規(guī)定蟾酥用酒進(jìn)行炮制。參考以往酒制工藝研究結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)確定的酒制法操作為蟾酥打粉后加入白酒，60 ℃下浸漬12 h（蟾酥和白酒比例為1 ∶2），攪拌至稠膏狀，80 ℃干燥后粉碎。

通過(guò)對(duì)蟾酥及酒制蟾酥HPLC 特征圖譜進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)兩者在色譜峰數(shù)量上沒(méi)有差異，在峰面積方面略有差異。含量分析表明，蟾酥酒制后6 種甾烯成分含量均有下降，影響最大的為沙蟾毒精和脂蟾毒配基。體外透皮實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，酒制后各甾烯成分透皮吸收率有所下降，對(duì)沙蟾毒精和脂蟾毒配基影響較大。蟾酥作為成分復(fù)雜的動(dòng)物藥，含有復(fù)雜的蛋白多肽類(lèi)成分，推測(cè)可能是由于蟾酥中其他成分如多肽類(lèi)成分在酒制后發(fā)生變化從而影響其透皮吸收。

表2 蟾酥中6 種蟾蜍甾烯類(lèi)成分酒制前后質(zhì)量變化及透皮吸收率的變化（，%）Tab.2 Variations in content and transdermal absorption of six toad venom constituents before and after processing（，%）

表2 蟾酥中6 種蟾蜍甾烯類(lèi)成分酒制前后質(zhì)量變化及透皮吸收率的變化（，%）Tab.2 Variations in content and transdermal absorption of six toad venom constituents before and after processing（，%）

總的來(lái)說(shuō)，片酥質(zhì)地堅(jiān)硬，粉碎困難，酒制的主要目的是便于片狀蟾酥粉碎。同時(shí)蟾酥甾烯過(guò)量攝入有潛在心臟毒性，酒制對(duì)于減低蟾酥的毒性有積極意義。本實(shí)驗(yàn)考察了蟾酥酒制對(duì)藥材中6 種甾烯成分含量以及透皮吸收比率的影響，酒制后，一方面小幅降低甾烯的含量；另一方面，通過(guò)使蟾酥中蟾毒蛋白變性，總體上提高了藥材的安全性。