環(huán)氧化物酶抑制劑NS-398聯(lián)合奧沙利鉑對宮頸癌HeLa細(xì)胞生長抑制及誘導(dǎo)凋亡作用的研究

王 靜 金 燕 董尚林 武 欣

1.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，河北張家口 075000；2.河北北方學(xué)院生命科學(xué)研究中心，河北張家口 075000；3.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院，河北張家口 075000；4.河北北方學(xué)院病理教研室，河北張家口 075000

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率居女性惡性腫瘤的第二位[1]，僅次于乳腺癌。近年來，宮頸癌的發(fā)病率逐年升高，并且發(fā)病逐漸低齡化，嚴(yán)重影響廣大女性的生活質(zhì)量，威脅女性的健康水平[2-4]。目前在宮頸癌的臨床治療中，化療仍然是術(shù)后輔助治療的重要手段[5]。傳統(tǒng)的化療藥物大多都對機(jī)體有神經(jīng)毒性、骨髓抑制等比較嚴(yán)重的毒副作用，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。所以，尋找一種化療效果好同時(shí)對機(jī)體毒副作用小的理想化療藥物是目前抗腫瘤基礎(chǔ)和臨床研究的熱點(diǎn)。奧沙利鉑（L-OHP）為第三代鉑類藥物，對多種腫瘤有效[6-8]，并且與傳統(tǒng)化療藥物比較，毒副作用小[9]。NS-398 為一種環(huán)氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）選擇性抑制劑，可抑制結(jié)腸癌、胃癌、膽管癌等多種腫瘤細(xì)胞生長[10-11]。本研究將NS-398 與L-OHP 聯(lián)合作用于宮頸癌HeLa 細(xì)胞株，觀察二者聯(lián)用對HeLa 細(xì)胞的抑制作用及誘導(dǎo)凋亡作用，以期為臨床宮頸癌的治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

人宮頸癌HeLa 細(xì)胞株由河北北方學(xué)院生命科學(xué)研究中心細(xì)胞室保存。RPMI 1640 培養(yǎng)基（美國Gibco公司，批號：1663936）；胎牛血清（Excell Bio 公司，批號：11H158）；DNA ladder 試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所，批號：C0007）；Annexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（BD 公司，批號：556547）；羅丹明染色試劑盒（凱基生物公司，批號：KGA217）；CCK-8 試劑（日本同仁化學(xué)研究所，批號：DC663）；NS-398（美國Cayman 公司，批號：70590）；L-OHP（深圳海王藥業(yè)有限公司，批號：2015060）。流式細(xì)胞儀（型號：FACS Aria，美國BD 公司）；多功能顯微鏡（型號：90i，日本尼康公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

HeLa 細(xì)胞株使用含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 的RPMI 1640 培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2、飽和水蒸氣。細(xì)胞鋪滿單層后，采用含EDTA 的胰蛋白酶消化傳代。實(shí)驗(yàn)細(xì)胞為對數(shù)生長期細(xì)胞。

1.3 CCK-8 實(shí)驗(yàn)

HeLa 細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化后用RPMI 1640 培養(yǎng)液重懸，接種至96 孔板（每孔2×104個(gè)細(xì)胞），置37℃、5%CO2、飽和水蒸汽條件下繼續(xù)培養(yǎng)至鋪滿單層后，分別單獨(dú)加入不同濃度NS-398（0、30、60 μmol/L）或L-OHP（0.0、2.5、5.0、10.0 mg/L），聯(lián)合用藥實(shí)驗(yàn)分別加入不同濃度的NS-398（30、60 μmol/L）和LOHP（2.5、5.0、10.0 mg/L）。每組4 個(gè)重復(fù)。置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每孔分別加入10 μL CCK-8 試劑后，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，用酶標(biāo)儀在450 nm 處測定吸光度值（OD），計(jì)算抑制率（IR）。

1.4 倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化

將HeLa 細(xì)胞接種至六孔板，待細(xì)胞鋪滿單層后分別加入藥物，設(shè)對照組、NS-398 組（60 μmol/L）、L-OHP 組（10 mg/L）以及聯(lián)合組（NS-398：60 μmol/L+L-OHP：10 mg/L）。置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。用倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.5 羅丹明123 染色

實(shí)驗(yàn)分組同“1.4”項(xiàng)下，藥物處理24 h 后，消化細(xì)胞，培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105個(gè)/mL 后，分別取1 mL 轉(zhuǎn)移至1.5 mL 離心管中，每管分別加入10 μL 羅丹明染色工作液，混勻后放入37℃溫箱中孵育20 min，離心，棄上清，PBS 洗兩次，用RPMI 1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，置37℃、5%CO2、飽和水蒸汽條件下繼續(xù)培養(yǎng)60 min 后，各組分別取100 μL，滴加到潔凈載玻片上，熒光顯微鏡觀察。

1.6 DNA ladder

取對數(shù)生長期HeLa 細(xì)胞，按照分組加入藥物處理，設(shè)對照組、NS-398 組（60 μmol/L。）、L-OHP 組（10 mg/L）以及聯(lián)合組（NS-398：60 μmol/L 和L-OHP：10 mg/L）。藥物作用后24 h，按照試劑盒說明書提取基因組DNA 后，行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照。

1.7 流式凋亡率

收集藥物作用后的HeLa 細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分組同“1.4”項(xiàng)下，PBS 洗滌兩次，計(jì)數(shù)后，每組取3×105個(gè)細(xì)胞，用100 μL Binding Buffer 重懸細(xì)胞。分別加入5 μL Annexin V 和5 μL PI，混勻后室溫避光孵育20 min后，加400 μL Binding Buffer 后上機(jī)檢測（激發(fā)波長Ex=488 nm；發(fā)射波長Em=530 nm）。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較，采用方差分析；兩兩比較，采用LSD-t 檢驗(yàn)。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NS-398 與L-OHP 對HeLa 細(xì)胞抑制率的影響

與未加藥物組比較，NS-398 單藥組和L-OHP單藥組抑制率明顯增高，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.01）；聯(lián)合組抑制率高于NS-398 單藥組和L-OHP 單藥組，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.01）。見表1。

表1 NS-398 與L-OHP 對HeLa 細(xì)胞抑制率的影響（%，±s,n=4）

表1 NS-398 與L-OHP 對HeLa 細(xì)胞抑制率的影響（%，±s,n=4）

注：與同濃度NS-398 單獨(dú)用藥比較，*P ＜0.01；與同濃度L-OHP 單獨(dú)用藥比較，#P ＜0.01。L-OHP：奧沙利鉑

2.2 倒置顯微鏡觀察結(jié)果

對照組細(xì)胞狀態(tài)良好，形態(tài)呈梭形，貼壁生長，細(xì)胞邊緣清晰，胞膜完整。NS-398 組細(xì)胞體積皺縮變小變圓，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)顆粒狀物質(zhì)，少量細(xì)胞從瓶底脫落，漂浮于培養(yǎng)液中。L-OHP 組細(xì)胞失去正常形態(tài)，皺縮變小，培養(yǎng)液中可見死細(xì)胞。聯(lián)合組培養(yǎng)液中可見大量死細(xì)胞和細(xì)胞碎片，僅余少量細(xì)胞貼在瓶底，且形態(tài)呈不同程度的皺縮，部分細(xì)胞破裂，細(xì)胞內(nèi)容物溢出。見圖1。

圖1 倒置顯微鏡觀察HeLa 細(xì)胞形態(tài)變化

2.3 羅丹明123 染色結(jié)果

羅丹明123 染色結(jié)果顯示，對照組無熒光；NS-398 組、L-OHP 組與聯(lián)合組熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，尤其以聯(lián)合組最為明顯。見圖2（封四）。

2.4 DNA Ladder 結(jié)果

聯(lián)合組有明顯的梯狀條帶出現(xiàn)；NS-398 組和LOHP 組有明顯的彌散現(xiàn)象出現(xiàn)；對照組即無彌散現(xiàn)象也無梯狀條帶出現(xiàn)。見圖3。

圖3 DNA 瓊脂糖凝膠電泳圖

2.5 流式細(xì)胞儀檢測HeLa 細(xì)胞早期凋亡率改變

NS-398 組和L-OHP 組凋亡率明顯高于對照組；聯(lián)合組凋亡率明顯高于NS-398 組、L-OHP組，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.01）。見表2。

表2 流式細(xì)胞儀檢測HeLa 細(xì)胞早期凋亡率改變（%，±s）

表2 流式細(xì)胞儀檢測HeLa 細(xì)胞早期凋亡率改變（%，±s）

注：與對照組比較，*P ＜0.01；與NS-398 組比較，#P ＜0.01；與L-OHP組比較，△P ＜0.01。L-OHP：奧沙利鉑

3 討論

近年來，宮頸癌的發(fā)病率逐年上升并且呈年輕化、低齡化的趨勢，已經(jīng)成為亟待解決的公共衛(wèi)生問題之一[12]。目前，宮頸癌的治療仍然以手術(shù)結(jié)合放化療為主，化療作為一種重要的術(shù)后輔助治療手段臨床應(yīng)用廣泛，但是傳統(tǒng)的化療藥物都有比較嚴(yán)重的毒副作用；在宮頸癌的治療中，單用一種化療藥物難以達(dá)到令人滿意的治療效果，因此尋找高效且毒副作用小的化療藥物以及改進(jìn)治療方案是目前臨床宮頸癌治療研究中的熱點(diǎn)。鉑類藥物是宮頸癌術(shù)后輔助化療的基礎(chǔ)用藥[13-14]，L-OHP 屬于第三代鉑類藥物，與傳統(tǒng)化療藥物比較，具有獨(dú)特的優(yōu)越性[15-17]，如無腎毒性、毒副作用輕，對腸癌、胃癌、肺癌等多種腫瘤有效[18]，具有廣泛的臨床應(yīng)用前景，是近幾年研究的熱點(diǎn)。

COX 是一種內(nèi)源性前列腺素合成過程中的限速酶，有COX-1 和COX-2 兩種同工酶，其中COX-2 靜息時(shí)不表達(dá)，在受到某些因素（如生長因子、細(xì)胞因子、癌基因產(chǎn)物、促癌劑等）刺激時(shí)才會迅速合成。COX-2 在多種腫瘤中高表達(dá)，同時(shí)在癌旁或癌周組織不表達(dá)或者低表達(dá)[19-20]，提示COX-2 與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。在宮頸癌有關(guān)的研究中也有人證實(shí)COX-2與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)[21-23]。因此COX-2 可作為宮頸癌治療的靶點(diǎn)之一，選擇性抑制COX-2 可以預(yù)防和治療宮頸癌。NS-398 屬于非甾體抗炎藥，是一種選擇性的COX-2 抑制劑。研究顯示[24-25]，NS-398 可以抑制COX-2 高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞生長，誘導(dǎo)其凋亡，而對COX-2 低表達(dá)的腫瘤細(xì)胞則無抑制作用。

如今，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是抗癌藥物研究中的熱點(diǎn)。細(xì)胞凋亡后會發(fā)生一系列的變化：凋亡早期，細(xì)胞膜會發(fā)生磷酯酰絲氨酸外翻；凋亡晚期，DNA 規(guī)律性斷裂；凋亡過程中線粒體膜電位也會發(fā)生變化。本研究將不同濃度的NS-398 和L-OHP 及兩者聯(lián)合分別作用于HeLa 細(xì)胞，用CCK-8 法、羅丹明123 染色法、流式細(xì)胞儀等多種方法觀察兩種藥物對HeLa 細(xì)胞的影響。CCK-8 結(jié)果顯示，兩種藥物聯(lián)用的抑制率高于二者單用。羅丹明123 染色結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組HeLa細(xì)胞染色后熒光強(qiáng)度有不同程度的增強(qiáng)，尤其以聯(lián)合組為著，提示各實(shí)驗(yàn)組均不同程度的存在線粒體膜電位的變化和細(xì)胞凋亡的發(fā)生。DNA Ladder 結(jié)果也提示聯(lián)合組細(xì)胞處于凋亡早期階段。

綜上所述，NS-398 和L-OHP 均可抑制HeLa 細(xì)胞生長，誘導(dǎo)其凋亡，兩種藥物聯(lián)用對HeLa 細(xì)胞的抑制作用優(yōu)于二者單用，提示兩種藥物聯(lián)用可提高抗癌效果，為指導(dǎo)臨床化療提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。但是僅研究NS-398 和L-OHP 對HeLa 細(xì)胞的抑制作用及誘導(dǎo)凋亡作用，對其誘導(dǎo)凋亡具體機(jī)制及二者聯(lián)用在體內(nèi)對癌細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)未進(jìn)行深入探討，這將是下一步研究的內(nèi)容。