反復(fù)喘息嬰幼兒外周血單核細(xì)胞中T-bet/GATA-3比值與潮氣呼吸肺功能及Th1/Th2細(xì)胞平衡的關(guān)系

陳國華 黃為民 潘志偉 白 珺

1.南方醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院附屬佛山市婦幼保健院兒科，廣東佛山 518000；2.南方醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院南方醫(yī)院新生兒科，廣東廣州 510515

喘息性疾病病因復(fù)雜，免疫及炎癥反應(yīng)失衡是其發(fā)生的核心環(huán)節(jié)[1]。輔助T 細(xì)胞（Th）是免疫調(diào)控因子，其中Th1 特征性分泌γ 干擾素（IFN-γ）；Th2 細(xì)胞特征性分泌白細(xì)胞介素-4（IL-4），Th2 細(xì)胞優(yōu)勢分化是氣道炎癥啟動的關(guān)鍵[2]。T-bet、GATA-3 是機(jī)體調(diào)控Th 細(xì)胞分化的轉(zhuǎn)錄因子，T-bet 能夠促進(jìn)Th1 細(xì)胞的分化，GATA-3 則能促進(jìn)Th2 細(xì)胞的形成，T-bet/GATA-3 比值可能是反映機(jī)體Th1/Th2 分化平衡的指標(biāo)之一[3]?？赏ㄟ^檢測潮氣呼吸肺功能評估嬰幼兒喘息性疾病肺功能，且評估準(zhǔn)確性較高[4]?，F(xiàn)階段關(guān)于T-bet/GATA-3 比值和反復(fù)喘息患兒潮氣呼吸肺功能及Th1/Th2 細(xì)胞的關(guān)系尚未可知，鑒于此，本研究探討三者之間的關(guān)系，以期為嬰幼兒喘息的診療提供新思路。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2018 年1 月—2019 年12 月南方醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院附屬佛山市婦幼保健院隨診的反復(fù)喘息嬰幼兒120 例為喘息組，其中男73 例，女47例；年齡12～36 個月，平均（23.25±7.82）個月；體重7～15 kg，平均（9.87±4.35）kg。納入標(biāo)準(zhǔn)：①反復(fù)喘息經(jīng)病史、體格檢查及胸片等確診；②反復(fù)喘息嬰幼兒表現(xiàn)為反復(fù)咳嗽且肺部有鳴音。排除標(biāo)準(zhǔn)：①支氣管或肺發(fā)育不良、先天性心臟病、氣管異物或發(fā)育畸形、胸廓畸形及早產(chǎn)兒；②免疫調(diào)節(jié)類藥物應(yīng)用史。另選擇同期體檢健康嬰幼兒60 名為對照組，其中男36 例，女24 例；年齡12～36 個月，平均（23.58±7.43）個月；體重8～15 kg，平均（9.66±4.48）kg。兩組性別、年齡、體重比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05），具有可比性。入組嬰幼兒家長知曉且簽署相關(guān)資料，本研究經(jīng)醫(yī)院倫醫(yī)學(xué)理委員會批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 T-bet、GATA-3 的檢測 抽取入組嬰幼兒清晨空腹靜脈血5 mL（2 份）。1 份經(jīng)1500 r/min 離心10 min（離心半徑14 cm），分離血清置于-20℃冷藏器中備用。另1 份按常規(guī)淋巴細(xì)胞分層密度離心法分離出單核細(xì)胞。嚴(yán)格按照試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司，貨號：DP419]操作說明，提取單核細(xì)胞中的總RNA，使用RT Kit 試劑盒[寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司，貨號：RR037A]將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，隨后使用LightCycler96 熒光定量PCR 儀進(jìn)行qRTPCR 擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性3 min，95℃變性30 s，60℃退火30 s，共40 個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。操作按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒[寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司，貨號：RR047A]說明書進(jìn)行。計算T-bet、GATA-3 的相對表達(dá)量及比值。T-bet 引物（上游：5’-TGGTCCAAGTTTAATCAGCACCAG-3’，下游：5’-CCCGGCCACAGTAAATGACAGG-3’）和GATA-3 引 物（上游：5’-CCTCATTAAGCCCAAGCGAAG-3’，下游：5’-TCCAGAGTGTGGTTGTGGTG-3’），β-actin 正向引物序列為5’-CAGCCATGTACGTTGCTATCCAGG-3’，反向引物序列為5’-AGGTCCAGACGCAGGATGGCATG-3’，引物均由北京博爾邁生物技術(shù)公司（北京）提供。

1.2.2 Th1、Th2 細(xì)胞的檢測 檢測采用流式細(xì)胞術(shù)，單核細(xì)胞經(jīng)磷酸鹽緩沖液液清洗-稀釋至1×106個/mL，后進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)（6 h）-磷酸鹽緩沖-室溫孵育-重懸，最后經(jīng)流式細(xì)胞儀收集并分析Th1、Th2 細(xì)胞比例，計算Th1/Th2 比值。

1.2.3 IFN-γ、IL-4 的檢測 嚴(yán)格按照檢測試劑盒操作說明，酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測血清中IFN-γ、IL-4水平，所有試劑盒購于美國貝克曼公司（貨號：2125813、2508024）。

1.2.4 潮氣呼吸肺功能的檢測 采用肺功能儀對入組嬰幼兒進(jìn)行潮氣呼吸肺功能檢測，檢測指標(biāo)包括：呼吸頻率（RR）、潮氣呼吸呼氣峰流速（PTEF）、潮氣量（VT）、達(dá)峰時間比（TPTEF/TE）、達(dá)峰容積比（VPEF/VE）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 23.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t 檢驗；計數(shù)資料用例數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗；相關(guān)性分析采用Pearson 相關(guān)分析。以P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組T-bet、GATA-3 比較

喘息組T-bet 和T-bet/GATA-3 比值明顯低于對照組，而GATA-3 明顯高于對照組（均P ＜0.01）。見表1。

表1 兩組T-bet、GATA-3 比較（±s）

表1 兩組T-bet、GATA-3 比較（±s）

2.2 兩組潮氣呼吸肺功能比較

喘息組RR、PTEF 水平明顯高于對照組，而VT、TPTEF/TE、VPEF/VE 明顯低于對照組（均P ＜0.01）。見表2。

表2 兩組潮氣呼吸肺功能比較（±s）

表2 兩組潮氣呼吸肺功能比較（±s）

注：RR：呼吸頻率；VT：潮氣量；TPTEF/TE：達(dá)峰時間比；VPEF/VE：達(dá)峰容積比；PTEF：潮氣呼吸呼氣峰流速

2.3 兩組Th1、Th2 及相關(guān)細(xì)胞因子比較

喘息組Th1、Th1/Th2、IFN-γ 水平明顯低于對照組，而Th2、IL-4 水平明顯高于對照組（均P ＜0.01）。見表3。

表3 兩組Th1、Th2 及相關(guān)細(xì)胞因子比較（±s）

表3 兩組Th1、Th2 及相關(guān)細(xì)胞因子比較（±s）

注：Th：輔助性T 細(xì)胞；IFN-γ：γ 干擾素；IL：白細(xì)胞介素

2.4 相關(guān)性分析

Pearson 相關(guān)性分析顯示，反復(fù)喘息嬰幼兒T-bet/GATA-3 比值與VT、TPTEF/TE、Th1/Th2 呈正相關(guān)（r=0.741、0.567、0.762，P ＜0.01），與RR 呈負(fù)相關(guān)（r=-0.717，P ＜0.01）。見圖1。

3 討論

喘息常見于兒童時期，其發(fā)生率明顯高于其他年齡段[5]，其原因復(fù)雜多樣，免疫缺陷、淋巴結(jié)核等均可導(dǎo)致喘息的發(fā)生，其病因診斷較為困難，預(yù)后差別較大[6-8]。因此，探索嬰幼兒反復(fù)喘息的發(fā)病機(jī)制、采取有效干預(yù)對改善患兒預(yù)后至關(guān)重要。

圖1 反復(fù)喘息嬰幼兒T-bet/GATA-3 比值與潮氣呼吸肺功能和Th1/Th2 的相關(guān)性分析結(jié)果

T-bet 最初由小鼠Th1 細(xì)胞株的cDNA 文庫中克隆而來，其與鼠類的T-bet 在氨基酸水平的同源性高達(dá)88%[9]。小鼠的T-bet 基因與氣道高反應(yīng)基因相連鎖，據(jù)此推測，人類T-bet 基因可能與氣道高反應(yīng)性疾病基因密切相關(guān)[10-11]。GATA-3 可調(diào)控免疫細(xì)胞的分化及炎癥因子的表達(dá)，故GATA-3 可能與嬰幼兒喘息性疾病密切相關(guān)[12-13]。唐聞瓊等[14]發(fā)現(xiàn)反復(fù)喘息嬰幼兒T-bet/GATA-3 比值顯著降低，且T-bet/GATA-3比值下降與患兒潮氣肺功能的損害有緊密聯(lián)系，提示T-bet、GATA-3 失衡與喘息性疾病密切相關(guān)。肺功能檢測是評估喘息病情的重要指標(biāo)，但嬰幼兒無法配合檢查，無法開展呼氣肺功能檢測[15]。而RR、TPTEF/TE、VPEF/VE 等指標(biāo)可較好地反映氣道阻塞情況，且只需患兒平靜呼吸、無需配合[16]。本研究結(jié)果顯示與對照組比較，喘息組T-bet、T-bet/GATA-3 比值、VT、TPTEF/TE、VPEF/VE 明顯降低，GATA-3、RR、PTEF明顯升高（均P ＜0.01）；而T-bet/GATA-3 比值與VT、TPTEF/TE 呈正相關(guān)，與RR 呈負(fù)相關(guān)（均P ＜0.01）。提示T-bet/GATA-3 比值的下降與患兒潮氣肺功能的減弱具有密切的關(guān)系，可能是由于T-bet/GATA-3的紊亂，引起IL-4、IL-5 等炎癥因子分泌增多及氣道高反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致氣道炎性增、阻塞，最終引起潮氣肺功能的減弱[10-12]。

細(xì)胞因子由免疫效應(yīng)細(xì)胞分泌，其參與抗原的呈提、炎癥細(xì)胞的激活等環(huán)節(jié)[17]。目前，參與喘息性疾病進(jìn)展的細(xì)胞因子超過10 種，其中以IFN 和IL 最為重要，二者對氣道炎癥反應(yīng)具有重要的調(diào)控作用[18]。Th1細(xì)胞和Th2 細(xì)胞來源于同一Th 前體細(xì)胞，正常情況下Th1 和Th2 細(xì)胞分化均衡，在機(jī)體中形成復(fù)雜有序的網(wǎng)絡(luò)以維持正常免疫應(yīng)答[19]。Th1 細(xì)胞特征性分泌IFN-γ，進(jìn)而抑制Th2 細(xì)胞的分化，拮抗Th2 細(xì)胞因子（IL-4）依賴型IgE 免疫球蛋白的產(chǎn)生，減少抗原所致的氣道炎癥浸潤[20-21]。Th2 細(xì)胞特征性分泌IL-4，進(jìn)而上調(diào)血管間黏附分子、C-C 趨化因子及選擇素的表達(dá)，激活炎癥細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)，導(dǎo)致氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性的發(fā)生[22]。Th 前體細(xì)胞分化方向受T-bet和GATA-3 的調(diào)控[23]，T-bet 能夠促進(jìn)Th1 細(xì)胞的分化；而GATA-3 促進(jìn)Th2 細(xì)胞的分化，減少IFN-γ 的生成[24-25]。因此，T-bet 和GATA-3 的檢測可評估機(jī)體Th1、Th2 細(xì)胞的分化平衡情況。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，喘息組Th1、Th1/Th2、IFN-γ 明顯降低，而Th2、IL-4 明顯升高（均P ＜0.01）；且T-bet/GATA-3比值與Th1/Th2 呈正相關(guān)（P ＜0.01）。提示T-bet/GATA-3 比值可較好地反映Th1/Th2 細(xì)胞失衡情況，原因在于T-bet 的下降減弱了Th1 細(xì)胞的分化，而GATA-3 的升高加強(qiáng)了Th2 的增殖，導(dǎo)致Th1/Th2 下降[9,26-27]。此外，IFN-γ 的降低、IL-4 的升高，說明T-bet/GATA-3 比值下降對Th1/Th2 細(xì)胞因子分泌的失衡起到促進(jìn)作用，IFN-γ 的氣道保護(hù)作用降低而IL-4的促炎效應(yīng)增強(qiáng)，進(jìn)而導(dǎo)致氣道高反應(yīng)及過度炎癥反應(yīng)，引發(fā)嬰幼兒反復(fù)喘息的發(fā)作。

綜上所述，反復(fù)喘息嬰幼兒外周血單核細(xì)胞中T-bet/GATA-3 比值下降，且與患兒潮氣肺功能及Th1/Th2 細(xì)胞介導(dǎo)的免疫失衡密切相關(guān)，可能為反復(fù)喘息嬰幼兒的診療提供新思路。