祖卡木顆粒治療新型冠狀病毒肺炎的潛在物質(zhì)基礎(chǔ)研究

范晨陽 馬 璇,2 季志紅 李柯翱 李治建

1.新疆奇沐醫(yī)藥研究院（有限公司）研發(fā)部，新疆烏魯木齊 830011；2.新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，新疆烏魯木齊 830011 3.新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所毒理學(xué)研究室，新疆烏魯木齊 830049

自2019 年12 月新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）發(fā)生以來，全球感染人數(shù)不斷增加，國家衛(wèi)生健康委員會發(fā)布的《關(guān)于印發(fā)新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案》，從第3 版到第7 版均推薦使用中醫(yī)藥[1-2]。不同地區(qū)根據(jù)各地特點制訂了適合的防治方案[3]。新疆也制訂了相應(yīng)的中醫(yī)藥防治方案，其中《新疆維吾爾自治區(qū)新型冠狀病毒感染的肺炎維吾爾醫(yī)診療專家共識》指出如屬于濕熱的血液質(zhì)腐濁型患者，推薦使用祖卡木顆粒[4-5]，已報道的文獻(xiàn)顯示祖卡木顆粒具有抗病毒與抗炎的作用[6]，對于感冒引起的咳嗽、發(fā)熱無汗、咽喉腫痛、鼻塞流涕等癥具有顯著的療效[7]。

本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析技術(shù)探究祖卡木顆粒中山柰、睡蓮花、薄荷等十味藥材的活性成分及其參與治療COVID-19 的物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機(jī)制，運用分子對接技術(shù)探索其分子生物學(xué)方面潛在的作用機(jī)制。

新型冠狀病毒3CL 水解酶（SARS-CoV-2 3CL 水解酶）是冠狀病毒的主要蛋白之一，在病毒的增殖過程中發(fā)揮重要作用，其基因具有高度的保守性，被作為藥物設(shè)計的關(guān)鍵靶點[8-10]。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶Ⅱ（ACE2）受體結(jié)合域是COVID-19 S 蛋白與ACE2 受體結(jié)合的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，其與ACE2 的親和力與病毒傳播速度有關(guān)。兩者結(jié)合可激活宿主免疫系統(tǒng)，從而啟動“炎癥風(fēng)暴”，本研究從阻斷炎癥風(fēng)暴，干預(yù)病情進(jìn)展的角度[11]，選取SARS-CoV-2 3CL 水解酶和ACE2 蛋白作為受體蛋白進(jìn)行分子對接研究。

1 方法

1.1 祖卡木顆粒中活性成分篩選與靶點蛋白搜集

利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺（TCMSP）（http：//tcmspw.com/tcmsp.php），在“Herb name”檢 索欄，分別以“山柰”“薄荷”“大棗”“甘草”“大黃”“罌粟殼”為關(guān)鍵詞檢索，獲取各味藥材化學(xué)成分。在中國知網(wǎng)以2000 年1 月1 日—2020 年4 月1 日為檢索時限，分別以“睡蓮花”“洋甘菊”“破布木果”“蜀葵子”為關(guān)鍵詞檢索文章，獲取各味藥材所含的化學(xué)物質(zhì)。以口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18 為條件，分析篩選祖卡木顆粒的活性成分。利用TCMSP數(shù)據(jù)庫中的靶點預(yù)測功能，搜索祖卡木顆粒中活性成分主要作用的靶點，運用Uniprot 數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/），通過導(dǎo)入蛋白名稱并限定物種為“Homo sapiens”，將檢索得到的所有蛋白靶點校正為Uniprot ID，并得到靶點蛋白所對應(yīng)的基因。

1.2 祖卡木顆粒藥材-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將“1.1”項篩選的祖卡木顆粒中活性成分及其作用靶點基因名導(dǎo)入Cytoscape3.7.2 軟件，以此構(gòu)建“藥材-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)。對祖卡木顆粒中每個藥材所含活性成分及其調(diào)控靶點進(jìn)行可視化分析。

1.3 COVID-19 靶點的收集及潛在靶點預(yù)測

在NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/）gene 數(shù)據(jù)庫，輸入關(guān)鍵詞為“Novel coronavirus”，選擇“Homo sapiens”為物種，得到COVID-19 相關(guān)基因。在GeneCards數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/），輸入關(guān)鍵詞為“Novel coronavirus”，檢索COVID-19 相關(guān)基因，使用Venny 2.1.0 軟件，將祖卡木顆粒的靶點與COVID-19的靶點進(jìn)行映射，獲取祖卡木顆粒治療COVID-19 的潛在靶點。

1.4 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI）及藥物-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)

將“1.3”項獲得的靶點導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/cgi/input.pl），以此構(gòu)建潛在靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI），通過Cytoscape3.7.2 軟件，構(gòu)建藥物-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)，對祖卡木顆粒治療COVID-19 的成分與靶點進(jìn)行可視化分析，選取度值最大的9 個成分作為核心成分。

1.5 潛在靶點通路富集分析

為進(jìn)一步觀察潛在靶點的生物學(xué)功能，使用Bioconductor 生物信息軟件包，利用Rx64 3.6.2 進(jìn)行基因本體（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）信號通路富集分析，并繪制成柱狀圖和氣泡圖。將潛在靶點與KEGG 信號通路導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件，進(jìn)行基因-通路網(wǎng)絡(luò)分析，篩選出關(guān)鍵靶點與顯著富集的信號通路并進(jìn)行可視化。

1.6 核心成分-靶點分子對接

將“1.4”項下獲得的祖卡木顆粒核心成分分別與SARS-CoV-2 3CL 水解酶和ACE2 蛋白進(jìn)行分子對接，分析其潛在結(jié)合位點。先從RSCBPDB 數(shù)據(jù)庫（https：//www.rcsb.org/）下載SARS-CoV-2 3CL 水解酶和ACE2 的3D 結(jié)構(gòu)pdb 格式文件，用Mgltools1.5.6處理，通過加氫，計算電荷，合并非極性氫后保存成pdbqt 文件。在TCMSP 平臺下載核心成分的3D 結(jié)構(gòu)，然后用Mgltools1.5.6 處理，通過加氫，計算電荷，合并非極性氫后保存成pdbqt 文件。分別將SARSCoV-2 3CL 結(jié)構(gòu)原配體位置、ACE2 全局位點作為結(jié)合位點，設(shè)置Grid Box 坐標(biāo)和盒子大小，運用Autodock vina.1.1.2 進(jìn)行分子對接，PyMol 2.3.0 進(jìn)行構(gòu)象的處理。

2 結(jié)果

2.1 祖卡木顆粒中活性成分及其潛在靶點

通過“1.1”項研究，共獲得祖卡木顆粒中746 個化合物，再以O(shè)B≥30%和DL≥0.18 為篩選條件，剔除不符合條件的成分，篩選出祖卡木顆粒中活性成分166 個，去掉重復(fù)后共獲得125 個活性成分。通過TCMSP 平臺檢索125 個活性成分的潛在靶點，借助Uniprot 數(shù)據(jù)庫對靶點及其對應(yīng)的基因進(jìn)行搜集與記錄，最終獲得祖卡木顆粒125 個活性成分和252 個靶點。

2.2 祖卡木顆粒藥材-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)

通過“1.2”項研究繪制出藥材-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)包含377 個節(jié)點和2067 條邊，見圖1。其中9 個共有成分，MOL000096（兒茶素）來自于大黃和大棗，MOL000098（槲皮素）來自于大棗、甘草、睡蓮花和蜀葵子，MOL000211（丁子香萜）來自于大棗和甘草，MOL000358（β-谷甾醇）來自于大黃、大棗、破布木果，MOL000359（谷甾醇）來自于薄荷和甘草，MOL000422（山柰酚）來自于甘草、山柰和蜀葵子，MOL000471（蘆薈大黃素）來自于薄荷和大黃，MOL000787（延胡索堿）來自于大棗和罌粟殼、MOL004328（柚皮素）來自于薄荷和甘草。

圖1 祖卡木顆粒藥材-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)

2.3 祖卡木顆粒治療COVID-19 潛在靶點預(yù)測

通過“1.3”項研究，運用NCBI 和GeneCards 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，分別得到COVID-19 的潛在靶點48 個和350 個，去掉重復(fù)后，最終得到COVID-19 相關(guān)靶點352 個。運用Venny 2.1.0 將祖卡木顆?；钚猿煞终{(diào)控的252 個靶點與COVID-19 的352 個靶點取交集，得到50 個交集靶點，見圖2。

圖2 祖卡木顆粒治療COVID-19 靶點韋恩圖

2.4 祖卡木顆粒治療COVID-19 的PPI 網(wǎng)絡(luò)

將“2.3”項下獲得的50 個交集靶點基因?qū)氲絊TRING 數(shù)據(jù)庫，得到潛在靶點的PPI 網(wǎng)絡(luò)見圖3，PPI 網(wǎng)絡(luò)包含50 個節(jié)點和654 條邊，其中八邊形節(jié)點表示靶點蛋白，度值表示節(jié)點的重要性，其中靶點節(jié)點度值中位數(shù)為28，平均節(jié)點度值為26.2，超過平均度值的靶點有27 個。

2.5 祖卡木顆粒藥材-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)

尋找“2.3”項下獲得的50 個交集靶點基因在祖卡木顆粒中對應(yīng)的活性成分，共得到50 個基因的114 個活性成分。將其導(dǎo)入Cytoscape3.7.2 中，得到祖卡木顆粒藥材-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)圖4，網(wǎng)絡(luò)包含164 個節(jié)點和501 條邊。圓形代表基因，三角形代表活性成分。選取度值最大的成分和基因作為核心成分與核心基因，由圖4 可見，核心基因有GTPS2、PPARG、MAPK14、NOS2、GTPS1 和DPP4 等，核心成分有槲皮素、木犀草素、山柰酚、柚皮素、金合歡素、甘草查爾酮、蘆薈大黃素、異鼠李糖和β-谷甾醇等。

圖3 祖卡木顆粒與COVID-19 交集靶點的PPI 網(wǎng)絡(luò)

2.6 潛在靶點通路分析

借助R 語言對“2.3”項下獲得的50 個交集靶點基因進(jìn)行GO 富集分析，1876 項被顯著富集（P ≤0.05），其中生物過程1754 項，細(xì)胞組成33 項，分子功能89 項，前20 項顯著富集的生物過程、細(xì)胞組成和分子功能結(jié)果見圖5（封三）。

圖4 祖卡木顆粒藥材-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)圖

圖5 祖卡木顆粒潛在靶點的GO 富集分析的前20 個通路（見內(nèi)文第12 頁）

GO 富集分析主要集中在生物過程中，顯著富集主要涉及對脂多糖的反應(yīng)（response to lipopolysaccharide）、細(xì)胞對生物刺激的反應(yīng)（cellular response to biotic stimulus）等；細(xì)胞組成顯著富集主要涉及脂膜筏（membrane raft）、脂膜微結(jié)構(gòu)域（membrane microdomain）和脂膜區(qū)（membrane region）；分子功能顯著富集主要涉及細(xì)胞因子受體結(jié)合（cytokine receptor binding）、細(xì)胞因子活性（cytokine activity）等。

對“2.3”項下獲得的50 個交集靶點基因進(jìn)行KEGG 通路富集分析，155 條信號通路（P ≤0.05）顯著富集，前20 條顯著富集信號通路結(jié)果見圖6（封三）。顯著富集的通路涉及糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、乙型肝炎（Hepatitis B）等。

圖6 祖卡木顆粒潛在靶點KEGG 富集分析的前20 條通路（見內(nèi)文第12 頁）

2.7 基因-通路網(wǎng)絡(luò)分析

將“2.3”項下獲得的50 個交集靶點基因與“2.6”項下獲得的KEGG 通路導(dǎo)入Cytoscape3.7.2 中，選取betweenness centrality（BC）大于中位數(shù)的節(jié)點，可視化得到祖卡木顆粒治療COVID-19 基因-通路網(wǎng)絡(luò)見圖7。內(nèi)圈圓形代表基因，外圈圓形代表通路。網(wǎng)絡(luò)圖顯示MAPK1 的BC 最大，是調(diào)控信號通路的核心基因，其他幾個基因也有較大的BC，如MAPK3、RELA、MAPK8 等。他們可能是祖卡木顆粒治療COVID-19的主要基因。

2.8 分子對接

祖卡木顆粒中核心成分與SARS-CoV-23CL 水解酶和ACE2 結(jié)合能均＜-5.0 kJ/mol。由此可見祖卡木顆粒中的核心成分與SARS-CoV-2 3CL 水解酶和ACE2 形成構(gòu)象能量低，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，結(jié)合活性較高，可能是祖卡木顆粒治療COVID-19 的主要成分。見表1。

槲皮素、山柰酚、木犀草素與SARS-CoV-2 3CL水解酶和ACE2 構(gòu)象見圖8。由圖可見，槲皮素與SARS-CoV-2 3CL 水解酶的結(jié)合位點為SER-144，LEU-141、ARG-188、CYS-145、HIS-163，山柰酚與SARS-CoV-2 3CL 水解酶的結(jié)合位點為ASP-187、TYR-54、SER-144，木犀草素與SARS-CoV-2 3C 水解酶的結(jié)合位點為GLY-143、HIS-163、SER-144、CYS-145；槲皮素與ACE2 結(jié)合位點為GLU-406、ARG-518、GLU-402、HIS-374，山柰酚與ACE2 結(jié)合位點為GLU-402、ARG-518、HIS-374、HIS-345，木犀草素與ACE2 結(jié)合位點為GLU-406、ASN-277。

3 討論

分子對接結(jié)果顯示槲皮素、山柰酚、木犀草素、柚皮素、金合歡素、甘草查爾酮和蘆薈大黃素等成分可能是祖卡木顆粒治療COVID-19 的潛在物質(zhì)基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素具有抗病毒、抗炎和免疫調(diào)節(jié)等藥理作用[12]，可能參與基于白細(xì)胞介素（IL）-6、IL-1β 調(diào)控的NF-κB 信號通路（hsa04064）對支氣管炎起到治療作用[13]，參與CASP3 調(diào)控的細(xì)胞凋亡信號通路（hsa04210）發(fā)揮抗病毒作用[14]，這與本研究“2.7”項下結(jié)果一致。山柰酚具有抗氧化、抗炎、抗癌、抗糖尿病、抗骨關(guān)節(jié)炎和免疫調(diào)節(jié)等多種藥理活性[15]，是祖卡木顆粒質(zhì)量控制主要成分之一，山柰、蜀葵子和甘草藥材中均含有山柰酚成分，其通過IL-6 等炎癥因子參與機(jī)體對抗急性和慢性炎癥[16-17]。木犀草素和柚皮素具有抗病毒、抗炎等作用[18-19]。金合歡素與糖分子結(jié)合形成的黃酮苷類化合物金合歡素-7-O-葡萄糖苷通過腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和VCAM-1 調(diào)控NF-κB的激活[20-22]。甘草查耳酮通過抑制一氧化氮合成和IL-6 的產(chǎn)生從而調(diào)控NF-κB 信號通路發(fā)揮抗炎、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)作用[23]。蘆薈大黃素具有阻滯細(xì)胞周期、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和抗腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移作用，是一種重要的抗腫瘤藥物[24-25]。綜上所述，祖卡木顆粒中篩選出的活性成分主要有抗病毒、抗炎、免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤等作用，可能在治療COVID-19 時發(fā)揮抗病毒、抗炎及免疫調(diào)節(jié)的作用。

圖7 祖卡木顆粒治療COVID-19 基因-通路網(wǎng)絡(luò)

表1 祖卡木顆粒中核心成分與SARS-CoV-2 3CL水解酶及ACE2 的結(jié)合能（kJ/mol）

基因-通路網(wǎng)絡(luò)分析顯示，MAPK3、RELA、MAPK8、PRKCB、PRKCA、IL-6、TP53、MAPK14 和IL1B 是富集比較顯著的基因，其中絲裂原活化蛋白激酶家族（MAPKs）在病毒感染的環(huán)境應(yīng)激下被激活，MAPK3，MAPK1 和MAPK8 對細(xì)胞炎癥反應(yīng)和腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、轉(zhuǎn)化和凋亡的調(diào)控均有顯著影響[26-27]。RELA以一種弱的結(jié)合方式結(jié)合在NF-κB 復(fù)合物中，可以直接參與DNA 結(jié)合，除了可以直接激發(fā)轉(zhuǎn)錄激活劑的活性外，它還能夠調(diào)節(jié)啟動子對轉(zhuǎn)錄因子的可及性，從而間接調(diào)節(jié)基因表達(dá)；通過與DDX1 的結(jié)合與NFκB 啟動子區(qū)的染色質(zhì)結(jié)合，對T 細(xì)胞中細(xì)胞因子基因表達(dá)至關(guān)重要[28]。NF-κB 同二聚體RELA-RELA 復(fù)合物可能參與了侵襲素介導(dǎo)的IL-8 表達(dá)激活。PRKCB 通過調(diào)節(jié)BCR 誘導(dǎo)的NF-κB 活化在B 細(xì)胞活化中起關(guān)鍵作用。通過直接磷酸化SER-559、SERr-644 和SER-652 處的CARD11/CARMA1，介導(dǎo)NF-κB 途徑（NF-κB1）的激活[29]。文獻(xiàn)報道動態(tài)觀察IL-6 水平有助于了解感染性疾病的進(jìn)展和對治療的反應(yīng)，IL-6 水平在正常組與治療組的水平規(guī)律為正常組＜輕癥組＜重癥組，在發(fā)布的《新型冠狀病毒感染肺炎診療方案（試行第七版）》中，IL-6 已經(jīng)被定為病情惡化的臨床警示指標(biāo)[30-32]。祖卡木顆粒50 個潛在靶點主要涉及病毒感染、炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)等方面。

在前20 條顯著富集的KEGG 信號通路中，與病毒感染相關(guān)的有12 條，分別為甲型流感、百日咳、利什曼病、乙型肝炎、丙型肝炎、肺結(jié)核、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、人巨細(xì)胞病毒感染、麻疹、人類免疫缺陷病毒-1 感染、人乳頭瘤病毒感染和Epstein-Barr 病毒感染，這預(yù)示著祖卡木顆粒在抗病毒中發(fā)揮重要的作用。

圖8 槲皮素、山柰酚、木犀草素與SARS-CoV-2 3CL水解酶及ACE2 的分子對接模式