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    核黃素超聲結(jié)晶工藝優(yōu)化

    2021-03-08 01:22:08陳亮田飛豹辛秀蘭蘭蓉于然吳志明梁浩
    化工進展 2021年2期
    關(guān)鍵詞:核黃素濾液純度

    陳亮,田飛豹,辛秀蘭,蘭蓉,于然,吳志明,梁浩,3

    (1 北京電子科技職業(yè)學(xué)院生物工程學(xué)院,北京100176;2 北京化工大學(xué)化工資源有效利用國家重點實驗室,北京100029;3 北京化工大學(xué)秦皇島環(huán)渤海生物產(chǎn)業(yè)研究院,河北秦皇島066000)

    核黃素,別名維生素B2,是維生素B族的重要組成部分,其前身為維生素G,分子式為C17H20N4O6,分子量376.37,CAS 號為83-88-5,根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)對其命名為7,8-二甲基-10(1’-D-核糖醇基)-異咯嗪[1],結(jié)構(gòu)式見圖1。

    圖1 核黃素結(jié)構(gòu)式

    核黃素是生物體內(nèi)黃素的主要來源,其衍生物黃素單核苷酸(FMN)和黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)是大多數(shù)黃素輔酶不可或缺的活性基團。這些黃素輔酶在體內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)、蛋白折疊、DNA 修復(fù)、脂肪酸β-氧化、氨基酸氧化和膽堿代謝等生理功能方面發(fā)揮著重要的作用[2-7]。研究發(fā)現(xiàn),核黃素可以改善不同疾病常規(guī)治療的效率[8-10]、發(fā)揮保護組織免受氧化損傷[11-13]等輔助功效。美國食品營養(yǎng)委員會推薦成人每日攝取核黃素的劑量是0.9~1.3mg。其不僅被廣泛應(yīng)用于臨床中,而且由于其無毒害并顏色呈黃色,也經(jīng)常作為營養(yǎng)添加劑和色素應(yīng)用在食品工業(yè)中[14]。核黃素是進入國際市場上較早的幾個維生素之一,國內(nèi)外臨床應(yīng)用、保健、抗衰老類制劑超過二百多種,由于食品工業(yè)、保健品及營養(yǎng)添加劑工業(yè)的快速發(fā)展,市場對核黃素的需求也將不斷上升。

    核黃素的晶習(xí)一般分為三種,即針狀、粉末狀和塊狀。目前大多數(shù)是針狀的結(jié)晶體,但是其堆密度小,流動性能差,加工性能差,處理難度大,最終會影響壓片等加工性能。Saprykin 等[15]研究表明可以通過使用膠黏劑來提高核黃素的加工性能,然后使用硫化床進行噴霧干燥從而提高流動性能,但是這種方法過程繁雜,成本也會增高。溶液結(jié)晶經(jīng)常被用于有機可溶性物質(zhì)以及無機鹽的分離純化,溶液結(jié)晶不僅可以把溶質(zhì)轉(zhuǎn)變成固體從溶液中分離,而且還被廣泛應(yīng)用于晶體物質(zhì)的純化。當超聲波被施加到溶液中的介質(zhì)時,不僅可以使介質(zhì)的運動速度加快,而且還能產(chǎn)生聲空化作用。液體溶液在超聲波的作用下會形成局部的負壓區(qū),在負壓區(qū)中介質(zhì)分子比較稀疏、離散,密度減少從而形成空化氣泡,經(jīng)過超聲波的正負交變,也會產(chǎn)生正壓區(qū),在正壓區(qū)會使介質(zhì)密度增大。當超聲波作用足夠強大時,就會使氣泡被壓縮,從而使氣泡體積減小,當超過氣泡的承受能力后,空化氣泡就變得不穩(wěn)定,從而潰陷并逐步消失。超聲結(jié)晶方法被認為是作為實現(xiàn)更快及均勻形成初級成核,并能在較低的過飽和水平下相對容易成核,來減少晶體結(jié)塊的一個有效途徑,能夠顯著地改善產(chǎn)品的工藝和物理特性[16]。因此,本文對核黃素超聲輔助結(jié)晶進行研究,包括結(jié)晶方法的篩選、超聲輔助條件的優(yōu)化并進行產(chǎn)品表征。

    1 材料及方法

    1.1 材料與儀器

    核黃素標準品(純度>98%)和核黃素粗品(飼料級,80%),赤峰制藥廠;鹽酸、乙酸鈉、冰乙酸、無水乙醇、氫氧化鈉,均為分析純,北京試劑廠;去離子水,實驗室自制。

    紫外分光光度計,UV-2450,日本島津公司;電子天平,Sartorius-BT25s,賽多利斯科學(xué)儀器有限公司;超聲波細胞破碎儀,Biosafer 3D,寧波生物科技有限公司;光學(xué)顯微鏡,BME,LEICA;電子顯微鏡,H-800,日本日立公司。

    1.2 核黃素含量測定

    1.2.1 核黃素的光譜掃描[17]

    稱取核黃素標準品15.0mg,加入5mL 0.25%冰乙酸溶液,加熱攪拌使核黃素充分溶解。隨后轉(zhuǎn)入100mL 容量瓶定容。取10mL 上述溶液,再用5mL 0.25%冰乙酸溶液定容至100mL,用蒸餾水作為空白,用紫外分光光度計進行光譜掃描,選擇444nm作為測量核黃素的波長。

    1.2.2 核黃素標準曲線的繪制

    取10mg 核黃素,加入0.25%冰乙酸溶液,加熱溶解后用去離子水定容到100mL。取上述標準液0、2.5mL、5mL、7.5mL、10mL、12.5mL、15mL,分別用0.25% 冰乙酸溶液定容到50mL,并在444nm處測定其吸光度值,記錄數(shù)據(jù),繪制標準曲線,根據(jù)吸光度值Y 與濃度x 建立回歸方程Y=28.354x+0.0138,相關(guān)系數(shù)R2=0.9992,其在0.005~0.03mg/mL濃度范圍內(nèi)線性良好。

    1.2.3 核黃素純度測定

    準確稱量核黃素樣品少許,加入0.25%冰乙酸溶液稀釋,在444nm處測定吸光度值,根據(jù)核黃素標準曲線計算出核黃素純度(%)。

    1.3 結(jié)晶方法的篩選[18-20]

    1.3.1 溶劑析出法

    稱取2.0g 核黃素粗品,加入10mL 36%(質(zhì)量分數(shù))濃鹽酸溶解,在50℃條件下以300r/min的轉(zhuǎn)速加熱攪拌30min,然后加入200mL 90℃水,95℃繼續(xù)加熱2h,自然冷卻至室溫,抽濾,記錄濾液體積并測量濾液中的核黃素濃度,固體物質(zhì)烘干得到樣品。

    1.3.2 溶劑析出結(jié)合酸溶法

    稱取2.0g 核黃素粗品,加入16mL 23.8%(質(zhì)量分數(shù))鹽酸溶液溶解,在30℃條件下以300r/min的轉(zhuǎn)速攪拌30min,加入40mL 水,抽濾,記錄濾液體積并測量濾液中的核黃素濃度,固體物質(zhì)烘干得到樣品。

    1.3.3 控制結(jié)晶法

    稱取核黃素粗品2.0g,用120mL 水溶解,在80℃條件下加熱回流30min,然后升溫至100℃加熱回流1h,降溫至30℃,抽濾,用40mL 40℃水沖洗,再用40mL 甲醇沖洗,記錄濾液體積并測量濾液中核黃素的濃度,固體物質(zhì)烘干得到樣品。

    1.3.4 酸溶法

    稱取核黃素粗品2.0g,加入60mL 0.3%(質(zhì)量分數(shù))鹽酸溶液,在80℃條件下加熱回流30min,迅速冷卻至室溫,抽濾,記錄濾液體積并測量濾液中的核黃素濃度,固體物質(zhì)烘干得到樣品。

    1.3.5 堿溶法

    稱取核黃素粗品2.0g,加入40mL pH 為12 的氫氧化鈉溶液進行溶解,過濾,濾液邊攪拌邊加入0.2%~0.25%(質(zhì)量分數(shù))雙氧水20mL,攪拌1h,然后加酸調(diào)節(jié)pH 至4,抽濾,記錄濾液體積并測量濾液中的核黃素濃度,固體物質(zhì)烘干得到樣品。

    經(jīng)上述方法處理后,樣品稱重,測定收率(%)和純度(%),計算出綜合效益(%)。綜合效益(%)=收率×純度×100%。

    1.4 結(jié)晶影響因素的探討

    采用對比5種不同結(jié)晶純化方法,根據(jù)綜合效益篩選出最好的方法是酸溶法,在此基礎(chǔ)上加入超聲波作用,進一步探討超聲時間、功率和溫度對核黃素的純度、收率以及結(jié)晶度和晶習(xí)等方面的影響。

    分別稱取核黃素粗品2.0g,加入60mL 0.3%(質(zhì)量分數(shù))鹽酸溶液,80℃條件下加熱回流30min,迅速冷卻至室溫,接著分別在不同時間(15min、 25min、 40min)、 不 同 功 率(200W、400W、500W)以及不同溫度(30℃、40℃、50℃)這3 個參數(shù)變量條件下進行超聲處理,冷卻至30℃,抽濾,水洗,甲醇洗,記錄濾液體積并測量核黃素濃度,固體物質(zhì)烘干得到樣品,計算收率、純度和綜合效益。

    1.5 核黃素超聲結(jié)晶后的表征分析

    分別采用光學(xué)顯微鏡、投射電子顯微鏡及X射線衍射(XRD)對超聲輔助結(jié)晶純化的核黃素以及未進行超聲輔助的核黃素進行結(jié)構(gòu)分析。

    1.5.1 光學(xué)顯微鏡及電子顯微鏡觀察結(jié)構(gòu)

    分別取超聲輔助結(jié)晶及未超聲輔助結(jié)晶的核黃素樣品各10mg溶于1mL鹽酸-乙醇溶液中,混合均勻,各取1滴于載玻片及300 目銅網(wǎng)上,在載玻片上覆蓋潔凈的蓋玻片,編號標記,使用光學(xué)顯微鏡及電鏡觀察結(jié)構(gòu)。

    1.5.2 XRD分析晶型

    分別取超聲輔助結(jié)晶及未超聲輔助結(jié)晶的核黃素樣品于80℃下干燥2h,研成粉末,各取少許于XRD 載物臺上進行檢測,計算結(jié)晶度(%)。結(jié)晶度(%)=非晶峰的積分強度/(非晶峰的積分強度+結(jié)晶部分的積分強度)×100%。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 結(jié)晶方法的篩選

    表1 列出了5 種核黃素結(jié)晶方法純化后的結(jié)果,溶劑析出法是基于被分離組分與溶劑分子間相互作用力的差異,本實驗中以鹽酸作為溶劑,以水作為析出劑,結(jié)晶時間長,影響因素較多不易控制;溶劑析出結(jié)合酸溶法綜合效益相對溶劑析出法好;控制結(jié)晶法是以水作為溶劑,操作復(fù)雜,用時較長;酸溶法以鹽酸為溶劑,溶解核黃素,最后結(jié)晶,操作簡便,用時較短;堿溶法利用核黃素在堿性條件下溶解度大,但核黃素在堿溶液中易分解,同時需要經(jīng)雙氧水氧化,操作復(fù)雜且用時較長。因此,在5種結(jié)晶純化方法中,酸溶法耗時短、操作簡便、綜合效益最高,故后續(xù)實驗采用酸溶法進行研究。

    2.2 結(jié)晶影響因素的探討

    傳統(tǒng)的結(jié)晶方法中由于晶體生長過程的復(fù)雜性,在晶體成形的過程中伴隨著溶液過飽和、成核、晶體生長和集聚,因此產(chǎn)品工業(yè)中試放大面臨著極大的挑戰(zhàn)。但是當超聲引入溶液結(jié)晶,可以極大地改進結(jié)晶過程,改善核黃素晶體形狀,使粒度分布均勻[16,21-23],故實驗通過在核黃素酸溶法結(jié)晶的基礎(chǔ)上添加超聲波,探索其對于結(jié)晶效果的影響。

    表1 5種核黃素結(jié)晶方法的收率和純度

    2.2.1 超聲時間對超聲結(jié)晶純度與收率的影響

    在結(jié)晶純化方法中加入超聲輔助作用,在不用超聲時間條件下,所得到的實驗結(jié)果如圖2所示。

    圖2 超聲作用時間對結(jié)晶純度和收率的影響

    由圖2所知,功率一定時,其純度隨著超聲時間的延長有所增長,但增幅不大,綜合效益隨超聲時間的增加而增加,故選擇超聲時間為40min。核黃素成核結(jié)晶需要一個誘導(dǎo)成核達平衡的過程,40min 結(jié)晶達到平衡穩(wěn)定,故結(jié)晶的綜合效益最高。同時,超聲波可以降低溶液的過飽和濃度,晶體的成核生長速率也會隨著溶液過飽和濃度的降低隨之增加。因此,超聲作用也加速了溶質(zhì)分子從溶液到晶體表面的傳遞速率,縮短誘導(dǎo)期,提升了結(jié)晶的速度[24]。

    2.2.2 超聲功率對超聲結(jié)晶純度與收率的影響

    在結(jié)晶純化方法中加入超聲輔助作用,在不用超聲功率下,得到的實驗結(jié)果如圖3所示。

    由圖3 所知,隨著超聲功率的增大,其純度有先增大后減小的趨勢??傮w來看,在功率為400W 時,超聲輔助酸溶結(jié)晶的綜合效益最高。溶質(zhì)分子從溶液擴散到晶體表面,然后進入晶格,超聲作用促進了擴散速率,使得成核時間降低,并增加了晶核的數(shù)量。杭方學(xué)等[25]采用超聲處理研究溶析晶體時發(fā)現(xiàn),在超聲功率400W 以下時,超聲波的功率越大,擴散系數(shù)越大,促進了分子間的混合,增強了不同相間的熱質(zhì)傳遞,結(jié)晶成核速率也越高。但是在高功率400W 以上,超聲功率過大,導(dǎo)致產(chǎn)生晶體粒度過小,容易聚結(jié),雜質(zhì)進入結(jié)晶體里面,造成純度下降,純化的綜合效益降低[26]。

    圖3 超聲功率對結(jié)晶純度和收率的影響

    2.2.3 超聲溫度對超聲結(jié)晶純度與收率的影響

    通過改變超聲溫度,得到的實驗結(jié)果如圖4所示。

    圖4 超聲溫度對結(jié)晶純度和收率的影響

    由圖4 得知,當超聲功率和時間一定時,隨著超聲溫度的升高,收率呈下降趨勢,這可能是由于隨著超聲溫度的升高,核黃素的溶解度增加,使得析出的晶體減少,故收率有所下降;而對于純度來說,隨著超聲溫度升高,溶質(zhì)分子運動加快,結(jié)晶速度減慢,雜質(zhì)不易進入晶體中,同時“空化”作用產(chǎn)生的氣泡能將雜質(zhì)從晶體外表面趕走,減少雜質(zhì)進入晶體造成各向生長異性,晶體析出雜質(zhì)分子隨之減少,因此純度有所提升[26],其綜合效益總體趨勢有所提高,50℃條件下綜合效益最高。

    通過超聲輔助工藝的優(yōu)化,相較于傳統(tǒng)的種子結(jié)晶方法,超聲輔助結(jié)晶能夠降低誘導(dǎo)時間、過飽和濃度和亞穩(wěn)態(tài)區(qū)域?qū)挾龋行У卮龠M混合控制結(jié)晶過程[27-28]。

    綜上所述。超聲結(jié)晶的最佳實驗條件為超聲功率400W、超聲時間40min、超聲溫度50℃,此時核黃素的收率可達到95%,純度超過96%。

    2.3 核黃素超聲結(jié)晶后的表征分析

    2.3.1 在光學(xué)顯微鏡下觀察超聲對核黃素結(jié)構(gòu)的影響

    未超聲輔助結(jié)晶和超聲輔助結(jié)晶后的核黃素光學(xué)顯微圖(40倍)如圖5所示。

    圖5 未超聲輔助結(jié)晶和超聲輔助結(jié)晶后核黃素的光學(xué)顯微圖(40倍)

    從圖5可以很明顯地看出,未經(jīng)過超聲得到的核黃素其形狀呈針狀,且有集聚情況。而經(jīng)過超聲處理后的核黃素形狀發(fā)生了較大改變,晶習(xí)變短,且比較均勻。這是由于超聲作用的引入,由于超聲波的輻射、微射流以及局部高溫高壓提升了溶質(zhì)分子混合的速率,降低了局部成核的數(shù)量,影響了晶體集聚的情況,解決了傳統(tǒng)種子結(jié)晶方法工業(yè)放大過程中結(jié)晶后晶體集聚的問題[29-30]。為了進一步明確核黃素的晶體形狀,通過電子顯微鏡確認。

    2.3.2 在電子顯微鏡下觀察超聲對核黃素結(jié)構(gòu)的影響

    未超聲輔助結(jié)晶和超聲輔助結(jié)晶后核黃素的透射電鏡圖如圖6所示。

    圖6 未超聲輔助結(jié)晶和超聲輔助結(jié)晶后核黃素的電鏡透射圖

    通過透射電鏡觀察到,經(jīng)過超聲后的晶型發(fā)生了明顯的變化,由原來的針狀晶型轉(zhuǎn)變?yōu)榻凭匦危移鋬?nèi)徑變小,長度變短,長寬比變小,且相對均勻。超聲作用下,由于超聲的空化作用,溶質(zhì)分子因其獲得了充分的速度及能量,溫度和濃度梯度減小,分子間的碰撞及相互加強,增加了穿過晶體表面靜止液層的可能性,其更易于進入晶格,整齊排列,顯著地增加了溶液傳質(zhì)速率和傳質(zhì)推動力[31]。

    2.3.3 核黃素的XRD分析

    核黃素的XRD 譜圖如圖7 所示。從圖7 可見,經(jīng)過超聲作用后,隨著超聲時間的加長其峰強度有所增強。未超聲核黃素的結(jié)晶度是79.56%,通過最優(yōu)條件的超聲處理后,結(jié)晶度提升至84.21%,結(jié)果表明,在超聲作用下其結(jié)晶度有所改善。超聲波引入到溶液結(jié)晶過程中,利用超聲波的空化效應(yīng),能使過飽和溶液的成核誘導(dǎo)期縮短,大大減少結(jié)晶時間,當超聲波頻率增加時,晶體成核速度也會加快,成核誘導(dǎo)期變短。超聲結(jié)晶能夠簡單有效地控制晶體成核數(shù)目及成核速度,形成的晶體晶形好、粒度分布均勻、晶體結(jié)構(gòu)也完整。優(yōu)化的超聲輔助工藝條件可以有效地控制晶體大小、純度、收率、結(jié)晶度和晶習(xí)[32]。

    圖7 超聲功率為400W、不同超聲時間下核黃素結(jié)晶的XRD譜圖

    3 結(jié)論

    本文比較研究了溶劑析出法、溶劑析出結(jié)合酸溶法、控制結(jié)晶法、酸溶法和堿溶法等5種傳統(tǒng)的結(jié)晶純化方法的效果,其中酸溶法在收率和純度指標上綜合效益最佳。在此基礎(chǔ)上添加超聲輔助處理,其最佳的實驗條件為超聲功率為400W、超聲時間為40min、超聲溫度為50℃,核黃素的收率可達到95%,純度超過96%。超聲輔助酸溶結(jié)晶進一步提高了核黃素的結(jié)晶度,易于成核,晶習(xí)更短,近似于矩形,晶體穩(wěn)定,分散性能更好,易于壓片成型,改善了應(yīng)用加工和工業(yè)放大特性。

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