甲基苯丙胺依賴者強(qiáng)制隔離康復(fù)戒斷期Th/Treg 細(xì)胞 表達(dá)水平變化分析及其意義＊

李剛榮，焦西強(qiáng)，陳平力，白明明，楊會(huì)濤，陶朝欣，楊立峰， 馬宗良，張成，張永峰，王志勇，邢江濤

（1.河北省強(qiáng)制隔離戒毒所戒毒醫(yī)療中心，石家莊 050081； 2.河北醫(yī)科大學(xué)附屬平安醫(yī)院檢驗(yàn)科，石家莊 050021）

藥物成癮是一個(gè)非常嚴(yán)重的社會(huì)問(wèn)題，它不僅危害人體身心健康，還引起機(jī)體免疫功能紊亂導(dǎo)致各種并發(fā)癥。有研究表明藥物成癮可直接或間接導(dǎo)致非特異性免疫功能損傷（補(bǔ)體系統(tǒng)異常）、體液免疫功能損傷（免疫球蛋白異常）及細(xì)胞免疫功能損傷（T 細(xì)胞亞群異 常）[1]。甲基苯丙胺（methamphetamine，METH）作為新型毒品的代表被吸毒成癮者所青睞，它是一種強(qiáng)效中樞神經(jīng)興奮劑，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的損害尤為嚴(yán)重，長(zhǎng)期METH 依賴患者機(jī)體內(nèi)存在免疫功能紊亂或嚴(yán)重?fù)p傷。CD4+T 細(xì)胞在介導(dǎo)細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)方面起著重要作用，在不同的細(xì)胞因子及環(huán)境作用下可分化為功能不同的輔助性T 細(xì)胞（T helper cell, Th）Th1、Th2、Th17 及 調(diào) 節(jié)T 細(xì) 胞（regulatory T cells, Treg）。Th1 與Th2 細(xì)胞處于相互抑制、相互轉(zhuǎn)化的平衡狀態(tài)，平衡狀態(tài)的破壞會(huì)導(dǎo)致免疫系統(tǒng)紊亂。Th17 分泌較高水平細(xì)胞因子IL-17，具有強(qiáng)大的促炎效應(yīng)[2]，Treg 細(xì)胞是一類主要起免疫抑制作用的CD4+T 細(xì)胞，當(dāng)Treg 發(fā)生紊亂并過(guò)度發(fā)揮作用時(shí)，會(huì)干擾機(jī)體的免疫力[3]，Th17及Treg 之間的平衡狀態(tài)在機(jī)體免疫防御和免疫穩(wěn)定中發(fā)揮著重要作用。隨著苯丙胺類新型毒品大量被濫用且有替代阿片類傳統(tǒng)毒品的趨勢(shì)，戒毒康復(fù)監(jiān)管場(chǎng)所對(duì)METH 依賴患者在監(jiān)測(cè)治療和診斷評(píng)估方面有更高的需求。已有的研究結(jié)果主要集中于傳統(tǒng)毒品如阿片類的非特異性免疫和體液免疫方面，了解Th 細(xì)胞的表達(dá)水平變化有助于分析MEHT 依賴患者的細(xì)胞免疫功能狀況。本次研究應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)的方法檢測(cè)METH 依賴患者外周血中CD4+T 淋巴細(xì)胞亞群的表達(dá)情況，對(duì)比分析在不同康復(fù)戒斷時(shí)期該類患者外周血Th 細(xì)胞的變化，以期為該類患者臨床診療提供相關(guān)數(shù)據(jù)，為康復(fù)戒毒醫(yī)療中心提供新的診斷評(píng)估指標(biāo)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

本次研究獲得河北省強(qiáng)制隔離戒毒所戒毒醫(yī)療中心醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)討論批準(zhǔn)后開展，所有參與患者均簽署了關(guān)于本次研究的知情同意書。METH 依賴患者分為4 組，分別為METH 依賴患者初治組（康復(fù)戒斷期0 個(gè)月組）、METH 依賴強(qiáng)制隔離康復(fù)戒斷期6 個(gè)月組、12 個(gè)月組及20 個(gè)月組患者。METH 依賴患者初治組為2018 年6月至2019 年12 月由公安部門及強(qiáng)制隔離戒毒所根據(jù)相關(guān)檢測(cè)確定的患者，吸食METH 時(shí)間均為半年以上，且最近一次吸食在15天以內(nèi)，其中男性27例，女性3 例，年齡18～46 歲，平均年齡（29.4±5.8）歲；康復(fù)戒斷期6 個(gè)月組為河北省強(qiáng)制隔離戒毒所2019 年12 月前收治的符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)且自最后一次吸食METH后隔離康復(fù)戒斷時(shí)間為6 個(gè)月的35 例患者，均為男性，年齡20～48 歲，平均年齡（31.2±6.6）歲；康復(fù)戒斷期12 個(gè)月組為該所2019 年12 月前收治的符合相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)且自最后一次吸食METH 后隔離康復(fù)戒斷時(shí)間為12 個(gè)月的35 例患者，均為男性，年齡18～51 歲，平均年齡（30.5±7.3）歲?？祻?fù)戒斷期20 個(gè)月組為該所2019 年12 月前收治的符合相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)且自最后一次吸食METH 后隔離康復(fù)戒斷時(shí)間為20 個(gè)月的35 例患者，均為男性，年齡20～47 歲，平均年齡（32.2±6.5）歲。4 組患者一般臨床資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，所有METH 依賴患者均用相關(guān)的心理測(cè)試軟件測(cè)試過(guò)心理壓力變化，均提示無(wú)異常，吸毒方式均為口服、口吸或鼻吸。30 例對(duì)照組為河北醫(yī)科大學(xué)附屬平安醫(yī)院體檢中心常規(guī)體檢人員，其中男性26 例，女性4 例，年齡22～42 歲，平均年齡（32.3±5.3）歲，從未接觸過(guò)METH 及類似藥物。所有組別患者及對(duì)照組的乙肝、丙肝、艾滋病、梅毒、性病及其他傳染病相關(guān)抗體檢測(cè)均陰性，排除了可能影響免疫功能的疾病如心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)疾病及免疫系統(tǒng)疾病等，無(wú)影響相關(guān)因子檢測(cè)的用藥史。

1.2 儀器和試劑

儀器為BD 公司的FACS Calibur 8 色流式細(xì)胞儀，主要試劑有：小鼠抗人CD4 單克隆抗體（mAb）抗體為PerCP-Cy5.5 熒光標(biāo)記，IFN-γ 為FITC 熒光標(biāo)記，IL-4 為PE 熒光標(biāo)記，IL-17A 為BV510 熒光標(biāo)記，小鼠抗人CD25mAb 為PE 熒光標(biāo)記，小鼠抗人CD127 mAb 為Alexa Fluor 647 標(biāo)記，小鼠抗人IgG 作為同型對(duì)照，leuko Act Cktl With GolgiPlug 刺激劑，紅細(xì)胞裂解液，流式分析用溶血素，以上產(chǎn)品均購(gòu)自BD 公司。

1.3 標(biāo)本采集與處理

患者及體檢者清晨空腹抽取EDTA 抗凝的靜脈血 5 ml，標(biāo)本無(wú)溶血、凝血及乳糜血現(xiàn)象。

Treg 細(xì)胞檢測(cè)標(biāo)本在采集之后2 小時(shí)內(nèi)完成，操作步驟為吸取無(wú)異常的抗凝全血50 μl 加于專用流式上機(jī)管中，加入CD4- PerCP-Cy5.5、CD25-PE、CD127-Alexa Fluor 647 抗體各20 μl，同型對(duì)照管加入同型抗體 20 μl，充分混勻后室溫避光放置30 分鐘，再加入 2 ml 紅細(xì)胞裂解液室溫放置15 分鐘后離心棄上清，加入2 ml PBS 洗滌沉淀后再次離心棄上清，最后加入0.5 ml PBS 重懸，使用流式細(xì)胞儀BD FACS CantoII 檢測(cè)，數(shù)據(jù)分析采用FACSDiva 軟件，記錄陽(yáng)性細(xì)胞百分率。以前向散射光和側(cè)向散射光圈定淋巴細(xì)胞，再以CD4+和側(cè)向散射光圈定CD4+T 淋巴細(xì)胞，Treg 細(xì)胞的比例以CD25+CD127-占CD4+T 淋巴細(xì)胞的百分比表示[4-5]，見圖1—圖2。

Th1/Th2/Th17 細(xì)胞檢測(cè)標(biāo)本在采集之后2 小時(shí)內(nèi)完成，操作步驟為取抗凝全血100 μl 加入試管同時(shí)加入leuko Act Cktl With GolgiPlug 刺激劑2 μl，充分混勻，37 ℃ CO2培養(yǎng)箱孵育6 小時(shí)，PBS 洗2 遍，分別加 入CD45-APC 5 μl、CD4-PE-Cy 20 μl、CD8-Percp 20 μl，室溫避光15 分鐘，PBS 洗2 遍，加流式分析用溶血素1 液100 μl 固定15 分鐘，待完全溶血后離心棄上清，加入流式分析用溶血素2 液100 μl 透膜5 分鐘，加入IFN-γ-FITC/IL-4-PE 20 μl，IL-17ABV510 5 μl 室溫避光孵育15 分鐘，加入2 ml PBS 洗滌沉淀后再次離心棄上清，最后加入0.5 ml PBS 重懸，使用流式細(xì)胞儀BD FACS CantoII 檢測(cè)，數(shù)據(jù)分析采用FACSDiva 軟件，記錄陽(yáng)性細(xì)胞百分率。以 CD4+IFN-γ+細(xì)胞占CD4+T 細(xì)胞的百分比表示Th1 細(xì)胞水平，以CD4+IL-4+細(xì)胞占CD4+T 細(xì)胞的百分比表示Th2 細(xì)胞水平，以CD4+IL-17A+細(xì)胞占CD4+T 細(xì)胞的百分比表示Th17 細(xì)胞水平。

圖1 正常對(duì)照組外周血Treg 細(xì)胞表達(dá)情況

圖2 康復(fù)戒斷期6 個(gè)月組外周血Treg 細(xì)胞表達(dá)情況

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 25.0 對(duì)本研究數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，計(jì)量資料以（±s）表示，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，組間比較采用t 檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），檢驗(yàn)效能α=0.05，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 METH 依賴患者初治組與正常對(duì)照組外周血各類淋巴細(xì)胞亞群比較

METH 依賴患者初治組外周血中CD4+T 細(xì)胞、Th1、Th17 細(xì)胞比例、Th1/Th2 及Th17/Treg 比值均低于正常對(duì)照組，Th2 及Treg 細(xì)胞比例明顯高于正常對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 METH 依賴患者不同戒斷時(shí)期各類淋巴細(xì)胞亞群變化特點(diǎn)

METH 依賴患者在強(qiáng)制隔離康復(fù)戒斷0 個(gè)月至第20 個(gè)月期間，其外周血CD4+T 細(xì)胞與Th1 細(xì)胞呈不斷上升趨勢(shì)，Th2 與Treg 細(xì)胞呈不斷下降趨勢(shì)，而Th17始終處于較低水平（表1）。Th17 細(xì)胞在METH 依賴患者中表達(dá)明顯降低，至康復(fù)戒斷期20 個(gè)月時(shí)仍低下，與正常對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.037），Th17/Treg 比值在康復(fù)戒斷期20 個(gè)月時(shí)與正常對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.080）。

3 討論

近年來(lái)針對(duì)METH 影響免疫功能的研究有限，但其影響機(jī)體先天和后天免疫已得到證實(shí)。Th 細(xì)胞分泌不同的細(xì)胞因子且發(fā)揮不同的免疫作用，Th1 細(xì)胞主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫，Th2 細(xì)胞主要介導(dǎo)體液免疫，Th1/Th2 的動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)一旦偏離，機(jī)體就會(huì)趨向疾病狀態(tài)。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)阿片類物質(zhì)依賴可引起Th1細(xì)胞功能低下，Th2 細(xì)胞功能亢進(jìn)，Th1/Th2 比例失衡[6]。本次研究結(jié)果與傳統(tǒng)阿片類物質(zhì)依賴基本一致，顯示METH 依賴患者Th1 細(xì)胞受抑制，Th2 細(xì)胞優(yōu)勢(shì)表達(dá)，外周血CD4+T 淋巴細(xì)胞減少和Th1/Th2 平衡狀態(tài)的破壞，導(dǎo)致機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生不利的免疫激活，可能與該類患者感染性疾病的發(fā)生密切相關(guān)。至康復(fù)戒斷期12 個(gè)月時(shí)，Th1 與Th2 仍不能恢復(fù)正常平衡狀態(tài)，也提示METH 對(duì)機(jī)體免疫功能損傷的長(zhǎng) 期性。

表1 不同戒斷期METH 依賴患者淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)情況（±s）

表1 不同戒斷期METH 依賴患者淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)情況（±s）

注：▲METH 依賴患者初治組與正常對(duì)照組比較P＜0.05；*Th17 細(xì)胞與正常對(duì)照組比較P=0.037；★Th1/Th2 與正常對(duì)照組比較P＜0.05；△Th17/Treg 與正常對(duì)照組比較P=0.080；■Treg 細(xì)胞與正常對(duì)照組比較P=0.137；□Treg 細(xì)胞與正常對(duì)照組比較P=0.771。

組別 CD4+/% Th1/% Th2/% Th17/% Treg/% Th1/Th2 Th17/Treg METH 依賴患者初治組（n=35） 41.47±4.60▲ 9.16±3.90▲ 3.08±1.68▲ 0.66±0.38▲ 3.83±0.77▲ 4.40±4.15▲ 0.18±0.12▲康復(fù)戒斷期6 個(gè)月組（n=35） 41.97±5.20 11.88±4.05 2.43±1.14 0.46±0.41 4.01±1.52 6.44±4.45 0.13±0.12康復(fù)戒斷期12 個(gè)月組（n=35） 44.87±8.54 15.27±5.11 2.41±1.31 0.65±0.38 3.50±1.34■ 9.71±10.59★ 0.22±0.16康復(fù)戒斷期20 個(gè)月組（n=35） 46.71±7.30 13.45±6.69 1.11±0.81 0.83±0.39* 3.17±0.99□ 16.85±9.68 0.29±0.17△對(duì)照組（n=30） 46.46±6.11 14.81±5.35 1.27±0.55 1.13±0.62 2.92±0.92 14.39±10.17 0.42±0.31

Treg 細(xì)胞是CD4+T 細(xì)胞的新亞群，在維持機(jī)體免疫自穩(wěn)、調(diào)控免疫應(yīng)答方面起著重要作用，可抑制炎癥的發(fā)展，Th17 細(xì)胞在維持上皮組織的完整和抵御外來(lái)病原感染中發(fā)揮著重要作用，是誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵效應(yīng)T 細(xì)胞，Treg 細(xì)胞與Th17 細(xì)胞在功能上互相拮抗，生理狀態(tài)下處于動(dòng)態(tài)平衡，維持機(jī)體免疫功能的平衡與穩(wěn)定。本次研究結(jié)果顯示METH 依賴初治組患者外周血Treg 細(xì)胞水平較正常對(duì)照組明顯升高，而Th17 細(xì)胞表達(dá)則顯著降低。Treg 細(xì)胞比例升高可導(dǎo)致機(jī)體免疫抑制，Th17 細(xì)胞降低會(huì)抑制炎性反應(yīng)，兩者動(dòng)態(tài)平衡的破壞可能是引起該類人群免疫力低下易患感染性疾病的原因之一。有研究顯示成癮藥物依賴患者體內(nèi)免疫功能紊亂且持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，發(fā)現(xiàn)戒斷期18 個(gè)月時(shí)其外周血Treg 細(xì)胞比例高于正常對(duì)照組，表明成癮藥物依賴患者體內(nèi)Treg 長(zhǎng)期存在過(guò)度表達(dá)[7]。本次研究結(jié)果顯示METH 依賴患者外周血Treg 細(xì)胞在康復(fù)戒斷期12 個(gè)月組及20 個(gè)月組時(shí)與正常對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.137，P=0.771）。單純METH 依賴與傳統(tǒng)阿片類毒品相比對(duì)中樞神經(jīng)毒性的影響更大，新型毒品苯丙胺類物質(zhì)會(huì)對(duì)患者腦組織中多巴胺的攝取、儲(chǔ)存以及釋放造成影響，可增加IL-6、IL-1β、TNF-α 和IL-8 的分泌[8]，此類細(xì)胞因子的存在會(huì)影響到Treg 和Th17 細(xì)胞在一定條件下的表型轉(zhuǎn)化，這是否是導(dǎo)致結(jié)果存在差異的原因有待進(jìn)一步的探討。本次研究未對(duì)符合條件的患者從康復(fù)戒斷期開始到結(jié)束時(shí)各淋巴細(xì)胞亞群水平進(jìn)行全程跟蹤監(jiān)測(cè)，同一患者在不同戒斷期間的Treg 細(xì)胞水平變化數(shù)據(jù)也會(huì)為差異的原因提供更有力的證據(jù)。

綜上所述，甲基苯丙胺依賴患者隨著康復(fù)戒斷期限的延長(zhǎng)，其外周血Th 細(xì)胞各項(xiàng)指標(biāo)逐步恢復(fù)，在康復(fù)戒斷期間監(jiān)測(cè)其CD4+T 細(xì)胞、Th1、Th2、Th17 及Treg細(xì)胞表達(dá)水平的變化，有助于了解該類患者機(jī)體的免疫功能狀況，為強(qiáng)制隔離戒毒康復(fù)醫(yī)務(wù)工作者提供新的診斷評(píng)估指標(biāo)?！吨腥A人民共和國(guó)禁毒法》第四十七條規(guī)定強(qiáng)制隔離戒毒的期限為兩年，本次研究提示METH依賴患者在康復(fù)戒斷期第20 個(gè)月時(shí)其機(jī)體內(nèi)除Th17細(xì)胞外，其余Th 細(xì)胞的表達(dá)水平與正常對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，間接為METH 依賴患者強(qiáng)制隔離康復(fù)戒斷期限提供理論依據(jù)。

鳴謝：本次研究得到河北省女子強(qiáng)制隔離戒毒所戒毒醫(yī)療中心、石家莊市第一強(qiáng)制隔離戒毒所戒毒醫(yī)療中心及相關(guān)部門的大力支持，特此感謝。