隱丹參酮納米混懸劑的制備及其抗腫瘤活性

李曉婷，決利利，郝海軍，王世廣

（1.鄭州工業(yè)應(yīng)用技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院，河南鄭州 451150；2.中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)研究院，上海 201203）

隱丹參酮是從唇形科植物丹參Salvia miltiorrhizaBge.中提取得到的主要脂溶性活性成分之一［1］，對(duì)胃癌、宮頸癌、肺癌等多種腫瘤細(xì)胞具有明顯抑制作用［2］，也對(duì)心肌梗死、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、活血化瘀等心血管疾病有著較好的治療作用，但它屬于難溶性成分［2］，從而大大限制了其藥效發(fā)揮［3］，成為相關(guān)臨床應(yīng)用的瓶頸。雖然磷脂復(fù)合物、自微乳、脂質(zhì)體等技術(shù)解決了一些難溶性藥物藥效較低的問(wèn)題，但均存在一定局限性，如穩(wěn)定性差、制備工藝復(fù)雜、大量使用表面活性劑等。

納米混懸劑是通過(guò)加入穩(wěn)定劑后采用某種制劑技術(shù)而制備得到的一種亞微米膠體給藥體系［4-5］，它無(wú)需載體材料，可有效避免共溶劑的不良反應(yīng)，并可顯著提高藥物溶解度和療效。因此，本實(shí)驗(yàn)將隱丹參酮制成納米混懸劑，對(duì)其粒徑、Zeta 電位、形態(tài)、穩(wěn)定性、體外釋藥進(jìn)行考察，并采用四甲基偶氮唑鹽（MTT）法研究它對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC-7901 的抑制作用，以期為進(jìn)一步相關(guān)研究提供參考。

1 材料

QUINTX224-1CM 型電子天平（德國(guó)Sartorius公司）；Agilent 1260 型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent 公司）；JY92-III 型超聲儀（浙江大天科學(xué)儀器有限公司）；SZCL-H 型溫控磁力攪拌器（鄭州宇華儀器有限公司）；Master-sizer 型粒度分析儀（英國(guó)馬爾文儀器有限公司）；FD10-QX 型真空凍干機(jī)（上海天賜科學(xué)儀器公司）；Kylin-Bell 型漩渦混合器（海門(mén)其林貝爾儀器制造有限公司）；MR-96T 型酶標(biāo)儀（南京貝登醫(yī)療股份有限公司）；HNA-122DTABA I 型CO2恒溫培養(yǎng)箱（日本三洋公司）。

隱丹參酮原料藥（批號(hào)Y-034-181217，純度＞98%，上海源葉生物科技有限公司）；隱丹參酮對(duì)照品（批號(hào)110852-201702，純度99.5%，中國(guó)食品藥品檢定研究院）。大豆卵磷脂（批號(hào)PC-95，上海輔必成醫(yī)藥科技有限公司）；泊洛沙姆188（批號(hào)WPEE578，德國(guó)巴斯夫公司）；胰蛋白酶（美國(guó)HyClone 公司）；RPMI-1640 培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco 公司）；二甲基亞砜（DMSO）、四甲基偶氮唑鹽（MTT，批號(hào)1524B37，美國(guó)Amresco 公司）。人胃癌SGC-7901 細(xì)胞，購(gòu)自上海研域生物工程有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Agilent Zorbax C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈-0.5% 甲酸（72∶28）；體積流量1.0 mL／min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)272 nm；進(jìn)樣量20 μL。

2.2 隱丹參酮納米混懸劑制備 取大豆卵磷脂、泊洛沙姆188 各200 mg，超聲溶解于100 mL 蒸餾水中，作為溶液A；取隱丹參酮100 mg，超聲溶解于10 mL 無(wú)水乙醇中，作為溶液B。設(shè)置磁力攪拌器溫度為70 ℃，轉(zhuǎn)速為800 r／min，將溶液B 逐滴加到溶液A 中，同一溫度下真空濃縮除去乙醇，設(shè)置均質(zhì)壓力為80 MPa，循環(huán)10 次后補(bǔ)加蒸餾水至100 mL，即得。

2.3 隱丹參酮納米混懸劑理化性質(zhì)研究

2.3.1 粒徑、Zeta 電位測(cè)定 取3 批隱丹參酮納米混懸劑，蒸餾水按照1∶6 比例稀釋后置于粒度分析儀上，測(cè)定粒徑、Zeta 電位，結(jié)果見(jiàn)圖1～2。由此可知，納米混懸劑粒徑分布在50～200 nm 之間，平均粒徑為104.15 nm，PDI 為0.014，Zeta電位為-36.3 mV。

圖1 隱丹參酮納米混懸劑粒徑分布Fig.1 Particle size distribution of cryptotanshinone nanosuspensions

圖2 隱丹參酮納米混懸劑Zeta 電位Fig.2 Zeta potential of cryptotanshinone nanosuspensions

2.3.2 形態(tài) 取隱丹參酮納米混懸劑、空白納米混懸劑各100 μL，加入4 mL 蒸餾水，搖勻后滴至銅網(wǎng)上，自然晾干，滴加1.0% 鎢酸鈉溶液染色，靜置10 min，濾紙吸干后置于透射電鏡（TEM）下觀察形態(tài)，結(jié)果見(jiàn)圖3～4。由此可知，隱丹參酮納米混懸劑中納米粒之間無(wú)粘連現(xiàn)象，基本呈球形；空白納米混懸劑中納米粒形態(tài)類(lèi)似囊泡結(jié)構(gòu)，可能是由于其中的表面活性劑（磷脂）未吸附于納米粒表面，而是分散在水相中形成該類(lèi)結(jié)構(gòu)。

圖3 隱丹參酮納米混懸劑TEM 圖Fig.3 TEM image for cryptotanshinone nanosuspensions

2.4 隱丹參酮納米混懸劑穩(wěn)定性研究

圖4 空白納米混懸劑TEM 圖Fig.4 TEM image for blank nanosuspensions

2.4.1 室溫下 取隱丹參酮納米混懸劑（蒸餾水將其質(zhì)量濃度稀釋至0.5 mg／mL），室溫下于0、1、3、5、7、15、21、30 d 測(cè)定粒徑，結(jié)果見(jiàn)圖5。由此可知，15 d 后粒徑增大了約10 nm，而30 d后增大了約21 nm，但肉眼未發(fā)現(xiàn)沉淀或聚集現(xiàn)象。

圖5 室溫下隱丹參酮納米混懸劑粒徑Fig.5 Particle size of cryptotanshinone nanosuspensions at room temperature

2.4.2 空白血漿、1.8%氯化鈉溶液中 將隱丹參酮納米混懸劑與空白血漿按1∶4 比例混合，或與1.8%氯化鈉溶液按1∶1 比例混合（質(zhì)量濃度為0.5 mg／mL）后，置于37 ℃水浴中，于0、1、2、4、6、8、10、12 h 測(cè)定粒徑，結(jié)果見(jiàn)圖6。由此可知，加入空白血漿、1.8%氯化鈉溶液后，與加入前（104.15 nm）相比0 h 粒徑分別增加約42、36 nm，隨著時(shí)間延長(zhǎng)均逐漸升高，在12 h 后仍均小于162 nm，而且在1.8%氯化鈉溶液中的變化程度更小，故可考慮將其作為注射分散介質(zhì)。

2.5 隱丹參酮納米混懸劑凍干粉制備

2.5.1 冷凍干燥工藝 將隱丹參酮納米混懸劑分成若干份，每份3 mL，置于西林瓶中，加入凍干保護(hù)劑，混勻，置于真空凍干機(jī)中（初始溫度-55 ℃），按照?qǐng)D7 程序進(jìn)行冷凍干燥，并在25 ℃下保持4 h，即得淺紅色疏松的凍干粉，其色澤均勻，外形飽滿(mǎn)，再分散性良好。

圖6 空白血漿、1.8%氯化鈉溶液中隱丹參酮納米混懸劑粒徑Fig.6 Particle sizes of cryptotanshinone nanosuspensions in blank plasma and 1.8% sodium chloride solution

圖7 冷凍干燥程序Fig.7 Lyophilization procedure

2.5.2 凍干保護(hù)劑種類(lèi)及用量 取不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)甘露醇、乳糖、蔗糖，加入到隱丹參酮納米混懸劑中，冷凍干燥后取適量?jī)龈煞郏尤胝麴s水復(fù)溶后測(cè)定粒徑、Zeta 電位，結(jié)果見(jiàn)表1。由此可知，加入3%甘露醇后凍干粉粒徑、Zeta 電位與冷凍干燥前（104.15 nm、-36.3 mV）相比變化最小，故選擇其作為凍干保護(hù)劑。

表1 凍干保護(hù)劑種類(lèi)及用量對(duì)粒徑、Zeta 電位的影響（n＝3）Tab.1 Effects of lyoprotectant kind and consumption on particle size and Zeta potential（n＝3）

2.6 隱丹參酮納米混懸劑體外釋藥研究 用2 mL 1.5%十二烷基硫酸鈉溶液分別制備隱丹參酮及其納米混懸劑凍干粉的混懸液（含10.0 mg 隱丹參酮），置于透析袋中（截留分子量8 000～14 000 Da），兩端扎緊。以900 mL 1.5%十二烷基硫酸鈉溶液為釋放介質(zhì)，設(shè)定溫度為（37 ± 1）℃，轉(zhuǎn)速為100 r／min［6-7］，于0、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24、48 h 各取樣3 mL 后，立即補(bǔ)加3 mL空白溶出介質(zhì)以保持總體積不變，取樣液過(guò)0.45 μm微孔濾膜，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，體外釋放曲線見(jiàn)圖8，可知原料藥在24 h 內(nèi)累積釋放度僅為23.17%，之后幾乎沒(méi)有釋放，這與其溶解度差、顆粒大等因素有關(guān)；納米混懸劑在前12 h 釋放相對(duì)較快，累積釋放度達(dá)到64.28%，之后呈明顯緩釋特征；釋藥過(guò)程最符合Higuchi 模型，見(jiàn)表2。

圖8 隱丹參酮體外釋放曲線Fig.8 In vitro release curves for cryptotanshinone

表2 藥物釋放擬合結(jié)果Tab.2 Results of drug release fitting

2.7 隱丹參酮納米混懸劑對(duì)SGC-7901 細(xì)胞的抑制作用

2.7.1 藥液制備 將30.0 mg 隱丹參酮溶于100 mL DMSO 中，得到300 μg／mL 母液，用含10%FBS 的RPMI-1640 培養(yǎng)液將其依次稀釋至30、24、18、12、6 μg／mL；取隱丹參酮納米混懸劑凍干粉，用含10% FBS 的RPMI-1640 培養(yǎng)液將其依次稀釋至30、24、18、12、6 μg／mL（以隱丹參酮計(jì)），即得。

2.7.2 分組與給藥 采用MTT 法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SGC-7901 細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化并吹打成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞培養(yǎng)液調(diào)整其濃度為5×105／mL，取100 μL 接種于96 孔板中，置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，棄去培養(yǎng)液，設(shè)置空白對(duì)照組（細(xì)胞加培養(yǎng)液）、隱丹參酮組（30、24、18、12、6 μg／mL）、隱丹參酮納米混懸劑組（30、24、18、12、6 μg／mL），每個(gè)質(zhì)量濃度3 個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)6、12、24、48 h 后，每孔加入20 μL 0.5%MTT 溶液，繼續(xù)孵育4 h 后甩板，每孔加入150 μL DMSO，固定于搖床上振蕩1.0 h 以充分溶解藍(lán)紫色結(jié)晶物，在參比波長(zhǎng)630 nm、主波長(zhǎng)570 nm 的酶標(biāo)儀中測(cè)定吸光度（A），計(jì)算抑制率，公式為抑制率＝ ｛1 -［（A空白對(duì)照組-A給藥組）／A空白對(duì)照組］｝ ×100%，通過(guò)GraphPad Prism 5 軟件計(jì)算IC50，SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2.7.3 結(jié)果分析 表3 顯示，隨著藥物質(zhì)量濃度增加，隱丹參酮及其納米混懸劑對(duì)SGC-7901 細(xì)胞的抑制作用均更明顯，并且在藥物質(zhì)量濃度相同的情況下隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)，該活性也逐漸增強(qiáng)，即呈濃度、時(shí)間依賴(lài)性；在藥物質(zhì)量濃度相同的情況下，納米混懸劑抑制作用均強(qiáng)于原料藥，而且后者作用48 h 后各質(zhì)量濃度下抑制率與前者比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）；IC50分別為24.72、11.76 μg／mL，兩者比較，差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

表3 隱丹參酮納米混懸劑對(duì)SGC-7901 細(xì)胞的抑制率（， n＝3）Tab.3 Inhibitory rates of cryptotanshinone nanosuspensions on SGC-7901 cells（， n＝3）

表3 隱丹參酮納米混懸劑對(duì)SGC-7901 細(xì)胞的抑制率（， n＝3）Tab.3 Inhibitory rates of cryptotanshinone nanosuspensions on SGC-7901 cells（， n＝3）

注：與隱丹參酮組比較，?P＜0.05，??P＜0.01。

3 討論

納米混懸劑中的表面活性劑可吸附于納米粒表面，提供立體位阻作用，防止粒子之間發(fā)生聚集現(xiàn)象，從而提高制劑穩(wěn)定性，但表面活性劑對(duì)納米粒粒徑、Zeta 電位的影響較大。前期預(yù)實(shí)驗(yàn)對(duì)不同表面活性劑進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)粒徑大小由低到高依次為大豆卵磷脂、泊洛沙姆188、聚乙烯醇、聚山梨酯80。研究表明，幾種表面活性劑聯(lián)合應(yīng)用有助于提高制劑長(zhǎng)期穩(wěn)定性［6］，故本實(shí)驗(yàn)最終采用采用大豆卵磷脂、泊洛沙姆188（比例1∶1）作為表面活性劑。

體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在相同用藥劑量下隱丹參酮納米混懸劑對(duì)SGC-7901 細(xì)胞的抑制作用強(qiáng)于原料藥，其原因一方面可能是由于納米粒能通過(guò)非特異性?xún)?nèi)吞作用或吞噬作用內(nèi)化入胞，從而增強(qiáng)藥效［8-13］；另一方面，納米混懸劑稀釋后隱丹參酮處于溶解狀態(tài)，處方中大豆磷脂有助于促進(jìn)藥物進(jìn)入細(xì)胞［7］，而泊洛沙姆188 會(huì)影響腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白作用［14］，降低腫瘤細(xì)胞對(duì)胞內(nèi)藥物的外排，從而增加藥物胞內(nèi)蓄積。前期研究表明，泊洛沙姆188 具有逆轉(zhuǎn)耐藥、增加藥物藥效等作用［14-16］。因此，納米混懸劑不僅有助于解決隱丹參酮溶解度差的問(wèn)題，而且可提高其藥效。