仙靈骨葆膠囊對去卵巢骨折大鼠骨折端骨微結(jié)構(gòu)的影響及OPG／RANKL 信號調(diào)控機制

任世元，張琦豪，閆曉哲

（鄭州市骨科醫(yī)院，河南鄭州 450052）

骨質(zhì)疏松性骨折在絕經(jīng)后女性中較為常見，由于患者骨量減少，使得內(nèi)固定失敗或斷骨愈合不全，導致治療效果不佳［1］。骨折愈合早期患者斷肢不負重，骨斷面骨組織轉(zhuǎn)化率高，從而在骨骼愈合過程中易出現(xiàn)骨痂分解代謝，無法形成骨橋，最終導致骨折不愈合［2］，使患者行動能力受限，給其家庭帶來沉重負擔，故減少骨折不愈合為骨折治療的關(guān)鍵。目前，促進骨形成、抑制骨吸收的主要藥物為二磷酸鹽類，但其長期服用時會增加下頜骨壞死、非典型性骨折的風險［3］。

仙靈骨葆膠囊由淫羊藿、續(xù)斷、丹參、知母、補骨脂、地黃組成，具有滋補肝腎、活血化瘀、強筋壯骨的功效，可抑制破骨細胞骨吸收，促進骨基質(zhì)重建和骨折愈合［4］。骨保護素（osteoprotegerin，OPG）／核因子κB 受體活化因子配基（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）信號通路在破骨細胞的分化與成熟過程中起到至關(guān)重要的調(diào)控作用，RANKL 表達增多會使成骨細胞向破骨細胞轉(zhuǎn)化，促進破骨細胞活性和骨吸收，最終導致骨折不愈合［5］。因此，本實驗選擇去卵巢大鼠股骨骨折內(nèi)固定模型，探討仙靈骨葆膠囊對其骨折端骨微結(jié)構(gòu)的影響，并基于OPG／RANKL 信號通路分析其作用機制。

1 材料

無特性病原體SPF 級雌性Sprague-Dawley 大鼠，3 月齡，體質(zhì)量200～220 g，購于北京安凱毅博生物技術(shù)有限公司，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（京）2017-0006，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后進行實驗。

戊酸雌二醇（白色固體片劑）購于拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司（國藥準字J20130009）；仙靈骨葆膠囊（硬膠囊，內(nèi)容物為褐色顆粒狀粉末）購于國藥集團同濟堂貴州制藥有限公司（國藥準字Z20025337）；水合氯醛購于青島宇龍海藻有限公司（國藥準字H37022673）；大鼠血清骨堿性磷酸酶（bone alkaline phosphatase，BALP）、骨鈣素（osteocalcin，OC）酶聯(lián)免疫吸附實驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒購于上海酶聯(lián)生物科技有限公司（批號P201607、P201509）；蘇木精-伊紅（hematoxylineosin，HE）染色試劑盒購于上海劍鈍生物科技有限公司（批號113697）；蛋白免疫印跡（Western blot，WB）試劑盒購于上海恒斐生物科技有限公司（批號P201703）；蛋白提取試劑盒、核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購于北京奧維亞生物技術(shù)有限公司（批號1839271）；OPG、RANKL 一抗購于美國R＆D 公司（批號E201 801 A）；辣根過氧化物酶標記二抗購于美國Sigma 公司；引物合成委托杭州聯(lián)科美訊生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司（批號1159241）；實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）試劑盒購于北京天根生化科技有限公司（批號P201507）。

InAlyzer 雙能X 線骨密度儀購于韓國Medikors公司；TGL-20M 高速臺式離心機購于上海盧湘儀離心機儀器有限公司；KH-Q2016 組織切片機購于湖北孝感闊海醫(yī)療科技有限公司；WMS-9950 生物顯微鏡購于上海無陌光學儀器有限公司；Powerpac HV 電泳儀購于美國伯樂公司；SynergTM NEO2 酶標儀購于美國Bio-Tek 公司；克氏針、咬骨鉗和骨鋸均購于鹽城瑞奧科技有限公司。

2 方法

2.1 建模、分組與給藥 從48 只大鼠中隨機挑選40 只，腹腔注射10%水合氯醛麻醉后切除雙側(cè)卵巢；其余8 只僅暴露卵巢組織，不進行切除，術(shù)后進行為期6 周的恢復(fù)性飼養(yǎng)。6 周后去勢大鼠建立股骨骨折內(nèi)固定模型，方法為大鼠麻醉后仰臥在無菌操作臺上，暴露左側(cè)股骨和髕韌帶，打開關(guān)節(jié)腔，將1.0 mm 克氏針從股骨近端沿股骨長軸方向鉆入，并確保其固定于髓內(nèi)松質(zhì)骨中，小電鋸鋸斷股骨中段；其余8 只正常大鼠僅暴露左側(cè)股骨和髕韌帶，不進行克氏針刺入和股骨鋸斷。將40 只建模大鼠隨機分為模型組、陽性對照組及仙靈骨葆膠囊高、中、低劑量組，其中8 只正常大鼠作為正常組，模型組、正常組大鼠以生理鹽水灌胃，每天1 次；將戊酸雌二醇溶于生理鹽水中，使其質(zhì)量濃度為0.018 mg／mL，并以10 mL／kg 劑量灌胃給予陽性對照組大鼠，每天1 次，每6 d 停藥1 d；將100、50、25 mg／kg 仙靈骨葆膠囊內(nèi)容物粉末溶于2 mL 生理鹽水中，分別灌胃給予仙靈骨葆膠囊高、中、低劑量組大鼠，每天1 次。各組均給藥10 周。

2.2 骨折愈合時間比較 以骨折線消失或接近消失為骨折愈合標準，記錄每只大鼠骨折愈合時間，取平均值。

2.3 大鼠血清BALP、OC 水平檢測 治療10 周后，采集大鼠尾靜脈血，室溫下靜置2 h 后離心分離血清。將樣品血清加入已包被的96 孔板中，按照ELISA 試劑盒說明書進行操作，加入終止液顯色后立即放入酶標儀中讀取光密度值，繪制標準曲線，計算樣品濃度。

2.4 大鼠骨折部位骨密度測定 治療10 周后，頸椎脫臼法處死大鼠，拔出建模大鼠左側(cè)股骨克氏針，雙能X 線掃描儀掃描左側(cè)股骨骨折部位，骨折線置于中央處，掃描完成后采用配套軟件分析系統(tǒng)測定其骨密度；正常大鼠則掃描左側(cè)股骨中段。

2.5 大鼠骨折部位骨微結(jié)構(gòu)觀察 取建模大鼠骨折處骨組織、正常大鼠左側(cè)股骨中段骨組織，按照HE 染色試劑盒說明書對大鼠骨組織樣品進行切片、染色、封片，在光鏡下觀察骨微結(jié)構(gòu)。

2.6 骨折處骨組織OPG、RANKLmRNA 表達檢測 取大鼠骨組織10 mg，加入液氮研磨勻漿，RNA提取試劑盒提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄為互補脫氧核糖核酸（complementary DNA，cDNA），按照美國國家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）上提供的目的基因mRNA 序列設(shè)計出上下游引物，OPG正向5′-TGATCCGTATAGGCTGTAAGG-3′，反向 5′-GGTTATGCCAACACTGAGTG-3′，產(chǎn)物長度 115 bp；RANKL正向 5′-AGGCTGCTGAAGCTGATAGG-3′，反向5′-TGAGACCTCTCAAGCTAACG-3′，產(chǎn)物長度130 bp；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）正向 5′-TCCGATGCATTAGATACCGA-3′，反向5′-TGAACGCTCAGATGGAACTA-3′，產(chǎn)物長度135 bp。qRT-PCR反應(yīng)條件按照試劑盒說明書設(shè)置，根據(jù)配套熒光采集系統(tǒng)對樣品溶解曲線進行分析，GAPDH作為持家基因，計算各目的基因mRNA 相對表達量。

2.7 骨折處骨組織OPG、RANKL 蛋白表達檢測 取大鼠骨組織10 mg，加入液氮、細胞裂解液研磨勻漿，提取總蛋白，加入蛋白上樣緩沖液，按照Western blot 試劑盒說明書配置電泳凝膠，每孔加入30 μL 樣品進行凝膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯（poly vinylidene fluoride，PVDF）膜上，5%脫脂牛奶4 ℃下封閉過夜、按照1∶1 000 比例稀釋加入一抗，室溫下孵育2 h，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗2 次后，按照1∶1 000 比例稀釋加入二抗，化學發(fā)光液在暗室中顯色，圖像分析系統(tǒng)對顯色條帶灰度值進行分析，以GAPDH 為內(nèi)參。

2.8 統(tǒng)計學分析 通過SPSS 20.0 軟件進行處理，計量資料以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，2 組間比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠骨折愈合時間 建模過程中出現(xiàn)1 只大鼠死亡，可能與過度麻醉有關(guān)。分組情況為正常組8 只、模型組7 只、陽性對照組及仙靈骨葆膠囊高、中、低劑量組各8 只。實驗過程中，未出現(xiàn)大鼠傷口感染。

各組大鼠骨折愈合時間分別為模型組（8.58±0.14）周、陽性對照組（7.50±0.43）周、仙靈骨葆膠囊高劑量組（6.00±0.51）周、仙靈骨葆膠囊中劑量組（6.50±0.25）周、仙靈骨葆膠囊低劑量組（7.75±0.19）周，即陽性對照組、仙靈骨葆膠囊各劑量組均短于模型組（P＜0.05），并呈劑量依賴性。

3.2 大鼠血清BALP、OC、s-CTX 水平 模型組大鼠血清BALP、OC 水平低于正常組（P＜0.05），陽性對照組、仙靈骨葆膠囊各劑量組均高于模型組（P＜0.05），并呈劑量依賴性；模型組大鼠血清s-CTX水平高于正常組（P＜0.05），陽性對照組、仙靈骨葆膠囊各劑量組均低于模型組（P＜0.05），并呈劑量依賴性。見表1。

表1 各組大鼠血清BALP、OC、s-CTX 水平（）Tab.1 Serum BALP，OC and s-CTX levels in rats in various groups（）

表1 各組大鼠血清BALP、OC、s-CTX 水平（）Tab.1 Serum BALP，OC and s-CTX levels in rats in various groups（）

注：與正常組比較，#P＜0. 05；與模型組比較，?P＜0.05。

3.3 大鼠股骨骨折處骨密度 模型組大鼠股骨骨折處骨密度低于正常組（P＜0.05），陽性對照組、仙靈骨葆膠囊各劑量組均高于模型組（P＜0.05），并呈劑量依賴性。見表2。

表2 各組大鼠股骨骨折處骨密度（）Tab．2 Bone mineral densities of femoral fractures in rats in various groups （）

表2 各組大鼠股骨骨折處骨密度（）Tab．2 Bone mineral densities of femoral fractures in rats in various groups （）

注：與正常組比較，#P＜0. 05；與模型組比較，?P＜0.05。

組別動物數(shù)／只骨密度／（mg·cm-2）正常組8136.48±3.75模型組7102.66±4.11#陽性對照組8114.28±2.92?仙靈骨葆膠囊高劑量組8131.75±3.14?仙靈骨葆膠囊中劑量組8125.40±3.58?仙靈骨葆膠囊低劑量組8115.71±2.28?

3.4 大鼠骨折處股骨微結(jié)構(gòu) 正常組大鼠骨小梁分布正常均勻，排列緊密；模型組大鼠骨組織向板層骨發(fā)展，骨小梁、髓腔較少；陽性對照組、仙靈骨葆膠囊低劑量組大鼠骨小梁增多，成骨細胞數(shù)量增加，形成板層狀骨；仙靈骨葆膠囊中劑量組大鼠骨小梁數(shù)目多于陽性對照組、仙靈骨葆膠囊低劑量組，分布均勻；仙靈骨葆膠囊高劑量組大鼠骨小梁分布均勻，數(shù)量較多，可見較明顯髓腔再通。見圖1。

3.5 大鼠股骨骨折處骨組織OPG、RANKLmRNA表達 模型組大鼠骨折處骨組織OPGmRNA 表達低于正常組（P＜0.05），陽性對照組、仙靈骨葆膠囊各劑量組均高于模型組（P＜0.05），并呈劑量依賴性；模型組大鼠股骨骨折處骨組織RANKLmRNA 表達高于正常組（P＜0.05），陽性對照組、仙靈骨葆膠囊各劑量組均低于模型組（P＜0.05），并呈劑量依賴性。見表3。

圖1 各組大鼠股骨骨折處微結(jié)構(gòu)（HE，×200）Fig.1 Microstructures of femoral fractures in rats in various groups（HE，×200）

表3 各組大鼠股骨骨折處骨組織OPG、 RANKL mRNA表達（）Tab.3 mRNA expressions of OPG and RANKL in the bone tissues of femoral fractures in rats in various groups（）

表3 各組大鼠股骨骨折處骨組織OPG、 RANKL mRNA表達（）Tab.3 mRNA expressions of OPG and RANKL in the bone tissues of femoral fractures in rats in various groups（）

注：與正常組比較，#P＜0. 05；與模型組比較，?P＜0.05。

3.6 大鼠股骨骨折處骨組織OPG、RANKL 蛋白表達 模型組大鼠股骨骨折處骨組織OPG 蛋白表達低于正常組（P＜0.05），陽性對照組、仙靈骨葆膠囊各劑量組均高于模型組（P＜0.05），并呈劑量依賴性；模型組大鼠股骨骨折處骨組織RANKL 蛋白表達高于正常組（P＜0.05），陽性對照組、仙靈骨葆膠囊各劑量組均低于模型組（P＜0.05），并呈劑量依賴性。見圖2、表4。

圖2 各組大鼠股骨骨折處骨組織OPG、RANKL 蛋白表達Fig.2 Protein expressions of OPG and RANKL in the bone tissues of femoral fractures in rats in various groups

表4 各組大鼠股骨骨折處骨組織OPG、RANKL 蛋白表達（）Tab.4 Protein expressions of OPG and RANKL in the bone tissues of femoral fractures in rats in various groups（）

表4 各組大鼠股骨骨折處骨組織OPG、RANKL 蛋白表達（）Tab.4 Protein expressions of OPG and RANKL in the bone tissues of femoral fractures in rats in various groups（）

注：與正常組比較，#P＜0. 05；與模型組比較，?P＜0.05。

4 討論

老年、絕經(jīng)后婦女易得骨質(zhì)疏松癥，其特點是骨量丟失、骨微結(jié)構(gòu)改變而易導致骨折［6］，是老年人發(fā)生骨折的主要原因，不但導致患者生活質(zhì)量下降，而且給其帶來較高的死亡風險［7］。由于雌激素可抑制破骨細胞的分化與成熟，有利于成骨細胞的生成，故當其缺乏時會導致破骨細胞活性增加而成骨細胞減弱［8］。目前，常用的雌（孕）激素補充治療雖然可減少骨丟失，降低骨折風險，但也會增加患子宮內(nèi)膜癌的風險［9］，故開發(fā)能促進成骨細胞與破骨細胞平衡的藥物是治療雌激素缺乏導致骨質(zhì)疏松的關(guān)鍵。

去勢大鼠體內(nèi)雌激素缺乏是骨代謝失衡的重要原因，而本實驗發(fā)現(xiàn)模型組大鼠骨密度顯著低于正常組，表明大鼠去勢后雌激素缺乏引起骨量丟失。血清BALP 由成骨細胞分泌，而OC 由成骨細胞分泌，在骨骼的細胞外基質(zhì)中積累，兩者均為骨形成標志物；s-CTX 是破骨細胞分解Ⅰ型膠原的產(chǎn)物，是公認的骨吸收標志物［10］。本實驗發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠血清BALP、OC 水平降低、s-CTX 水平升高，表明雌激素缺乏會導致破骨細胞活性增加，成骨細胞生成受阻［11］，而給藥組前兩者水平升高，后者水平下降，表明仙靈骨葆膠囊、雌激素均有利于維持成骨細胞和破骨細胞代謝平衡。

調(diào)節(jié)成骨細胞和破骨細胞動態(tài)平衡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)通路是 OPG／RANKL 信號通路［12］，RANK 是RANKL 的特異性受體，兩者在破骨細胞表面識別并結(jié)合，可促進破骨細胞分化與成熟，并抑制其凋亡，從而導致骨吸收，降低骨密度［13］，同時其結(jié)合也可引起破骨細胞標志物s-CTX 水平增加［14］。OPG 主要由成骨細胞和骨髓間質(zhì)干細胞分泌，對抑制骨吸收、增加骨密度等起到關(guān)鍵作用［15］，可與RANKL 結(jié)合而占據(jù)后者結(jié)合位點，從而競爭性抑制RANK、RANKL 結(jié)合，從而達到抑制破骨細胞的分化與成熟的目的［16］。由于成骨、破骨細胞處于動態(tài)平衡，故當后者活性受到抑制時前者活性升高，會促進成骨細胞標志物BALP、OC 水平［17-18］。本實驗發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠骨折處骨組織OPGmRNA、蛋白表達低于正常組，而RANKLmRNA、蛋白表達更高，給藥后陽性對照組、仙靈骨葆膠囊各劑量組OPG 表達升高，RANKL 表達降低，以高、中劑量組更明顯，表明戊酸雌二醇、仙靈骨葆膠囊均可上調(diào)OPG 表達，下調(diào)RANKL 表達，以高劑量后者效果更優(yōu)。

綜上所述，仙靈骨葆膠囊可減少去卵巢大鼠骨折愈合時間，增加骨折處骨組織骨密度，增加骨折處骨小梁數(shù)量，提高BALP、OC 水平，降低s-CTX水平，對去卵巢大鼠骨折愈合具有促進作用，其作用機制可能與提高OPGmRNA、蛋白表達，降低RANKLmRNA、蛋白表達，從而促進抑制破骨細胞活性有關(guān)。