BVDV、BRV 和BCoV TaqMan 三重RT-qPCR 檢測方法的建立

孫亞杰，關(guān)平原，周偉光，徐曉靜，希尼尼根，于景麗

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物疾病臨床診療技術(shù)重點實驗室，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古大學(xué)生態(tài)與環(huán)境學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010021）

近年來，犢牛腹瀉的發(fā)病率呈上升趨勢，給養(yǎng)牛業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失。牛病毒性腹瀉病毒（bovine viral diarrhea virus，BVDV）、牛輪狀病毒（bovine rotavirus，BRV）和牛冠狀病毒（bovine coronavirus，BCoV）是引起牛腹瀉性疾病的3 種重要病原[1-3]。這些病原廣泛分布于世界各地[1-4]。BVDV 主要侵害幼齡牛。牛感染BVDV 的臨床癥狀主要表現(xiàn)為腹瀉、肺炎、繁殖障礙和黏膜病等。該病傳播迅速，感染率和發(fā)病率均較高[1]。BRV主要感染1～10 日齡犢牛。犢牛感染后臨床表現(xiàn)為水樣腹瀉、嚴(yán)重脫水和酸中毒，成年牛感染后多呈隱性經(jīng)過[2]。BCoV 是引起犢牛腹瀉、成年牛冬血痢和呼吸道疾病的主要病原，主要導(dǎo)致新生犢牛出血性腹瀉，成年牛冬季嚴(yán)重水樣腹瀉等[4-6]。

BVDV、BRV 和BCoV 混合感染頻率較高，感染后患畜臨床癥狀極為相似且不易識別[1-3，7]，因此建立一種針對BVDV、BCoV 和BRV 的快速準(zhǔn)確、靈敏度高、特異性強(qiáng)的檢測方法勢在必行。傳統(tǒng)的病原分離鑒定及血清學(xué)診斷方法不僅耗時費力，而且敏感性和特異性都較差[8]，已不能滿足臨床診斷需要。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，PCR成為檢測病原的首選方法。而多重PCR 方法可在同一PCR 反應(yīng)體系中實現(xiàn)多種病原體或基因的同步檢測，大大縮短了檢測時間，節(jié)省了試劑用量[9]。實時熒光定量PCR（qPCR）在原有PCR 基礎(chǔ)上與熒光檢測方法結(jié)合，實現(xiàn)了PCR 從定性到定量的飛躍，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)的優(yōu)點[10-13]，還有效規(guī)避了普通PCR 污染環(huán)境和檢測結(jié)果容易出現(xiàn)假陽性的弊端。鑒于此，本研究根據(jù)GenBank 中已登錄的BVDV 5'-UTR、BRVNSP5和BCoVN基因序列設(shè)計特異性引物和探針，通過優(yōu)化反應(yīng)體系和條件[9-14]，建立同時檢測3 種病毒的TaqMan 三重RT-qPCR 檢測方法，為快速鑒別牛腹瀉性疾病病原奠定基礎(chǔ)，亦可為多種病原混合感染的診斷提供方法。

1 材料與方法

1.1 核酸樣品

BVDV-1 型核酸樣品，由本實驗室保存；BRV、BCoV 核酸樣品，均由哈爾濱獸醫(yī)研究所饋贈；BVDV-2 型、牛傳染性鼻氣管炎病毒（infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV）、牛副流感病毒（bovine parainfluenza virus，BPIV）以及魏氏梭菌（Clostridium perfringens，Cp）A 型、B 型、D型（CpA、CpB、CpD）和多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida，Pm）A 型、B 型（PmA、PmB）核酸樣品，均由金宇保靈生物公司饋贈；用于臨床樣品檢測的29 份牛腹瀉糞便拭子樣本，采自內(nèi)蒙古地區(qū)規(guī)?；觯崛〉暮怂針悠酚杀緦嶒炇冶４?。

1.2 主要試劑

One Step PrimeScript ? RT-PCR Kit（Perfect Real Time）、DL500 DNA Marker、pMD19-T 載體、DH5ɑ 感受態(tài)細(xì)胞，均購自TaKaRa 公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒，均購自南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.3 引物設(shè)計與合成

參照GenBank 中已登錄的BVDV-1 5'-UTR（AF091605.1、M96751.1、NC_001461.1、KT896495.1、KR866116.1）、BVDV-2 5'-UTR（KC963968.1、AF502399.1、GQ888686.2、FJ527854.1、AF002227.1）、BRVNSP5（GU937876.12、FJ206081.1、FJ206054.1、MF940692.1、JN831208.1）以及BCoVN（EU401981.1、EU401980.1、EF193074.1、KT318096.1、KM985634.11）基因序列，使用DNAstar 軟件進(jìn)行序列比對，通過確定每個基因中相對保守的區(qū)域來設(shè)計3 種病毒對應(yīng)的特異性引物以及由不同發(fā)光基團(tuán)標(biāo)記的探針（表1）。引物和探針均由上海生工生物有限公司合成。

表1 TaqMan 三重RT-qPCR 的引物和探針序列

1.4 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品制備

以BVDV、BRV 和BCoV RNA 樣品為模板，利用表1 中的引物，采用One Step PrimeScript ?RT-PCR 反應(yīng)試劑盒進(jìn)行RT-PCR 擴(kuò)增。使用25.0 μL反應(yīng)體系：2×One Step RT-PCR Buffer Ⅲ 12.5 μL，ExTaqHS 0.5 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅱ0.5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1.0 μL，模板2.0 μL，ddH2O 補(bǔ)至25.0 μL。反應(yīng)條件為：52 ℃ 15 min，95 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，35 個循環(huán)；72 ℃ 7 min。PCR 產(chǎn)物純化回收后，克隆至pMD19-T 載體構(gòu)建重組質(zhì)粒，選取測序正確的陽性重組質(zhì)粒pMD19-T-BVDV、pMD19-T-BRV 和pMD19-T-BCoV 作為標(biāo)準(zhǔn)品。測定重組質(zhì)粒濃度，并根據(jù)拷貝數(shù)計算公式換算成拷貝數(shù)備用[9]。

1.5 TaqMan 三重RT-qPCR 檢測方法建立

1.5.1 反應(yīng)條件優(yōu)化

1.5.1.1 BVDV、BRV、BCoVTaqMan 單重RTqPCR 反應(yīng)體系和條件優(yōu)化 使用25.00 μL 反應(yīng)體 系：2×one step RT-PCR buffer III 12.50 μL，ExTaqHS 0.50 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix II 0.50 μL，BVDV、BRV 與BCoV 上下游引物用量（50 μmol/L）設(shè)置5 個梯度（0.12、0.14、0.16、0.18、0.20 μL），BVDV、BRV 與BCoV 探針用量（10 μmol/L）設(shè)置5 個梯度（0.60、0.70、0.80、0.90、1.00 μL），模板2.00 μL，最后ddH2O 補(bǔ)充至25.00 μL。設(shè)置5 個退火溫度梯度：52、54、56、58 和60 ℃。對BVDV、BRV 與BCoV 分別進(jìn)行TaqMan 單重RT-qPCR 反應(yīng)條件優(yōu)化。

1.5.1.2 BVDV 與BCoVTaqMan 雙重RT-qPCR反應(yīng)體系和條件優(yōu)化 使用25.00 μL 反應(yīng)體系：2×one step RT-PCR buffer III 12.50 μL，ExTaqHS 0.50 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix II 0.50 μL，確定BVDV 與BCoV 單重RT-qPCR 反應(yīng)體系后，使用矩陣法將BVDV 引物用量（50 μmol/L）設(shè)置3 個濃度梯度（0.16、0.20、0.24 μL），將BCoV 引物用量（50 μmol/L）設(shè)置3 個梯度（0.16、0.20、0.24 μL），BVDV 的探針用量（10 μmol/L）設(shè)置3 個梯度（0.80、1.00、1.20 μL），BCoV的探針用量（10 μmol/L）設(shè)置3 個梯度（0.50、0.70、0.90 μL），模板2.00 μL，最后ddH2O 補(bǔ)充至25.00 μL。設(shè)置5 個退火溫度梯度：52、54、56、58、60 ℃。對BVDV 與BCoV 進(jìn)行TaqMan雙重RT-qPCR 反應(yīng)條件優(yōu)化。

1.5.1.3 BVDV、BRV 與BCoVTaqMan 三重RTqPCR 反應(yīng)體系和條件優(yōu)化 使用25.00 μL 反應(yīng)體系：2×one step RT-PCR buffer III 12.50 μL，ExTaqHS 0.50 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix II 0.50 μL，確定BVDV 與BCoV 雙重RT-qPCR 反應(yīng)體系后，使用矩陣法調(diào)節(jié)BVDV 與BCoV 的引物用量為0.24 μL、0.24 μL（50 μmol/L），將BRV 引物用量（50 μmol/L）設(shè)置9 個濃度梯度（0.12、0.14、0.16、0.18、0.20、0.22、0.24、0.26、0.28 μL），BVDV 與BCoV 的探針用量為1.20、0.70 μL（10 μmol/L），BRV 探針用量（10 μmol/L）設(shè)置9 個梯度（0.50、0.60、0.70、0.80、0.90、1.00、1.10、1.20、1.30 μL），模板2.00 μL，最后ddH2O補(bǔ)充至25.00 μL。設(shè)置5 個退火溫度梯度：52、54、56、58、60 ℃，對BVDV、BRV 與BCoV 進(jìn)行TaqMan 三重RT-qPCR 反應(yīng)條件優(yōu)化。

1.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立 將1010拷貝數(shù)的pMD19-T-BVDV、pMD19-T-BRV 和pMD19-T-BCoV 等量混合后進(jìn)行10 倍倍比稀釋，選取108～101拷貝數(shù)的混合重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作為模板，ddH2O 為陰性對照，每組進(jìn)行3 個重復(fù)。用優(yōu)化的TaqMan 三重RT-qPCR 體系及擴(kuò)增程序進(jìn)行RT-qPCR 擴(kuò)增，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5.3 特異性試驗 以BVDV-1、BVDV-2、BRV、BCoV 的核酸作為陽性對照、以IBRV、BPIV、CpA、CpB、CpD、PmA 和PmB 的核酸為模板，ddH2O 為陰性對照，用本研究建立的TaqMan 三重RT-qPCR 方法進(jìn)行特異性檢測，以評價該方法的特異性。

1.5.4 敏感性試驗 將1010拷貝數(shù)的pMD19-TBVDV、pMD19-T-BRV 和pMD19-T-BCoV 等 量混合后進(jìn)行10 倍倍比稀釋，選取108～100拷貝的混合重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作為模板，ddH2O 為陰性對照，利用本研究建立的TaqMan 三重RT-qPCR 方法進(jìn)行敏感性檢測，以評價該方法的敏感性。同時將1010拷貝數(shù)的pMD19-T-BVDV、pMD19-T-BRV和pMD19-T-BCoV 分別進(jìn)行10 倍倍比稀釋，選取108～100拷貝的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作為模板，ddH2O為陰性對照，采用本實驗室建立的常規(guī)RT-PCR 進(jìn)行檢測，并比較兩種方法的敏感性。

1.5.5 重復(fù)性試驗 選取3 個不同拷貝數(shù)的混合重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，即以104、105、106拷貝/μL為模板，每個濃度重復(fù)3 次，用本研究建立的TaqMan 三重RT-qPCR 方法進(jìn)行組內(nèi)重復(fù)試驗；選取3 個不同時間，用本研究建立的TaqMan 三重RT-qPCR 方法對上述3 個不同濃度的混合重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行組間重復(fù)性試驗，根據(jù)試驗結(jié)果得到的Ct 值來計算組內(nèi)組間變異系數(shù)，評估該方法的重復(fù)性。

1.6 2 種TaqMan RT-qPCR 符合率比較試驗

采用本研究建立的TaqMan 三重RT-qPCR 與OIE 推薦的BVDVTaqMan 單重RT-qPCR 以及文獻(xiàn)[6]和文獻(xiàn)[10]報道的BCoV 和BRV 的TaqMan單重RT-qPCR，對內(nèi)蒙古地區(qū)某養(yǎng)殖場的29 份牛糞便拭子核酸樣品進(jìn)行檢測和符合率分析，以驗證本研究建立的TaqMan 三重RT-qPCR 方法的實用性。

1.7 BVDV、BRV 與BCoV 混合感染分析

對本研究建立的TaqMan 三重RT-qPCR 所檢出的BVDV、BRV 與BCoV 陽性樣品，進(jìn)行混合感染分析。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建

以BVDV、BRV 和BCoV 的RNA 樣品為模板，利用表1 中的引物進(jìn)行RT-PCR 擴(kuò)增，結(jié)果獲得預(yù)期大小的目的片段。目的片段回收純化后，克隆至pMD19-T 載體，選取測序正確的陽性重組質(zhì)粒pMD19-T-BVDV、pMD19-T-BRV 和pMD19-T-BCoV 作為標(biāo)準(zhǔn)品，計算出的拷貝數(shù)分別為3.08×1010，2.98×1010和3.19×1010拷貝/μL

2.2 TaqMan 熒光定量RT-qPCR 方法反應(yīng)條件優(yōu)化

2.2.1 BVDV、BRV、BCoVTaqMan 單重RT-qPCR反應(yīng)條件優(yōu)化TaqMan 單重RT-qPCR 反應(yīng)條件經(jīng)優(yōu)化后，確定BVDVTaqMan 單重RT-qPCR 的反應(yīng)體系為25.0 μL：2×One Step RT-PCR Buffer Ⅲ12.5 μL，ExTaqHS 0.5 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅱ 0.5 μL，BVDV 上、下游引物（10 μmol/L）各1.0 μL，BVDV 探針用量（10 μmol/L）為1.0 μL，模板2.0 μL，ddH2O 補(bǔ)至25.0 μL。最佳反應(yīng)條件為：42 ℃ 5 min；95℃ 10 s；95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，共40 個循環(huán)；退火階段收集熒光信號。確定BRVTaqMan 單重RT-qPCR 的反應(yīng)體系25.0 μL：2×One Step RT-PCR Buffer Ⅲ 12.5 μL，ExTaqHS 0.5 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅱ 0.5 μL，BRV上、下游引物（10 μmol/L）各0.9 μL，BRV 探針用量（10 μmol/L）為0.9 μL，模板2.0 μL，ddH2O 補(bǔ)至25.0 μL。最佳反應(yīng)條件為：42 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s；95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，共40 個循環(huán)；退火階段收集熒光信號。確定BCoVTaqMan 單重RT-qPCR 的反應(yīng)體系25.0 μL：2×One Step RT-PCR Buffer Ⅲ12.5 μL，ExTaqHS 0.5 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅱ 0.5 μL，BCoV 上、下游引物（10 μmol/L）各1.0 μL，BCoV 探針用量（10 μmol/L）為0.7 μL，模板2.0 μL，ddH2O 補(bǔ)至25.0 μL。最佳反應(yīng)條件為：42 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s；95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，共40 個循環(huán)；退火階段收集熒光信號。

2.2.2 BVDV 與BCoVTaqMan 雙 重RT-qPCR反應(yīng)條件優(yōu)化TaqMan 雙重RT-qPCR 反應(yīng)條件經(jīng)優(yōu)化后，確定反應(yīng)體系為25.0 μL：2×One Step RT-PCR Buffer Ⅲ 12.5 μL，ExTaqHS 0.5 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅱ 0.5 μL，BVDV 上、下游引物（10 μmol/L）各1.2 μL，BVDV 探針用量（10 μmol/L）為1.2 μL，BCoV 上、下游引物（10 μmol/L）各1.2 μL，BCoV 的探針用量（10 μmol/L）為0.7 μL，模板2.0 μL，ddH2O 補(bǔ)至25.0 μL。最佳反應(yīng)條件為：42 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s；95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，共40 個循環(huán)；退火階段收集熒光信號。

2.2.3 BVDV、BRV 和BCoVTaqMan 三重RTqPCR 反應(yīng)條件優(yōu)化 BVDV、BRV 和BCoVTaqMan 三重RT-qPCR 反應(yīng)條件經(jīng)優(yōu)化后，確定反應(yīng)體系25.00 μL：2×One Step RT-PCR BufferⅢ 12.50 μL，ExTaqHS 0.50 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅱ 0.50 μL，BVDV 與BCoV 上、下游引物（50 μmol/L）各0.24 μL，BRV 上、下游引物（50 μmol/L）各0.20 μL，BVDV、BCoV 與BRV的探針用量（10 μmol/L）分別為1.20、0.70、1.00 μL，模板2.00 μL，ddH2O 補(bǔ)至25.00 μL。最佳反應(yīng)條件為：42 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s；95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，共40 個循環(huán)；退火階段收集熒光信號。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

用優(yōu)化的TaqMan 三重RT-qPCR 體系及擴(kuò)增程序進(jìn)行RT-qPCR 擴(kuò)增，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果（圖1）顯示：BVDV、BCoV 與BRV 的相關(guān)系數(shù)R2分別為0.998、0.998 和0.999，擴(kuò)增效率E分別為94.7、95.2 和92.1，均在90%～110%之間，具有良好的線性關(guān)系；BVDV、BCoV 與BRV 的回歸方程分別為y1=-3.456x1+42.833、y2=-3.442x2+40.670和y3=-3.527x3+39.776，因此可以根據(jù)所檢臨床樣品的Ct 值，并參照標(biāo)準(zhǔn)曲線對臨床樣品進(jìn)行陰陽性判定。

圖1 BVDV、BRV 和BCoV TaqMan三重RT-qPCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 特異性試驗

利用本研究建立的TaqMan 三重RT-qPCR 方法 對BVDV-1、BVDV-2、BRV、BCoV、IBRV、BPIV、CPA、CPB、CPD、PmA 和PmB 核酸進(jìn)行檢測。結(jié)果（圖2）顯示，僅BVDV-1、BVDV-2、BRV、BCoV 陽性對照出現(xiàn)S 型擴(kuò)增曲線，Ct 值均小于35，而其他病毒的核酸與陰性對照均未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，說明本研究建立的BVDV、BRV、BCoVTaqMan三重RT-qPCR方法具有良好的特異性。

2.5 敏感性試驗

2.5.1TaqMan 三重RT-qPCR 敏感性檢測 用本研究建立的TaqMan 三重RT-qPCR 方法對108～100拷貝/μL 的混合重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行敏感性檢測。結(jié)果（圖3）顯示，BVDV、BCoV 與BRV 的最低檢測限均為10 拷貝/μL，表明本研究所建立的TaqMan 三重RT-qPCR 檢測方法靈敏性高。

圖2 TaqMan 多重RT-qPCR 特異性擴(kuò)增曲線

圖3 BVDV、BRV、BCoV TaqMan三重RT-qPCR 敏感性試驗結(jié)果

2.5.2 常規(guī)RT-PCR 敏感性試驗結(jié)果 采用常規(guī)RT-PCR 方法對108～100拷貝/μL 的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行敏感性檢測。結(jié)果（圖4）顯示，BVDV、BCoV 與BRV 的最低檢測限均為103拷貝/μL。本研究所建立的TaqMan 三重RT-qPCR 的檢測敏感性與之比較，敏感性提高了100 倍。

圖4 BVDV、BRV 以及BCoV 常規(guī)RT-PCR 敏感性結(jié)果

2.6 重復(fù)性試驗

用本研究建立的TaqMan 三重RT-qPCR 方法，對104～106拷貝的混合質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行組內(nèi)和組間重復(fù)試驗。結(jié)果（表2）顯示，BVDV、BRV和BCoV 的組內(nèi)、組間重復(fù)試驗變異系數(shù)均小于2%，表明本研究建立的TaqMan 三重RT-qPCR 檢測方法重復(fù)性較好。

2.7 兩種TaqMan RT-qPCR 符合率的比較試驗

利用兩種TaqMan RT-qPCR 對29 份牛糞便拭子核酸樣品進(jìn)行檢測，所檢樣品Ct 值小于35 時判定為陽性，Ct 值大于35 時判定為陰性。結(jié)果（表3）顯示，BVDV 檢出率分別為62.1%（18/29）、62.1%（18/29），符合率為100%；BRV 檢出率分別為20.7%（6/29）、17.2%（5/29），符合率為96.5%；BCoV 檢出率分別為27.6%（8/29）、27.6%（8/29），符合率為100%。結(jié)果表明，本研究建立的TaqMan 三重RT-qPCR 方法檢測結(jié)果較可靠，準(zhǔn)確性較高，可以用于臨床檢測。

表2 TaqMan 三重RT-qPCR 方法組內(nèi)和組間重復(fù)性結(jié)果

表3 兩種TaqMan 熒光定量RT-qPCR 方法的檢測結(jié)果比較 %

2.8 BVDV、BRV 與BCoV 混合感染

對利用本研究建立的TaqMan 三重RT-qPCR檢出BVDV、BRV 與BCoV 的陽性樣品進(jìn)行混合感染分析。結(jié)果（表4）顯示，29 份臨床樣品中存在BVDV+BRV、BVDV+BCoV、BRV+BCoV、BVDV+BRV+BCoV 4 種混合感染型，其混合感染率分別為10.3%（3/29）、27.6%（8/29）、10.3%（3/29）、3.4%（1/29），總混感率為51.7%（15/29）。結(jié)果表明，該養(yǎng)殖場牛群中存在BVDV、BRV 與BCoV 的混合感染，在不同的混合感染型中，以BVDV+BCoV 最為突出。

表4 29 份臨床樣品中BVDV、BRV 與BCoV混合感染統(tǒng)計結(jié)果

3 討論

本研究首次建立了針對BVDV、BCoV 和BRV 的TaqMan 三重RT-qPCR 方法，有效規(guī)避了2013 年林初文等[13]建立的BVDV、BCoV 和BRV三重RT-PCR 方法不能定量和易出現(xiàn)假陽性的弊端，具有靈敏度高、假陽性低的優(yōu)點。本研究建立的三重RT-qPCR 方法與OIE 推薦的BVDVTaqMan單重RT-qPCR 方法相比，符合率為100%，與文獻(xiàn)[6]和文獻(xiàn)[10]分別報道的BCoV 和BRV 的TaqMan 單重RT-qPCR 方法相比，BRV 符合率為96.5%，BCoV 符合率為100%，說明本研究建立的TaqMan 三重RT-qPCR 方法相比原有的TaqMan 單重RT-qPCR 方法更準(zhǔn)確，且大大縮減了檢測時間，減少了試劑用量，從而降低了檢測成本。

本研究建立的BVDV、BRV、BCoVTaqMan三重RT-qPCR 方法僅能對BVDV-1、BVDV-2、BRV、BCoV 進(jìn)行特異性檢測，對IBRV、BPIV、CPA、CPB、CPD、PmA 和PmB 檢測呈陰性，說明BVDV 5'-UTR、BRVNSP5和BCoVN基因序列高度保守。其對應(yīng)的引物和探針序列特異性強(qiáng)，且與犢牛腹瀉其他相關(guān)病毒性或致病性細(xì)菌無交叉反應(yīng)，是針對3 個靶標(biāo)基因的最佳引物與探針，這與文獻(xiàn)[12]、文獻(xiàn)[10]和文獻(xiàn)[13]分別報道的結(jié)果一致。

敏感性和重復(fù)性是衡量多重qPCR 方法優(yōu)劣的重要指標(biāo)。本研究建立的TaqMan 三重RT-qPCR方法對BVDV、BRV 和BCoV 的檢測敏感度均達(dá)到了10 拷貝/μL，比2011 年范晴等[11]建立的BVDV 與BRVTaqMan 雙重RT-qPCR 方法的敏感度提高了10 倍；與2019 年王莎莎等[12]建立的BCoVTaqMan 單重RT-qPCR 方法的敏感性相當(dāng)，但后者只能實現(xiàn)對BCoV 的單重檢測。因此，本研究建立的TaqMan 三重RT-qPCR 方法比TaqMan單重及雙重RT-qPCR 方法敏感性更強(qiáng)。BVDV、BRV 和BCoV 的組內(nèi)和組間變異系數(shù)均小于2%。該變異系數(shù)低于文獻(xiàn)[6]和文獻(xiàn)[12]報道的變異系數(shù)（＜3%～5%），說明該方法重復(fù)性好、穩(wěn)定性很強(qiáng)，在用于臨床樣品檢測時比較可靠。

利用本研究建立的TaqMan 三重RT-qPCR方法，對29 份臨床樣品進(jìn)行檢測，共檢出4 種混合感染型：BVDV+BRV、BVDV+BCoV、BRV+BCoV 二重感染和BVDV+BRV+BCoV 三重感染，其混合感染率分別為10.3%（3/29）、27.6%（8/29）、10.3%（3/29）和3.4%（1/29），總混合感染率為51.7%（15/29），表明該養(yǎng)殖場牛群中存在嚴(yán)重的BVDV、BRV 和BCoV 感染，且混合感染情況嚴(yán)重。這為牛腹瀉病的臨床診斷提供了方向，當(dāng)判定為BVDV、BRV、BCoV 單重感染時，還應(yīng)考慮是否存在混合感染情況，以便對牛腹瀉性疾病進(jìn)行準(zhǔn)確治療與預(yù)防。本研究建立的TaqMan 三重RT-qPCR 方法可在一份樣品中同時檢測BVDV、BRV 和BCoV 三種病原，為今后由BVDV、BRV 和BCoV 共感染引起的牛腹瀉性疾病的鑒別診斷和流行病學(xué)調(diào)查提供了新的技術(shù)手段。