非洲豬瘟自然弱毒株演變進程

戈勝強，王振忠，呂 艷，屈海龍，張瀟月，胡永新，錢鶯娟，吳曉東，王志亮

（1.中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，教育部動物健康與食品安全國際合作聯(lián)合實驗室，江蘇南京 210095；3.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東泰安 271001）

自1921 年非洲豬瘟（African swine fever，ASF）在肯尼亞首次被報道以來，科學(xué)家就開始嘗試對其病原特性及疫苗可行性進行研究。早期的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)ASF 在某一個地區(qū)定殖后，其烈性程度會降低，亞臨床和慢性病例就會增多，而溫和型的ASF 可能只有發(fā)熱的臨床癥狀[1]。這種現(xiàn)象可能是因為流行株已經(jīng)適應(yīng)豬與豬之間的連續(xù)傳播或是最初感染的毒株就是弱毒株[2]。隨著該病的不斷蔓延和關(guān)注度的不斷提高，ASF 分離毒株數(shù)量也在不斷增加并出現(xiàn)多株自然弱毒株。雖然目前尚無疫苗研發(fā)成功，但是ASF 自然弱毒株的演變規(guī)律對于其科學(xué)防控具有重要的借鑒作用，而國內(nèi)目前尚無專業(yè)介紹，沒有全面展示ASF 自然弱毒株的演變進程，為此作者就ASF 自然弱毒株的現(xiàn)狀進行綜述，以期為我國ASF 的科學(xué)防控提供參考。

1 非洲、西歐和南美洲ASF 自然弱毒株演變過程（2007 年之前）

自ASF 在非洲被發(fā)現(xiàn)后，隨著流行發(fā)病記錄不斷積累，科學(xué)家們逐步認識到該病主要是自限性流行（因為病死率接近100%）。但同時，該病也在非洲部分國家演變?yōu)榈胤搅餍行砸卟?，其主要表現(xiàn)是死亡率下降和出現(xiàn)大量慢性或隱性感染豬[2-4]。例如在1933 年，該病傳播到南非西開普省時，共感染11 000 頭家豬[5]，結(jié)果有8%的豬只存活。這可能是毒株與新地區(qū)宿主相互適應(yīng)后毒力變化的首次報道[6]。相似地，1956 年報道安哥拉共和國（非洲西南部）養(yǎng)豬業(yè)（主要是散養(yǎng)模式）受ASF 影響損失慘重，但亞急性和慢性ASF 病例也逐漸增多。這也被認為是非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）在家豬體內(nèi)反復(fù)傳代的適應(yīng)性變化[4，7-9]。1973 年，Pini[10]從南非分離出無紅細胞吸附活性的低致病力毒株（Lillie-148 毒株，分離自南非德蘭士瓦），1975 年又分離到無紅細胞吸附活性的無臨床癥狀毒株（24823，分離自南非彼得斯堡），這是非洲首次報道分離出該類毒株。這類毒株一直被認為是毒力減弱毒株。1979—1985年，Thomson分離到多株無紅細胞吸附活性的毒株，其中扎伊爾毒株（Zaire strain）[11]接種12 頭豬后，4 頭死亡，8 頭存活（2 頭出現(xiàn)臨床癥狀、6 頭無臨床反應(yīng)），且其中存活的7 頭豬攻強毒后均存活；姆庫澤毒株（Mkuze）[3]接種3 頭豬后，所有豬有體溫反應(yīng)和臨床癥狀，表明其為中等毒力毒株[12]。基于上述發(fā)現(xiàn)及血清學(xué)診斷方法被推薦用于研究亞急性和慢性感染[13]，Haresnape 和Allaway[14-16]分別在1981—1986 年和1989—1991 年對馬拉維（非洲東南部）開展ASF 流行病學(xué)調(diào)查并進行血清學(xué)監(jiān)測，結(jié)果證實ASF 在馬拉維部分地區(qū)已經(jīng)成為地方流行性疫病，可能存在弱毒株流行。隨后，莫桑比克（非洲東南部）[17-18]、塞內(nèi)加爾（非洲西部）[13]、尼日利亞（西非東南部）[19-22]、烏干達（非洲東部）[23]、乍得（非洲中部）[24]、剛果（非洲中西部）[25-26]等非洲國家均監(jiān)測到一定比例的ASF 血清學(xué)陽性豬或ASFV 感染康復(fù)豬。雖然對于ASF 已經(jīng)成為地方流行性疫病的部分非洲國家，該病的死亡率已經(jīng)降至50%～60%，危害性似乎降低很多，但當(dāng)其新傳入某地時仍導(dǎo)致大量農(nóng)場感染，一半以上的豬群死亡，表明其仍可造成災(zāi)難性后果[27]。

當(dāng)ASF 在一個國家流行較長時間后，其臨床表現(xiàn)將由急性發(fā)病轉(zhuǎn)變?yōu)榫徛l(fā)病或出現(xiàn)新的臨床表現(xiàn)[8]。最典型的例子是，1960 年該病傳入西班牙時，感染豬病死率可達100%，傳入3～4 年后，開始出現(xiàn)亞臨床或潛伏感染豬[8]。伴隨著該病的持續(xù)流行，感染豬死亡率逐漸下降，至80 年代時降到了2%～3%，甚至一些病例中出現(xiàn)無臨床癥狀感染豬[8]。而且發(fā)病豬體內(nèi)的病毒載量大幅下降（組織中載量由106.5HAD50/g 降為102.5～104.5HAD50/g），典型病變發(fā)生改變（脾臟病變轉(zhuǎn)變?yōu)槲父瘟馨徒Y(jié)和腎淋巴結(jié)病變?yōu)橹鳎?，紅細胞吸附活性毒株分離率降低（分離株首次傳代紅細胞吸附活性比例由90%～95%降為80%～85%）[28]。葡萄牙的ASF流行情況也比較相似，流行初期時（1957—1960年）ASF 致死率可達100%，但1980 年以后出現(xiàn)了大量的亞急性病例（特別在葡萄牙南部的阿倫特霍?。Ｍ瑫r，也發(fā)現(xiàn)一些有ASF 抗體但無任何臨床癥狀的潛伏感染豬[29]。這些臨床癥狀的變化可能與西班牙和葡萄牙大范圍使用的疫苗株（以1960 年分離的Lisbon 60 毒株為母本毒株，在豬骨髓細胞上連續(xù)傳代所得[30]）擴散有關(guān)[4，8，31-32]。1968 年，葡萄牙從一只慢性感染豬體內(nèi)分離到一株無紅細胞吸附活性的自然弱毒株，命名為NHV（NH/P68）[33-34]，此時距葡萄牙首次疫情已過去8年。該毒株毒力已顯著下降且無紅細胞吸附活性，后經(jīng)全基因序列分析推測，此毒株可能是Lisbon 60 疫苗株演變而來[35]。1974 年，Vigário 等[36]報道從葡萄牙慢性肺炎豬體內(nèi)分離到無紅細胞吸附活性的毒株（ASFV-NHA）。1988 年，葡萄牙又從棲居于豬場的游走鈍緣蜱（O.erraticus）中分離到無紅細胞吸附活性的弱毒株，命名為OURT88/3、OUR T88/4 和OUR T88/5 等。同時期，從軟蜱體內(nèi)也分離到有紅細胞吸附活性的強毒株（如OUR T88/1，OUR T91/1 和MAR T92/1 等）。無紅細胞吸附活性的弱毒株和部分有紅細胞吸附活性的強毒株分離自同一個農(nóng)場，這可能暗示臨床中弱毒株提供的“免疫”保護使得強毒株存活下來，這也部分解釋了葡萄牙南部的阿倫特霍省為何存在無臨床癥狀的血清陽性豬群[29]。

西班牙和葡萄牙低死亡率ASF 疫情的流行，導(dǎo)致了伊比利亞半島出欄的生豬攜帶更多ASFV，由此生產(chǎn)加工出的豬肉制品通過銷售渠道將ASF傳播到法國（1964年、1968年和1974年）、古巴（1971年和1980 年）、馬耳他（1978 年）、意大利撒丁島（1978 年）、巴西（1978 年）、多米尼加（1978年）、海地（1978 年）、意大利（1967 年和1968年）、比利時（1985 年）和荷蘭（1986 年）[9]等。雖然繼西班牙和葡萄牙之后，相繼發(fā)病的國家中有的首發(fā)疫情很難追溯到源頭，但巧合的是，后期流行的毒株有一大部分是低毒力的。例如，法國1974 年傳入的毒株可能為毒力減弱毒株[4]，而且在馬耳他[37-38]、海地[39]、巴西和多米尼亞[40-41]都出現(xiàn)過低死亡率的ASF 疫情或監(jiān)測到ASF抗體陽性豬[42]，部分地區(qū)還分離到中等毒力毒株[43]，如巴西1978 年分離株（Brazil'78）[40-44]，馬耳他1978 年分離株（Malta'78）[37]和荷蘭1986 年分離株（Netherlands'86）[45-46]等。該病的進化趨勢使低毒力毒株得以流行，導(dǎo)致控制該病流行過程中面對的問題更加復(fù)雜[8]。

2 東歐、中歐ASF 自然弱毒株演變過程（2007年之后）

截至2007 年，歐洲絕大多數(shù)國家已成功根除ASF（除意大利撒丁島），并通過有效的防控措施阻止了該病傳入，因此20 世紀(jì)末歐盟被認定為ASF 無疫區(qū)。但2007 年該病再次進入歐亞大陸后（格魯吉亞首發(fā)），疫情發(fā)展速度遠超以往。俄羅斯（2007年）、烏克蘭（2012年）、白俄羅斯（2013年）、立陶宛（2014 年）、愛沙尼亞（2014 年）、波蘭（2014年）、拉脫維亞（2014 年）、羅馬尼亞（2017 年）、捷克（2017年）、匈牙利（2018年）、比利時（2018年）和德國（2020 年）等國家相繼暴發(fā)ASF。雖然大多數(shù)分離毒株的序列分析顯示，俄羅斯及歐洲其他國家流行的ASFV 與格魯吉亞2007 毒株（Georgia 2007/1）高度同源，病死率接近100%。但是部分研究顯示，從野豬體內(nèi)分離的毒株毒力更低，感染后病程更長[47]，同居攻毒試驗中有無癥狀豬存活（1/10）[48]，甚至口鼻攻毒后出現(xiàn)不發(fā)病現(xiàn)象（1/10）[49]。同時，一些監(jiān)測數(shù)據(jù)[49-51]顯示，某些特定區(qū)域中存在無癥狀但ASF抗體陽性的野豬，這說明盡管最初傳入的是強毒株，但一些感染豬在某些時候可以存活，保持亞臨床感染甚至康復(fù)，這可能是由于流行毒株毒力減弱，使得一部分動物初次感染后獲得免疫力而存活下來甚至康復(fù)[52]。為查明俄羅斯ASF流行株中是否存在毒力減弱毒株，Pershin[53]對俄羅斯境內(nèi)分離的ASFV（2013—2018年）進行動物接種試驗，結(jié)果Lipetsk 12/16 毒株（分離自利佩茨克，俄羅斯西南部城市）和Odintsovo 02/14毒株（分離自莫斯科州，俄羅斯歐洲部分中部）的病死率分別為50.0%和87.5%，且Lipetsk 12/16毒株接種存活豬攻強毒后（使用Orlovsky 03/17 毒株）全部存活。

歐洲的研究中也發(fā)現(xiàn)了相似的毒力減弱毒株。2018 年，Nurmoja 等[49]在對野豬攻毒試驗中存活豬樣品分離到的病毒進行全基因組測序，發(fā)現(xiàn)了一株大范圍基因缺失株（與Georgia 2007/1 基因組相比，ASFV-Estonia 株在5'端缺失14 560 bp）。進一步對不同地區(qū)的野豬臨床樣品檢測，Zani 等[54]證實愛沙尼亞Ida-Viru 郡（東北方向）存在這種毒力減弱毒株[54]。2017 年，Gallardo 等[55]在拉脫維亞野豬體內(nèi)分離到無紅細胞吸附活性的自然弱毒株（Lv17/WB/Rie1）并經(jīng)攻毒保護試驗證實其安全有效。隨后，基于該毒株的野豬口服疫苗研究開啟[56]。目前該口服疫苗仍在評價中。

3 國內(nèi)ASF 流行演變推測及防控對策

自2018 年ASF 傳入我國以來，疫情報告次數(shù)呈現(xiàn)大幅下降趨勢（2018 年99 起、2019 年63 起、2020 年19 起）。但2021 年的科技文獻[57-58]顯示，該病在國內(nèi)的流行情況出現(xiàn)新的變化，主要是出現(xiàn)死亡率下降、臨床癥狀不典型、分離到無紅細胞吸附活性的“自然變異株”。臨床中出現(xiàn)“自然變異株”，特別是無紅細胞吸附活性的毒株符合ASF 自然發(fā)展規(guī)律，如論文中報道的ASFV 自然變異株HuB-20[57]和HLJ/HRB1/20[58]均在CD2v 功能區(qū)發(fā)生基因丟失，導(dǎo)致該毒株無紅細胞吸附活性。鑒于該類毒株的出現(xiàn)，未來ASF 流行可能將呈現(xiàn)更加復(fù)雜的變化，“非典型ASF”的案例可能會逐漸增多并進一步在部分區(qū)域流行散發(fā)。

“自然變異株”因毒力減弱可能存在臨床癥狀不典型，容易與其他疫病混淆的特點。這意味著單純的病原學(xué)檢測方法（如熒光定量方法）存在漏檢可能性。同時，國外成功根除ASF 的國家在最后階段都使用血清學(xué)方法進行篩查，而目前國內(nèi)尚無批準(zhǔn)應(yīng)用的血清學(xué)診斷產(chǎn)品，因此建議應(yīng)加強這方面的研究、加快產(chǎn)業(yè)化報批進程，并在適宜情況下適時開展血清學(xué)監(jiān)測追溯。此外，應(yīng)進一步加強監(jiān)督管理，嚴厲打擊非法生產(chǎn)、使用ASF 疫苗的行為，消除其對ASF 疫情防控的不利影響；加大ASF 臨床流行病學(xué)、分子流行病學(xué)和血清流行病學(xué)監(jiān)測力度，及時了解流行動態(tài)，以便制定更加有針對性的防控措施。