液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定豬尿液中地西泮及其7 種代謝物殘留

張祖維，李木子，李雪蓮，張鴻偉，曹旭敏，孫曉亮，隋金鈺，宋翠平，霍乃蕊，趙思俊

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，山西晉中 030801；2.中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032；3.青島易邦生物工程有限公司，山東青島 266113；4.青島海關(guān)技術(shù)中心，山東青島 266002）

地西泮（Diazepam）又名安定，是苯二氮卓類藥物的典型代表，具有鎮(zhèn)靜催眠、抗驚厥的作用，是獸醫(yī)臨床上用來減輕或消除動物狂躁不安，使動物恢復(fù)平靜的藥物[1]。然而，該類藥物常被不法分子作為飼料添加劑用于畜禽養(yǎng)殖過程，對畜禽起到鎮(zhèn)靜催眠、增重催肥、縮短出欄時間的作用，從而達(dá)到非法牟利目的。另外，我國幅員遼闊，不同地區(qū)生豬、豬肉價格差異加大，因此出欄生豬長距離調(diào)運、異地屠宰的現(xiàn)象較為普遍。長途運輸極易導(dǎo)致動物脫水、體重減輕，甚至死亡。為了減少損失，地西泮等鎮(zhèn)靜藥物易被非法使用，而多數(shù)動物進(jìn)入屠宰場后直接被屠宰，動物產(chǎn)品中殘留的大劑量藥物將對人類造成嚴(yán)重危害[2-3]，尤其是對患有心血管疾病的消費者。為此，我國、國際食品法典委員會（CAC）、歐盟（EU）等均規(guī)定在動物性食品中不得檢出地西泮及其鹽和酯[4-6]。

地西泮在生物體內(nèi)通常被代謝酶生物轉(zhuǎn)化為去甲西泮、替馬西泮、奧沙西泮、甲硝西泮、硝西泮、7-氨基甲硝西泮、7-氨基硝西泮等[1，7-10]，而且這些代謝物大多也具有生物活性，例如替馬西泮、奧沙西泮、甲硝西泮、硝西泮等已被開發(fā)成藥物并在臨床應(yīng)用[1]。因此，建立一種可同時測定豬組織中地西泮及其代謝物的檢測方法顯得尤為迫切。

目前，檢測苯二氮卓類藥物殘留的方法有液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）[3，9]、液相色譜-飛行時間質(zhì)譜法[2，8]、氣相色譜質(zhì)譜法[11-12]、液相色譜法[7，10]以及免疫測定法[13]等。然而，針對地西泮及其代謝物的檢測方法報道較少，且此類報道[7-9，12]主要針對人或小鼠尿液、血液中地西泮代謝物的測定，而對食品動物中地西泮及其代謝物的檢測尚未見報道。由于在生豬販運、屠宰環(huán)節(jié)，豬尿液的采集不僅方便、快捷，而且可活體采樣，能有效避免對動物機體造成損傷，因此豬尿液常被作為屠宰前大批量采集、快速檢測的對象[14]。本研究擬建立一種可同時測定豬尿液中地西泮及其7 種代謝物殘留的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）方法，以期為監(jiān)控生豬販運、屠宰環(huán)節(jié)違法使用苯二氮卓類鎮(zhèn)靜藥物提供可靠的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

AcquityTMUPLC-Xevo TQ MS 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀、UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）、固相萃取裝置，均為美國Waters 公司生產(chǎn)；陽離子固相萃取柱（PCX，60 mg/3 mL），購自美國Aglient 公司；高速冷凍離心機，購自德國Eppendorf 公司；氮吹儀，購自美國Organomation公司。

甲醇、乙腈（均為色譜純），購自美國Merck公司；氨水（分析純），購自中國國藥試劑有限公司；甲酸（色譜純），購自CNW 公司。

標(biāo)準(zhǔn)品：地西泮（Diazapam，1 mg/mL）、硝西泮（Nitrazepam，1 mg/mL）、7-氨基硝西泮（7-Aminonitrazepam，100 μg/mL）、甲硝西泮（Nimetazepam，1 mg/mL）、7-氨基甲硝西泮（7-Aminonimetazepam，100 μg/mL）、去甲西泮（Nordiazepam，1 mg/mL）、奧沙西泮（Oxazepam，1 mg/mL）等，購自美國Cerilliant 公司；替馬西泮（Temazepam，1 mg/mL），購自美國O2Si 公司。8 種化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)及轉(zhuǎn)化圖如圖1 所示。

圖1 地西泮及其代謝物的化學(xué)結(jié)構(gòu)及轉(zhuǎn)化圖

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別取適量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用甲醇配制成1 000 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)儲備液，-20 ℃保存；然后分別量取適量的8 種藥物儲備液于容量瓶中混合，配制10 μg/L混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 樣品前處理

準(zhǔn)確量取豬尿液2 mL，加0.1%甲酸溶液1 mL，加入經(jīng)3 mL 甲醇、3 mL 水活化的PCX 柱后，依次用3 mL 水和3 mL 60%甲醇水溶液洗滌，真空抽干，以3 mL 5%氨化甲醇溶液洗脫，50 ℃水浴條件下用N2吹干，最后用1 mL 初始比例流動相（0.1%甲酸水溶液:乙腈=8:2，V/V）復(fù)溶，以待檢測。

1.4 色譜-質(zhì)譜條件

1.4.1 色譜條件 流動相A 為0.1%甲酸水溶液，B 為乙腈，液相洗脫梯度條件見表1。進(jìn)樣量5 μL，柱溫35 ℃，流速0.3 mL/min，流動相為0.1%甲酸（A）和乙腈（B）。梯度洗脫程序為：0～0.5 min，80%～65%A；0.5～3.0 min，65%A；3.0～3.5 min，65%～55%A；3.5～4.0 min，55%A；4.0～4.5 min，55%～20%A；4.5～5.5 min，20%A；5.6～7.0 min，80%A。

1.4.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI），正離子掃描，使用多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式。毛細(xì)管電壓2 800 V，離子源溫度150 ℃，霧化室溫度450 ℃；去溶劑氣（氮氣）流量1 000 L/h，錐孔氣（氮氣）流量50 L/h，碰撞氣（氬氣）流量0.24 L/h。各化合物定性、定量離子對及碰撞電壓、毛細(xì)管電壓等質(zhì)譜檢測參數(shù)見表1。

表1 8 種藥物的保留時間、母離子、子離子及質(zhì)譜檢測參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜-質(zhì)譜條件確定

選擇一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，利用Intellistart 軟件，以ESI 正離子模式（ESI+）對待測藥物進(jìn)行母離子確認(rèn)及子離子掃描。地西泮等藥物分子結(jié)構(gòu)中含有氮原子，且多呈仲胺或叔胺形式，在ESI 離子化方式下，極易形成[M+H]+。因此，選取[M+H]+作為藥物的母離子，以正離子檢測模式電離，分別對儀器的錐孔電壓、碰撞能量等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)行子離子掃描。選取2 個豐度強、穩(wěn)定的碎片離子作為定性與定量離子，以滿足歐盟2002/657/EC[17]對禁用藥物L(fēng)C-MS/MS 方法定性監(jiān)測的規(guī)定，即滿足1 個母離子、2 個子離子共4 個鑒定點數(shù)的要求。8 種藥物的保留時間及定性、定量離子及質(zhì)譜檢測參數(shù)見表1。

依據(jù)對CSH C18、BEH C18等不同鍵合相的色譜柱對藥物分離進(jìn)行比較的結(jié)果，本研究選用UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）作為分析色譜柱。由于7-氨基硝西泮和7-氨基甲硝西泮2 種藥物的極性較其他藥物較強，因此本研究選用較低比例的有機溶劑（0.1%甲酸:乙腈=80:20，V/V）作為初始流動相條件，并采用梯度洗脫的方式，8 種藥物可在5.5 min 內(nèi)實現(xiàn)良好的分離，且能與基質(zhì)中干擾組分有效分離，提高了方法的靈敏度。各藥物的定量離子的提取離子色譜圖如圖2 所示。

圖2 基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液中地西泮及其7 種代謝物質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）色譜圖（0.3 μg/L）

2.2 樣品凈化條件優(yōu)化

基于液-固相色譜理論的固相萃取技術(shù)，采用選擇性吸附、洗脫方式，對樣品進(jìn)行富集、分離、凈化，與傳統(tǒng)的液液萃取法、蛋白沉淀法相比，固相萃取具有無可比擬的優(yōu)勢。從傳統(tǒng)硅膠基填料到新型二乙烯基苯聚合物填料的發(fā)展，固相萃取已成為當(dāng)前食品安全檢測中樣品凈化的主要手段[7，14-17]。地西泮等苯二氮卓類藥物含有多個N 原子，屬堿性化合物，因此可使用具有陽離子交換特性的固相萃取柱凈化該類藥物[17-18]。

為獲得更好的方法檢測指標(biāo)（重復(fù)性、變異系數(shù)、檢測限、基質(zhì)效應(yīng)消除等），本研究專門對Waters、Agilent、CNW 等3 家公司以聚苯乙烯-二乙烯基苯高聚物為基質(zhì)的3 種陽離子SPE 柱（分別簡寫為MCX-W、PCX、MCX-C），對8 種待測物的吸附保留特性進(jìn)行了較為詳細(xì)的比較。以酸化的尿液樣品上樣后，分別用不同體積分?jǐn)?shù)的甲醇水溶液（0、20%、30%、50%、60%、70%、80%、100%）和5%氨化甲醇進(jìn)行淋洗，制作淋洗曲線，然后對各藥物在3 種SPE 柱上的保留特點進(jìn)行考察。結(jié)果顯示，8 種待測藥物在3 種SPE 柱的保留特點有一定差別。Waters 公司的MCX-W 柱對待測藥物的保留能力最弱，60%甲醇可將奧沙西泮藥物洗脫，洗脫率為25.5%；70%甲醇還可將替馬西泮洗脫，奧沙西泮和替馬西泮的洗脫率分別為73.2%和87.8%，其他6 種藥物均不能被洗脫。CNW 公司的MCX-C 柱和Agilent 公司的PCX 柱較前者的保留能力略強，60%甲醇不能將任何藥物洗脫，70%甲醇溶液可將奧沙西泮、替馬西泮洗脫，洗脫率為48.6%～53.2%，其他6 種藥物均不能被洗脫。

為此，本研究進(jìn)一步比較了CNW 公司的MCX-C 柱和Agilent 公司的PCX 柱對8 種藥物的保留特性及基質(zhì)效應(yīng)，以水、60%甲醇水溶液作為淋洗液進(jìn)行淋洗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：8 種藥物在2種SPE 柱均可有效保留；而以5%氨化甲醇進(jìn)行洗脫后，8 種藥物的回收率均為75.0%～114.0%，均可滿足獸藥殘留檢測的需要。按照基質(zhì)效應(yīng)的計算方法[19-20]，以PCX 柱凈化的基質(zhì)效應(yīng)為67.0%～135.0%，以MCX-C 柱凈化的基質(zhì)效應(yīng)為35.0%～148.0%。因此，本研究選取Agilent 公司的PCX 柱作為凈化柱，將尿液pH 調(diào)至酸性后上樣，再依次用水、60%甲醇水溶液各3 mL 進(jìn)行淋洗，最后用5%氨化甲醇洗脫待測物。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 基質(zhì)添加標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢測限和定量限 在上述最佳色譜-質(zhì)譜條件下，將空白豬尿液樣品按照1.3 中的方法進(jìn)行處理。在洗脫液中加入一系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液制備基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線，用UPLC-MS/MS 檢測。以各藥物的濃度與其定量離子峰面積進(jìn)行線性回歸，發(fā)現(xiàn)在0.3～20.0 μg/L 范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（R2均大于0.995）。通過尿液添加回收試驗，確定本方法測定豬尿液中地西泮及其7 種代謝物的檢出限為0.1 μg/L，定量限為0.3 μg/L（表2）。

2.3.2 準(zhǔn)確度和精密度檢測 分別在豬尿液中以定量限、2 倍定量限、20 倍定量限等3 個水平（0.3、0.6 和6.0 μg/L）進(jìn)行空白樣品加標(biāo)回收試驗，考察方法的準(zhǔn)確度/回收率（n=18）、日內(nèi)變異系數(shù)（n=6）和日間變異系數(shù)（n=3）。以基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行校正，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，8 種藥物的平均回收率為73.6%～95.3%，日內(nèi)、日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.9%～18.6%和2.2%～12.6%（表2）。

2.4 實際樣品檢測 以本方法對山東省某屠宰場抽取的45份豬尿液樣品進(jìn)行檢測，未發(fā)現(xiàn)陽性樣品。

表2 豬尿液中8 種藥物的標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、平均回收率和日內(nèi)、日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

3 結(jié)論

本研究通過對不同陽離子交換固相萃取柱及淋洗、洗脫條件進(jìn)行選擇、優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)選取PCX柱進(jìn)行凈化可有效去除樣品基質(zhì)干擾，從而建立了UPLC-MS/MS 測定豬尿液中地西泮及其7 種代謝物殘留的分析方法。該方法靈敏度高、重復(fù)性好，且操作簡單、快速，可用于畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測大批量樣品中鎮(zhèn)靜劑類藥物殘留的篩查和確證。