腎被膜下胰島移植治療1 型糖尿病模型小鼠的研究

（廣醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院胃腸腺體外科，廣西 南寧 530021）

1 型糖尿?。═1DM）由于自身β 細(xì)胞免疫損傷被破壞，導(dǎo)致胰島素絕對分泌不足[1]。而胰島移植是可以將胰島素水平維持在生理上適當(dāng)范圍內(nèi)的糖尿病治療方式[2]。2000 年Edmonton 方案提出以及在臨床上的成功應(yīng)用，使胰島移植在治療糖尿病方面得到廣泛關(guān)注[3]。本研究結(jié)合本課題組夏小林等[4]前期小鼠胰島腎被膜移植研究的基礎(chǔ)上，采用膽管逆行灌注聯(lián)合胰腺原位灌注射改良了胰腺分離消化方法，在移植過程中采用低位腎被膜開口移植技術(shù)，旨在探索新的胰島移植操作方法與方法，并對提取的胰島細(xì)胞功能及移植效果進(jìn)行評價(jià)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物和主要試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 選擇SPF 級，8～10 周齡的C57BL/6J雄性小鼠60 只，由廣西醫(yī)科大學(xué)動物試驗(yàn)中心提供。

1.1.2 主要試劑與儀器 Hanks 緩沖液與D-Hanks 緩沖液（美國Boster 公司）；血糖儀(美國歐姆龍公司）；倒置顯微鏡（日本OLYMPUS 公司）；內(nèi)徑0.58 mm聚乙烯管PE50（美國Becton Dickinson 公司）；膠原酶V、雙硫腙（Dithizone，DTZ）、臺盼藍(lán)、淋巴細(xì)胞分離液（Histopaqueo-1077）及鏈脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）購自美國Sigma 公司；RPMI-1640 培養(yǎng)基及胎牛血清（四季青）；小鼠胰島素酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）（上海酶聯(lián)公司）。主要試劑的配制：①灌注液：50000 U 肝素鈉+200 U 胰島素+Hanks 液500 ml，過濾器過濾，定pH 為7.3，4 ℃保存；②消化液：6 mg 膠原酶+5 ml 灌注液，濃度為1.2 mg/ml,現(xiàn)配現(xiàn)用；③終止液：5000 U 肝素+200 U 胰島素+Hanks 液500 ml+50 ml 胎牛血清，經(jīng)過濾器過濾，定pH 為7.3，4 ℃保存。

1.2 方法

1.2.1 胰島的分離 ①胰腺的灌注：1%戊巴比妥鈉按0.01 ml/g 腹腔注射麻醉，酒精消毒，腹部切口打開腹腔，剪斷胸骨和膈肌，翻轉(zhuǎn)肝臟至胸腔內(nèi)，便于充分暴露肝門。在視顯微鏡下，找膽總管與十二指腸交匯處，在交匯處將靠近膽總管兩邊的胰腺組織各撕開一小口，用止血鉗穿過兩開口夾閉腸管，小心分離膽總管近端便于逆行灌注消化液。用胰島素注射器于近端膽總管處穿刺，用鑷子固定針頭防止針頭刺破膽總管，緩緩?fù)谱⑾? ml，重復(fù)2 次，使胰體尾膨脹，迅速將整個(gè)胰腺連帶脾臟切除，再對胰腺進(jìn)行多點(diǎn)灌注使胰腺尾部進(jìn)一步充盈，將灌注好的胰腺放入50 ml 離心管冰盒中保存，重復(fù)操作1 次；②胰腺的消化：將灌注好的胰腺在37.5 ℃水浴箱中水浴，靈活掌握水浴時(shí)間，直至胰腺組織消化為細(xì)小泥沙狀。水浴完成后，迅速加入30 ml 終止液重懸洗滌，4 ℃、700 g，離心1 min，倒掉上清，重復(fù)1 次。

1.2.2 胰島的純化 離心管內(nèi)加入5 ml 分離液，重懸混勻，將離心管大約10°角平放在冰上，順著管壁緩慢加入D-hanks 緩沖液5 ml，避免震動，再將試管緩慢豎直，可在分離液和緩沖液之間看到明顯的分離界面，調(diào)節(jié)離心機(jī)加減速全部為0，4 ℃、700 g，離心12 min，離心結(jié)束后會看到胰島細(xì)胞懸浮在兩分離液面之間，巴氏管小心吸取懸浮物至新的15m 離心管中，加10 ml 1640 培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）重懸洗滌，離心機(jī)設(shè)置同上離心1 min，倒掉上清，重復(fù)洗滌1 次；挑選250 個(gè)胰島為1 組，冰上保存。

1.2.3 胰島活性、數(shù)量、純度與功能檢測 ①胰島活性測定：臺盼藍(lán)染色法，臺盼藍(lán)對活性細(xì)胞不染色，死亡細(xì)胞染為藍(lán)色。胰島細(xì)胞成活率=未染色細(xì)胞/細(xì)胞總數(shù)×100%；②胰島數(shù)量及純度測定：純度：DTZ染色計(jì)算胰島細(xì)胞純度=胰島細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞細(xì)數(shù)×100%。計(jì)數(shù)：將胰島細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，用移液槍重復(fù)3 次取樣，50 ml/次，胰島數(shù)=（3 次陽性總數(shù)/3）×20×樣本量（ml），150 μm 左右大小的的胰島細(xì)胞團(tuán)為1 個(gè)當(dāng)量（IEQ）[5，6]；③胰島細(xì)胞功能測定：葡萄糖刺激胰島素釋放試驗(yàn)測定胰島細(xì)胞功能。挑選100個(gè)50～200μm 大小，質(zhì)量高的胰島細(xì)胞團(tuán)，分為高糖組和低糖組，每組5 孔，分別置于含16.7 mmol/L 和3.3 mmol/l 的葡萄糖的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，37.5 ℃，體積分?jǐn)?shù)5%的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)60 min，采集上清液，用小鼠胰島素酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)進(jìn)行測定分析。

1.2.4 胰島移植 ①糖尿病小鼠模型的建立及分組：造模前夜間禁食10～12 h，但保證水的供應(yīng)，STZ 溶液現(xiàn)配現(xiàn)用，腹腔內(nèi)注射，劑量為170 mg/kg，注射后2 h 給予喂食。注射后5 d 取小鼠尾靜脈血，檢測隨機(jī)血糖，連續(xù)兩天隨機(jī)血糖＞16.7 mmol/L 認(rèn)為造模成功，7 d 后選取血糖穩(wěn)定的小鼠進(jìn)行腎被膜下胰島移植，但要求血糖＞20 mmol/L。隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對照組（n=13）和實(shí)驗(yàn)組（n=13），為1 型糖尿病模型小鼠并給予同種異體胰島細(xì)胞腎被膜下移植；②腎被膜下胰島移植：受體小鼠麻醉消毒備皮，于左肋下取一2 cm 切口，暴露腎臟，用顯微鑷在靠近腎下極處輕輕撕開一2 mm 低位腎被膜開口，移植前腎被膜需用生理鹽水提前浸泡的細(xì)玻璃棒充分分離。將人工挑選好的一組胰島細(xì)胞用微量注射器吸入內(nèi)徑0.58 mm 的聚乙烯軟管內(nèi)[7，8]，低溫離心1 min使胰島細(xì)胞團(tuán)聚集一起便于移植，用微量注射器將胰島細(xì)胞緩慢打入腎被膜下，電凝器燒灼低位腎被膜開口，防止胰島細(xì)胞從開口流出至腹腔，縫合肌層皮膚復(fù)溫至麻醉蘇醒。

1.2.5 胰島移植后效果評估 ①血糖檢測：術(shù)后前7天，每天隨機(jī)時(shí)間取小鼠尾靜脈血測血糖，以后每周測1～2 次血糖，如果連續(xù)2 次隨機(jī)血糖＜11.1 mmol/L，可以認(rèn)為小鼠糖尿病逆轉(zhuǎn)治愈；②葡萄糖耐量檢測：移植術(shù)后第10 天，在兩組小鼠中分別隨機(jī)選取4 只小鼠做葡萄糖耐量檢測，檢測前小鼠夜間禁食但保證水供應(yīng)，腹腔注射葡萄糖，劑量為2.0 g/kg，分別于0、15、30、60、90、120 min 尾靜脈取血測定血糖；③腎被膜下胰島組織評估：移植術(shù)后第29 天切除實(shí)驗(yàn)組小鼠左腎，繼續(xù)監(jiān)測兩組小鼠隨機(jī)血糖，并觀察胰島組織在腎被膜下大體形態(tài)，取下的左腎經(jīng)4%多聚甲醛固定、脫水、包埋、切片，蘇木素-伊紅（HE）染色后觀察腎被膜下移植物的組織學(xué)形態(tài)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0 和GraphPad Prism8.0 軟件分析數(shù)據(jù)作圖，計(jì)量資料以（）表示，兩組間比較用t檢驗(yàn)，P＜0.05 表示為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胰島產(chǎn)量和活性 每只小鼠可獲得（200.23±30.18）個(gè)高質(zhì)量胰島細(xì)胞團(tuán)；胰島細(xì)胞團(tuán)經(jīng)DTZ 染色后顯示純度＞90.00%；經(jīng)臺盼藍(lán)染色活性良好，活性＞90.00%，見圖1。

圖1 胰島染色

2.2 葡萄糖刺激胰島素釋放試驗(yàn)結(jié)果 高糖組檢測每個(gè)胰島素釋放量為（1.98±0.20）ng/胰島，低糖組檢測每個(gè)胰島素釋放量為（0.69±0.11）ng/胰島，高糖組為低糖組的2.87 倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 小鼠成模結(jié)果 15 只受體小鼠按170 mg/kg 腹腔注射STZ 后，低血糖死亡1 只，1 只血糖＜16.7 mmol/L，剩余13 只小鼠血糖值都＞16.7 mmol/L，并出現(xiàn)“三多一少”的現(xiàn)象，造模成功率為86.73%。

2.4 移植后小鼠血糖結(jié)果 移植術(shù)后實(shí)驗(yàn)組血糖第1、2 天逐步下降，第3 天全部降至正常范圍內(nèi)（＜11.1 mmol/L），移植術(shù)后第4、6、7、14、21、28 天兩組血糖水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；實(shí)驗(yàn)組小鼠移植術(shù)后第29 天摘除左腎后血糖明顯上升，并于摘除左腎術(shù)后第2 天血糖全部＞16.7 mmol/L，兩組血糖比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1、表2、圖2。

表1 兩組移植術(shù)后血糖水平比較（，mmol/L）

表1 兩組移植術(shù)后血糖水平比較（，mmol/L）

表2 兩組左腎摘除術(shù)后血糖水平比較（，mmol/L）

表2 兩組左腎摘除術(shù)后血糖水平比較（，mmol/L）

圖2 兩組移植后血糖比較

2.5 葡萄糖耐量檢測結(jié)果 兩組小鼠在腹腔注射葡萄糖后血糖迅速升高，15 min 血糖值到達(dá)高峰，隨后血糖值逐步下降，在90 min 血糖值恢復(fù)到11.1 mmol/L以下，兩組不同時(shí)間血糖值比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖3、表3。

圖3 兩組葡萄糖耐量血糖比較

表3 兩組小鼠葡萄糖耐量結(jié)果比較（，mmol/L）

表3 兩組小鼠葡萄糖耐量結(jié)果比較（，mmol/L）

2.6 胰島組織學(xué)評價(jià) 實(shí)驗(yàn)組左腎體式顯微鏡下見胰島細(xì)胞團(tuán)明顯存在于在腎上極背膜下，并且移植物表面已有新生血管生成（圖4A 黑色箭頭所示）；移植物切片HE 染色鏡下觀察移植胰島細(xì)胞與腎實(shí)質(zhì)分界模糊，部分胰島細(xì)胞仍保持團(tuán)狀聚集（圖4B黑色箭頭所示），移植胰島細(xì)胞內(nèi)部發(fā)現(xiàn)較多血細(xì)胞，說明移植物內(nèi)部也有毛細(xì)血管生成（圖4B 灰色箭頭所示），說明移植物已建立血液循環(huán)存活良好。

圖4 體式顯微鏡下移植物大體觀

3 討論

雖然腎被膜胰島移植的動物模型技術(shù)早已建立，但影響移植模型成功與否的因素有很多，如胰島的分離消化，胰島細(xì)胞的產(chǎn)出數(shù)量、純度活性，以及術(shù)者移植操作技術(shù)是否熟練也是影響因素之一。

本實(shí)驗(yàn)根據(jù)傳統(tǒng)腎被膜下胰島移植技術(shù)做了部分改良，在分離階段采用膽總管逆行灌注聯(lián)合離體多點(diǎn)注射灌注法。膠原酶原位灌注法比離體灌注可獲得較多的胰島細(xì)胞產(chǎn)量[9]，有些學(xué)者采用單一膽總管原位灌注法[10，11]。而本研究操作中發(fā)現(xiàn)，雖然原位灌注可將胰腺組織灌注充盈，但小鼠胰尾靠近脾臟部充盈程度較胰頭體部較差。本實(shí)驗(yàn)采用聯(lián)合兩種方法進(jìn)行灌注，在一定程度上解決了這個(gè)問題，可使整個(gè)胰腺充分膨脹，進(jìn)而使胰腺組織在水浴過程中更充分消化，相比于本實(shí)驗(yàn)室前期報(bào)道[4]，提高了單只小鼠胰腺組織獲取胰島細(xì)胞的數(shù)量，而且胰島細(xì)胞的活性及產(chǎn)生胰島素的功能也都表現(xiàn)良好。同時(shí)聯(lián)合灌注法可在膽總管穿刺失敗時(shí)進(jìn)行補(bǔ)救性灌注，也可獲得一定數(shù)量的胰島細(xì)胞，節(jié)省動物成本。

移植階段有些學(xué)者采用腎上極背膜開口移植胰島[8，12，13]，而采用腎上極背膜開口極易使胰島細(xì)胞在注入時(shí)從穿刺口流出，導(dǎo)致腎被膜下移植量出現(xiàn)差異，影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。改良采用腎被膜低位開口注入胰島，由于分離的腎被膜面積較大，可使胰島細(xì)胞團(tuán)被腎被膜輕松包裹，從而解決了移植物從穿刺口流出這一問題。腎被膜下胰島移植是在缺氧環(huán)境下進(jìn)行[14，15]，低位腎被膜開口產(chǎn)生的較大腎被膜移植面積，使注入的胰島細(xì)胞具有更大的活動空間，在一定程度上避免了由于胰島細(xì)胞團(tuán)堆積引起的嚴(yán)重的缺氧而導(dǎo)致的移植物凋亡丟失。葡萄糖刺激胰島素釋放試驗(yàn)結(jié)果提示提取的胰島細(xì)胞分泌胰島素水平良好；移植術(shù)后，實(shí)驗(yàn)組小鼠隨機(jī)血糖在術(shù)后第3天即可全部恢復(fù)至正常水平，且能長期保持穩(wěn)定，說明小鼠腎被膜下異體胰島移植可以逆轉(zhuǎn)1 型糖尿病小鼠血糖值，而葡萄糖耐量檢測結(jié)果說明移植胰島細(xì)胞團(tuán)分泌胰島素能力與正常小鼠無差異。切除實(shí)驗(yàn)組小鼠左腎后，小鼠血糖有明顯升高且恢復(fù)到移植前水平，說明實(shí)驗(yàn)組小鼠前期的血糖下降是由移植的胰島細(xì)胞產(chǎn)生的胰島素引起，葡萄糖耐量測定也表明實(shí)驗(yàn)組小鼠降血糖效果和正常小鼠無差異，移植后組織評價(jià)也表明移植胰島細(xì)胞能在腎被膜下良好存活，符合課題組改良移植技術(shù)后的實(shí)驗(yàn)預(yù)期。

綜上所述，改進(jìn)的腎被膜下胰島移植技術(shù)可以獲得更多胰島細(xì)胞量，可使移植物在腎被膜下穩(wěn)定定植產(chǎn)生胰島素，提高模型成功率，為下一步的藥物干預(yù)篩選奠定了良好的基礎(chǔ)。