楊梅果渣醇提物降糖活性組分篩選及其功能評(píng)價(jià)

張加干，唐偉敏，劉 哲，陸勝民*，夏其樂，周裔彬

（1 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院 合肥230036 2 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品科學(xué)研究所 浙江省果蔬保鮮與加工技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室農(nóng)業(yè)部果品采后處理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 杭州310021）

糖尿病以慢性高血糖為特征，已成為世界各國的一大健康問題[1-2]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計(jì)，2014年全球估計(jì)有4.22 億成人患有糖尿病，其中II 型糖尿病占總數(shù)的90%。糖尿病及其并發(fā)癥的治療越來越受到關(guān)注。二甲雙胍、羅格列酮等化學(xué)藥物被廣泛應(yīng)用于糖尿病的治療，而其副作用對(duì)患者的健康造成很大的損害[2]。大量研究表明從植物中提取的活性成分對(duì)糖尿病的治療效果良好，且無毒副作用[3-6]。

楊梅（Myrica rubra Sieb.et Zucc）原產(chǎn)于中國，口感鮮美，色澤誘人，富含糖、酸、維生素和礦物質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)，在我國南方已經(jīng)有2 000 多年的種植歷史[7]。楊梅成熟期為高溫、多雨的6-7月，果實(shí)無外果皮包裹，貯藏及運(yùn)輸十分困難[8]。楊梅常被加工成果汁和果酒等產(chǎn)品，產(chǎn)生約占鮮重30%～40%的果渣[9]。目前對(duì)楊梅果渣開發(fā)利用的研究較少。楊梅富含多酚、黃酮等植物次級(jí)代謝產(chǎn)物，前人的研究發(fā)現(xiàn)其具有抗氧化[9-11]、抗炎[12]、抑菌[13]、止瀉[14]等功能。近期研究表明，楊梅提取物具有抗癌活性[15-17]，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝[18]等功能。另外，還發(fā)現(xiàn)楊梅中的黃酮類化合物對(duì)α-葡萄糖苷酶有較高的抑制活性[19]。目前，對(duì)楊梅提取物的化學(xué)成分和抗氧化性能、體外降糖活性的研究很多，而對(duì)楊梅提取物的體內(nèi)降糖活性評(píng)價(jià)相對(duì)較少。

本研究以總花色苷、總黃酮和總酚含量以及α-葡萄糖苷酶抑制活性為指標(biāo)，對(duì)AB-8 大孔樹脂純化楊梅果渣醇提物的不同組分進(jìn)行篩選。采用鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)的II 型糖尿病小鼠模型，以體重、空腹血糖和血清生化（總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇等）以及病理形態(tài)（肝臟和腎臟）為指標(biāo)，評(píng)價(jià)其改善II 型糖尿病及其并發(fā)癥的效果，為將楊梅果渣醇提物開發(fā)成為具有降糖功效的天然功能性食品配料提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

楊梅冷凍果渣由浙江楊百利飲品有限責(zé)任公司提供。AB-8 大孔樹脂，天津允開樹脂科技有限公司。鏈脲佐菌素（STZ），Sigma 公司；羅氏血糖試紙，羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司；福林酚、阿卡波糖（Acarbose）和對(duì)硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG），上海源葉生物科技有限公司；其它試劑，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 設(shè)備與儀器

高速多功能粉碎機(jī)（BJ-200），德清拜杰電器有限公司；冷凍干燥機(jī)（SCIENTZ-18N），寧波新芝生物科技股份有限公司；數(shù)控超聲波清洗器（KQ-500DB），昆山市超聲儀器有限公司；離心機(jī)（LXJHB），上海安亭科學(xué)儀器廠；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（R1002B），上海申生科技有限公司；層析柱（55 mm×800 mm），上海滬西分析儀器廠有限公司；電子天平（BS200S-WE1），余姚金諾電子天平儀器有限公司；紫外-可見分光光度儀（UV-1800），日本島津公司；電熱恒溫水槽（DK-8B），上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；多功能酶標(biāo)儀（ELx800），美國伯騰儀器有限公司；高效液相色譜儀（Waters 2695-2487），美國沃特世公司；飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（Agilent 6210），安捷倫科技有限公司；羅氏（rRoche）血糖儀，羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司；全自動(dòng)生化分析儀（AU5800），美國貝克曼庫爾特有限公司。

1.3 楊梅果渣醇提物的制備

楊梅果渣經(jīng)冷凍干燥后粉碎，過60 目篩，于-40 ℃保存?zhèn)溆?。預(yù)處理后的楊梅果渣按料液比1∶20（m/V）加入95%乙醇進(jìn)行超聲輔助（500 W，30 min）提取，室溫離心（4 000 r/min，20 min）后收集上清液。殘?jiān)貜?fù)提取兩次，合并上清液，經(jīng)減壓濃縮制得提取物濃縮液[20]。取濃縮液（50 mg/mL）100 mL 經(jīng)AB-8 大孔樹脂過柱（55 mm×800 mm）純化，分別用2 床體積（BV）不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇（10%，30%，50%，70%和90%）洗脫（2 BV/h），收集各洗脫液，經(jīng)減壓濃縮、冷凍干燥制得不同洗脫組分。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與高脂飼料

6 周齡清潔級(jí)雌性ICR 小鼠購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，飼養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)室。自購IVC 獨(dú)立送風(fēng)飼養(yǎng)籠具，環(huán)境溫度為（22±2）℃，晝夜循環(huán)12 h。飼喂輻照飼料和水，小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。高脂飼料：豬油10%，蔗糖5%，蛋黃粉5%，膽固醇1%，膽鹽0.1%，基礎(chǔ)飼料78.9%。

1.5 總花色苷、總黃酮和總酚含量測定

花色苷含量的測定采用pH 示差法[21]，結(jié)果以相當(dāng)于mg 矢車菊素-3-O-葡萄糖苷（C3G）/g DW（DW：冷凍干燥后的質(zhì)量）為單位計(jì)算總花色苷含量?？傸S酮含量的測定參照硝酸鋁絡(luò)合分光光度法[22]，以mg 蘆?。≧utin，RE）/g DW 為單位計(jì)算總黃酮含量?？偡雍康臏y定使用福林酚法[23]，以mg 沒食子酸（Gallic acid equivalent，GAE）/g DW 為單位計(jì)算總酚含量。

1.6 α-葡萄糖苷酶的抑制活性測定

α-葡萄糖苷酶的抑制活性參考Kumar 等[24]方法，并加以修改。將α-葡萄糖苷酶配制成0.4 U/mL 母液，依次在96 孔板中加入0.1 mol/L 磷酸鉀液（560 μL）、α-葡萄糖苷酶母液（100 μL）和樣品溶液（40 μL），混勻，于37 ℃恒溫靜置15 min。加入2.5 mol/L PNPG（100 μL），37 ℃恒溫反應(yīng)15 min，加入2.5 mol/L Na2CO3溶液（400 μL）終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測定405 nm 處的吸光值（A1）。以不加樣品的為對(duì)照（A0），不加α-葡萄糖苷酶的作為空白對(duì)照（A2），阿卡波糖作陽性對(duì)照。α-葡萄糖苷酶抑制率計(jì)算公式：

1.7 II 型糖尿病小鼠造模及分組

按照隨機(jī)數(shù)字表法從130 只小鼠中隨機(jī)選取8 只作為正常對(duì)照組給予基礎(chǔ)飼料飼養(yǎng)，模型組120 只小鼠給予高脂高糖飼料。兩周后，所有模型組小鼠腹腔被注射檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（pH 4.5）稀釋的100 mg STZ/kg 體重（BW），1 周后重復(fù)注射1 次。同時(shí)，正常對(duì)照組小鼠腹腔注射等量的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（pH4.5）。STZ 注射1 周后，用血糖儀測定所有小鼠空腹血糖，至少2 次血糖值大于11 mmol/L 時(shí)，建模成功。反之，則剔除試驗(yàn)。

將建模成功的小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為B-E 共4 組，A 組為正常對(duì)照組，每組各8 只。具體分組情況見表1。

1.8 給藥方法

建模成功后，A 組與B 組小鼠灌300 mg/kg BW 生理鹽水，C-E 組小鼠每天分別灌胃300 mg/kg BW 二甲雙胍、100 mg/kg BW EC30 和300 mg/kg BW 的EC30，連續(xù)灌喂3 周。

表1 實(shí)驗(yàn)分組及給藥Table 1 Experimental grouping and administration

1.9 體重和空腹血糖測定

小鼠體重每周測定2 次，空腹血糖每周測定1 次。禁食12 h 后，小鼠尾部取血，用血糖儀測定各組空腹血糖值。

1.10 血清的生化檢測

給藥3 周后，將小鼠禁食12 h，稱重，隨后眼眶靜脈取血，頸椎脫臼處死，取腎臟和肝臟，快速稱重，置4%多聚甲醛溶液中。取血后，室溫靜置，凝結(jié)后離心分離血清，用全自動(dòng)生化分析儀檢測以下指標(biāo)：①血脂：總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-c）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-c）；②肝功能：谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT/ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT/AST）；③腎功能：尿素氮（BUN）、血肌酐（Cr）；④抗氧化水平：超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）。

1.11 病理形態(tài)學(xué)分析

取部分腎組織和右葉肝組織置于10%多聚甲醛中固定24 h，常規(guī)石蠟包埋，10 μm 切片，腎組織和肝組織進(jìn)行蘇木精-伊紅（H & E）染色，觀察并分析組織的病理形態(tài)學(xué)改變。

1.12 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度乙醇洗脫組分中總花色苷、總黃酮和總酚含量

大孔樹脂具有較好的選擇性，吸附量大，吸附速度快，可再生等優(yōu)點(diǎn)，常用于天然化合物的初步分離，如AB-8、D101 等樹脂常用于黃酮類化合物的分離純化。采用AB-8 大孔樹脂純化楊梅果渣醇提物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在楊梅果渣乙醇粗提物和5 個(gè)體積分?jǐn)?shù)乙醇的洗脫組分中，30%乙醇洗脫組分（Elution component 30，EC30）的總花色苷、總黃酮和總酚含量顯著高于其它組分（P＜0.05）（表2），其總花色苷、總黃酮和總酚含量分別為（289.89 ± 11.92）mg C3G/g DW，（376.34 ±9.94）mg RE/g DW 和（663.92±34.07）mg GAE/g DW。相比于粗提物，EC30 的總花色苷、總黃酮和總酚含量分別提高5.5，12.4 倍和11.4 倍。AB-8 樹脂對(duì)楊梅果渣醇提物中的花色苷、黃酮和酚類均有良好的富集效果，且用30%乙醇洗脫效果最佳。

表2 不同體積分?jǐn)?shù)乙醇對(duì)洗脫組分中總花色苷、總黃酮和總酚含量的影響Table 2 Effect of different ethanol concentrations on total anthocyanin，total flavonoids and total phenol content in elution components

2.2 α-葡萄糖苷酶抑制活性評(píng)價(jià)

α-葡萄糖苷酶是膳食碳水化合物轉(zhuǎn)化為葡萄糖的關(guān)鍵酶，可通過其抑制活性來篩選降糖活性成分。楊梅果渣粗提物和5 種洗脫組分對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的半抑制濃度（IC50）在0.006～0.137 mg/mL（圖1）。粗提物和5 種洗脫組分對(duì)α-葡萄糖苷酶的IC50隨乙醇濃度的提高呈先下降后升高的趨勢(shì)。其中，EC30 對(duì)α-葡萄糖苷酶的IC50雖最低，為（0.006±0.001）mg/mL，但仍顯著高于陽性對(duì)照阿卡波糖（P＜0.05）。以上結(jié)果表明，采用AB-8 大孔樹脂對(duì)楊梅果渣提取物進(jìn)行初步純化，5 個(gè)濃度的乙醇洗脫液中以EC30 對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制效果最佳。

2.3 EC30 對(duì)小鼠體重、空腹血糖水平的影響

楊梅果渣粗提物和5 個(gè)乙醇體積分?jǐn)?shù)的洗脫組分中，EC30 的總花色苷、總黃酮和總酚含量顯著高于其它組分（P＜0.05），且具有最高的α-葡萄糖苷酶抑制活性。基于以上結(jié)果，采用糖尿病小鼠模型來評(píng)價(jià)EC30 的降糖作用。EC30 對(duì)STZ 誘導(dǎo)的小鼠體重的影響如圖2a所示。在第1 周，糖尿病小鼠體重顯著低于正常對(duì)照組（A）小鼠（P＜0.05），這是因?yàn)樽⑸銼TZ 導(dǎo)致體重減輕[25]。在接下來的2 周，模型控制組（B）小鼠體重緩慢增加，而EC30 組（D 和E）和正常對(duì)照組（A）體重顯著增加（P＜0.05），表明不同劑量的EC30 對(duì)小鼠體重減輕有一定的緩解作用，且當(dāng)EC30 為100 mg/kg BW時(shí)效果最佳。

圖1 楊梅果渣粗提物和不同濃度乙醇洗脫組分對(duì)α-葡萄糖苷酶半抑制濃度的影響Fig.1 Effects of crude extracts of bayberry pomace and different ethanol concentration on the IC50 of α-glucosidase

空腹血糖的升高也是II 型糖尿病的重要特征[26]。使用空腹血糖值來評(píng)價(jià)EC30 對(duì)葡萄糖代謝的影響，如圖2b所示。EC30 給藥3 周導(dǎo)致STZ 誘導(dǎo)的糖尿病小鼠空腹血糖水平呈劑量依賴性下降，并且兩種劑量給藥1 周后空腹血糖水平均顯著低于模型控制組（B），其降糖作用顯著低于二甲雙胍（300 mg/kg BW）（P＜0.05）。

圖2 EC30 對(duì)小鼠體重（a）和空腹血糖（b）的影響Fig.2 Effect of EC30 on body weight（a）and fasting blood glucose（b）in mice

2.4 EC30 對(duì)STZ 誘導(dǎo)的II 型糖尿病小鼠血脂水平的影響

如表3所示，模型控制組（B）小鼠血清的TC、TG 和LDL-c 水平顯著高于正常對(duì)照組（A），尤其是TC 和LDL-c 水平。給藥3 周后，EC30 組（D 和E）的TC、TG 和LDL-c 水平顯著低于B 組（P＜0.05）。E 組小鼠血清的高密度脂蛋白膽固醇（HDL-c）水平顯著低于B 組（P＜0.05），而D 組的HDL-c 水平與B 組無顯著性差異（P＞0.05）。

EC30 對(duì)STZ 誘導(dǎo)的II 型糖尿病小鼠血清抗氧化酶和丙二醛（MDA）的影響見表4。模型控制組（B）小鼠血清的超氧化物歧化酶（SOD）活性顯著低于正常對(duì)照組（A）（P＜0.05）。EC30 組（D 和E）小鼠的MDA 含量顯著低于其它組，其SOD 活性顯著高于B 組（P＜0.05），說明EC30 對(duì)糖尿病小鼠的抗氧化活性的修復(fù)作用顯著。與模型控制組（B）相比，EC30 組（D 和E）的谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT/ALT）、尿素氮（BUN）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST/GOT）和肌酐（Cr）等指標(biāo)變化無明顯規(guī)律。

表3 EC30 對(duì)STZ 誘導(dǎo)的II 型糖尿病小鼠血脂水平的影響Table 3 Effect of EC30 on blood lipid levels in STZ-induced type II diabetic mice

表4 EC30 對(duì)STZ 誘導(dǎo)的II 型糖尿病小鼠抗氧化酶和MDA 的影響Table 4 Effect of EC30 on antioxidant enzymes and MDA in STZ-induced type II diabetic mice

2.5 病理形態(tài)學(xué)觀察

肝臟組織形態(tài)學(xué)觀察采用H & E 染色，結(jié)果見圖3 A。與細(xì)胞形態(tài)完整、排列有序的正常組小鼠相比（圖3 A1），糖尿病小鼠肝臟的大量肝細(xì)胞損傷，其特征為細(xì)胞缺陷、肝細(xì)胞壞死和黏液性肝細(xì)胞（圖3 A2）。EC30 的灌喂顯示出改善組織病理學(xué)證據(jù)，即壞死區(qū)減少和脂滴積聚對(duì)STZ 誘導(dǎo)的組織學(xué)改變的減弱（圖3 A4 和3A5），表明給予低劑量EC30 可改善糖尿病的肝臟組織。

圖3 小鼠肝臟、腎臟H & E 染色結(jié)果Fig.3 Mouse liver and kidney H&E staining results

腎臟組織H&E 染色結(jié)果如圖3 B所示。STZ誘導(dǎo)糖尿病小鼠的肝臟比正常小鼠受損明顯（圖3 B2）。模型控制組小鼠腎小管受損，腎小球部分結(jié)合和硬化，系膜細(xì)胞增生肥大和淋巴細(xì)胞浸潤。EC30 明顯減輕了肝臟組織學(xué)損傷，而以100 mg/kg BW 灌喂劑量效果最佳（圖3 B4）。

對(duì)細(xì)胞毒性敏感的肝臟、腎臟在糖尿病動(dòng)物的葡萄糖代謝中有重要作用。肝臟和腎臟的組織學(xué)結(jié)果表明，EC30 對(duì)STZ 損傷的器官有一定的修復(fù)作用，對(duì)于改善糖尿病小鼠細(xì)胞酶活性，恢復(fù)細(xì)胞功能具有重要作用。

3 結(jié)論

采用AB-8 大孔樹脂篩選楊梅果渣醇提物活性成分，其中EC30 的總花色苷、總黃酮和總酚含量顯著高于其它組分（P＜0.05），分別為（289.89 ±11.92）mg C3G/g DW，（376.34 ± 9.94）mg RE/g DW 和（663.92±34.07）mg GAE/g DW，相比粗提液分別提高5.5，12.4 倍和11.4 倍。AB-8 大孔樹脂對(duì)楊梅果渣醇提物中花色苷、黃酮和酚類成分有良好的富集作用，30%乙醇洗脫濃度效果最佳，且EC30 對(duì)α-葡萄糖苷酶的半抑制濃度IC50最低，為（0.006±0.001）mg/mL。EC30 可緩解II 型糖尿病小鼠體重減輕癥狀，降低小鼠空腹血糖水平；顯著降低糖尿病小鼠總膽固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白膽固醇水平（P＜0.05），并通過增加超氧化物歧化酶等抗氧化酶的活性來降低氧化應(yīng)激反應(yīng)。此外，組織病理學(xué)觀察表明，EC30 對(duì)糖尿病小鼠肝臟和腎臟細(xì)胞有一定的修復(fù)作用。以上結(jié)果表明，楊梅果渣醇提物有潛力成為具有降糖功效的天然功能性食品添加劑。