原發(fā)性肝癌中P38γ高表達(dá)及其對(duì)腫瘤形成作用

陳 翔 胡 晟 周玉慶 高 宏 吳 林 趙 偉 張 璠

原發(fā)性肝癌(primary hepatic carcinoma，PHC)是最常見且惡性程度最高的腫瘤之一，在世界范圍內(nèi)，每年有超過84.1萬的新發(fā)肝癌病例[1-2]。p38γ，又稱為SAPK3、ERK6，屬于MAPK家族成員[3-4]。其最初是從脂多糖刺激的單核細(xì)胞中分離得到，包括p38α、p38β、p38γ和p38δ四個(gè)亞型[5-6]。p38γ組織分布具有高度特異性,在骨骼肌中大量表達(dá)；并且其在腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、凋亡、轉(zhuǎn)移中，p38MARK發(fā)揮著重要作用。p38γ高度表達(dá)于幾種人類惡性腫瘤細(xì)胞系，并且可以調(diào)節(jié)腫瘤干細(xì)胞分化、遷移、腫瘤形成等生物過程。研究顯示，p38γ在人乳腺癌[7-8]、結(jié)腸癌[9]、直腸癌[10]及星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤組織[11]中高表達(dá)；特別是在三陰性乳腺癌組織中表達(dá)顯著增加，且其高表達(dá)和乳腺癌的不良預(yù)后呈正相關(guān)[12-13]。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2017年3月至2019年4月于我醫(yī)院收診的肝癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)免疫組化、病理切片及影像學(xué)確診為原發(fā)性肝癌；且患者既往未接受過手術(shù)、化療及靶向藥物治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他癌癥患者及精神疾病患者。所有患者均同意并簽署知情同意書。依據(jù)納入及排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究患者共270例，年齡24～74歲，平均年齡為53.1歲。收集患者的一般臨床資料：年齡、性別、腫瘤大小及病理分期。

1.2 蛋白免疫印記(Western-Blot)檢測(cè)P38γ蛋白表達(dá)

樣本組織用RIPA(含蛋白酶抑制劑)提取蛋白質(zhì)，再經(jīng)BCA法測(cè)定其蛋白濃度，確保Western-Blot所用蛋白量保持一樣。蛋白提取定量后進(jìn)行變性并SDS-PAGE電泳：12%分離膠+5%濃縮膠；電泳條件為80 V，30 min；150 v，1 h。電泳結(jié)束后進(jìn)行Western-Blot轉(zhuǎn)膜：轉(zhuǎn)膜條件為100 mA，1 h。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，1%脫脂牛奶封閉1 h；1‰TBST洗膜3次，加入一抗(抗P38γ或β-actin)孵育過夜；1‰TBST洗膜3次，加入二抗(1∶10 000)孵育2 h；1‰TBST洗膜3次，加入發(fā)光液顯影。蛋白表達(dá)量采用Image J軟件計(jì)算，并計(jì)算不同樣本蛋白表達(dá)的相對(duì)量。

1.3 P38γ干擾( Si-P38γ)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

Si-P38γ質(zhì)粒由漢恒生物構(gòu)建，經(jīng)轉(zhuǎn)化、搖菌、提質(zhì)粒后測(cè)序確定P38γ序列正確無誤。培養(yǎng)肝癌細(xì)胞Hep3B至密度為70%時(shí)，用lipo 3000轉(zhuǎn)染，培養(yǎng)觀察Si-P38γ對(duì)P38γ表達(dá)的影響：分別在12 h，24 h，36 h，48 h取蛋白樣品進(jìn)行Western-Blot分析。Hep3B細(xì)胞培養(yǎng)條件為：MEM培養(yǎng)基，10%胎牛血清，1%非必須氨基酸，37 ℃，5%CO2。

1.4 裸鼠皮下移植瘤

將Si-P38γ轉(zhuǎn)染Hep3B細(xì)胞36 h后，進(jìn)行裸鼠背部皮下注射，實(shí)驗(yàn)分2組：Si-P38γ組和Hep3B組，每只接種細(xì)胞數(shù)為1×106個(gè)細(xì)胞，觀察各組動(dòng)物成瘤細(xì)胞。接種后觀察腫瘤大小，25天后處死小鼠，取腫瘤并測(cè)量其大小和重量稱量。最后進(jìn)行腫瘤體積計(jì)算:V=長×寬×高×π/6。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 肝癌患者P38γ表達(dá)量增加

Western-Blot分析P38γ蛋白表達(dá)結(jié)果顯示：肝癌組織中P38γ表達(dá)量顯著高于正常組織，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)(圖1)。

圖1 P38γ蛋白表達(dá)檢測(cè)

2.2 Si-P38γ對(duì)P38γ表達(dá)的干擾效果

構(gòu)建P38γ干擾質(zhì)粒Si-P38γ將其轉(zhuǎn)染至Hep3B細(xì)胞，并經(jīng)Western-Blot分析P38γ蛋白水平發(fā)現(xiàn)：隨著干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染時(shí)間的增加，P38γ的表達(dá)量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)；并且，在第36 h時(shí)，P38γ基本沒有表達(dá)，見圖2。

圖2 Si-P38γ干擾P38γ蛋白表達(dá)

2.3 Si-P38γ干擾Hep3B裸鼠皮下成瘤情況

將Si-P38γ轉(zhuǎn)染Hep3B細(xì)胞36 h后，通過皮下注射至裸鼠，將裸鼠飼養(yǎng)至25天，觀察腫瘤形成情況并測(cè)量其大小。同時(shí)，以Hep3B細(xì)胞為對(duì)照組。結(jié)果顯示：Si-P38γ組腫瘤大小和成瘤數(shù)量均顯著小于 Hep3B組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.001)，見圖3。

圖3 Si-P38γ干擾Hep3B成瘤

2.4 P38γ蛋白高表達(dá)的臨床意義

270患者中，P38γ高表達(dá)患者116例，P38γ低表達(dá)患者81例。P38γ表達(dá)與患者年齡、性別無顯著相關(guān)性(P=0.465，P=0.732)。但是，在腫瘤體積方面，P38γ高表達(dá)組腫瘤體積顯著大于P38γ低表達(dá)組(P<0.001)；同時(shí)，在病理分級(jí)方面也具有顯著差異(P<0.001)，見表1。

表1 P38γ蛋白高表達(dá)的意義(例，%)

3 討論

近年來，由于肝炎疫苗接種以及環(huán)境因素的改變和營養(yǎng)條件的改變，年輕人群肝癌患者相對(duì)減少了約20%[1]但我國一直都是肝癌發(fā)病率最高的國家之一，肝癌在我國發(fā)病率第四，死亡率第二[14]。尤其是隨著經(jīng)濟(jì)條件的改善，中國人群飲酒量在呈現(xiàn)增長趨勢(shì)，導(dǎo)致酒精性肝病患者人數(shù)逐年增加，隨之因酒精而導(dǎo)致患肝癌人數(shù)也增加。盡管由于肝炎疫苗的接種，以及生活環(huán)境的改善，在一定程度上控制了肝癌的發(fā)生，但肝癌每年依然造成近80萬人死亡，對(duì)生命帶來致命威脅。肝癌患者的中位生存期一般僅為6～20個(gè)月。

研究結(jié)果顯示，肝癌患者肝組織中P38γ表達(dá)量顯著高于非腫瘤組織。因此，本研究構(gòu)建靶向P38γ的干擾質(zhì)粒：Si-P38γ；并且通過蛋白水平表達(dá)分析鑒定其對(duì)P38γ表達(dá)的干擾效果，結(jié)果顯示在Si-P38γ轉(zhuǎn)染36小時(shí)后，Si-P38γ基本不再表達(dá)?；诖?，本研究成功構(gòu)建了P38γ的干擾質(zhì)粒：Si-P38γ，并且在Hep3B細(xì)胞中證明了其具有干擾效果。進(jìn)一步，本研究又分析了Si-P38γ對(duì)Hep3B細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)成瘤的影響，結(jié)果顯示Si-P38γ干擾后影響了Hep3B的成瘤效果，其成瘤數(shù)和腫瘤大小均顯著減少。

肝癌患者的中位生存期一般僅為6～20個(gè)月，目前針對(duì)肝癌早期患者，可以進(jìn)行肝移植讓患者的生存期相對(duì)延長。但是肝癌患者早期檢出率較低，而晚期肝癌患者的治療手段主要為靶向治療、化療等，但目前上市的靶向治療藥效果并不理想。

本研究結(jié)果顯示下調(diào)P38γ的表達(dá)量，可以顯著影響腫瘤的形成以及腫瘤大小。提示我們P38γ有望成為一個(gè)新的治療肝癌的靶點(diǎn)分子。但是，P38γ對(duì)肝癌的作用機(jī)制尚需進(jìn)一步探索。