卵巢癌組織中SSBP1的表達意義及作用

苗 麗 王 棟 馬 莉 康安靜 張 潔

卵巢癌(ovarian cancer)是嚴重威脅女性健康的常見惡性腫瘤之一，與其他婦科腫瘤相比，卵巢癌死亡率最高，術后晚期患者的五年生存率不足30%[1]。近年來靶向藥物的應用為腫瘤治療提供了新思路。

Warburg 效應在腫瘤發(fā)生及進展中具有關鍵作用，其調控機制研究一直是腫瘤領域的熱點問題[2]。Warburg效應重要特點就是線粒體氧化磷酸化減弱及糖酵解顯著增強。作為真核細胞中唯一具有獨立基因組的細胞器，線粒體在能量代謝、鈣穩(wěn)態(tài)調節(jié)、活性氧產生和凋亡調控等細胞生理過程中發(fā)揮著重要作用。線粒體數量和功能異常參與了包括腫瘤在內的多種人類疾病的發(fā)生與進展。例如研究表明，線粒體DNA拷貝數異常與肝癌、結直腸癌和膠質瘤等腫瘤發(fā)病風險和生存顯著相關[3-4]。但關于腫瘤中線粒體DNA復制及線粒體拷貝數增加的具體誘因及機制尚不明確。線粒體單聯(lián)DNA結合蛋白(SSBP1，又稱mtSSB)具有促進線粒體DNA復制和損傷修復進而調控線粒體生成的重要作用[5]。近年來，SSBP1在腫瘤中作用受到越來越多的關注。本研究通過從SSBP1在卵巢癌組織中的表達變化入手，通過從TCGA數據庫中選取正常卵巢及卵巢癌組織的轉錄組數據，利用Kaplan-Meier模型分析SSBP1與患者生存情況，并進一步研究SSBP1對卵巢細胞惡增殖的影響，以期為闡明SSBP1在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用提供思路和線索。

1 材料與方法

1.1 數據來源

從TCGA 數據庫(https：//tcgadata.nci.nih.gov/tcga/)下載正常卵巢組織轉錄組數據97例以及有預后信息的373例卵巢癌數據集(年齡30～87歲，中位年齡59歲)；并利用Bioconductor/TCGAbiolinks 函數包提取mRNA表達RNASEqV2數據。基因的表達量由Fregments Per Kilobase per Million(FPKM)表示。計算方法為FPKM=106×nf/L/N。nf是比對至目標基因的片段(fragment)數量、L是目標基因的外顯子長度之和除以1000(L單位為kb)、N 是總有效比對至基因組的讀取次數(read數量)。

1.2 細胞培養(yǎng)及轉染

人卵巢癌細胞SKOV-3購于ATCC細胞庫，細胞采用含10%胎牛血清(四季青生物)的RPMI-1640培養(yǎng)基(上海生工生物)培養(yǎng)，培養(yǎng)箱含5%濃度的CO2，溫度設定為37 ℃。

取對數期卵巢癌細胞系SKOV-3，胰蛋白酶消化后用無雙抗 10﹪血清培養(yǎng)液制成細胞懸液，接種到35 mm培養(yǎng)皿并培養(yǎng)至70%匯合率，進行轉染。取出培養(yǎng)皿，吸去培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液，并每皿加入DMEM培養(yǎng)液約0.5 ml重復沖洗細胞兩遍，而后每皿加入 DMEM 培養(yǎng)液1.5 ml，轉染復合物混合液0.5 ml。 輕輕混勻，放入37 ℃、5% CO2孵育箱中培養(yǎng)6 h左右后更換培養(yǎng)基。用G418篩選穩(wěn)定細胞株。

1.3 Western Blot

首先，用RIPA蛋白裂解液裂解卵巢癌細胞并提取細胞總蛋白，BAC法對蛋白濃度進行測定后加入2×上樣緩沖液并置于沸水中煮沸5 min。隨后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，并用濕轉法將凝膠中蛋白轉印至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后，分別加入用封閉液稀釋過的SSBP1與actin抗體于4 ℃反應過夜，TPBS洗膜3次后加入二抗并在室溫下繼續(xù)反應1.5 h，繼續(xù)用TPBS洗膜3次后用化學發(fā)光法對最終條帶進行檢測。

1.4 線粒體定量

去除細胞培養(yǎng)液，加入配制好的并37 ℃預溫育的Mito-Tracker Red染色工作液，與細胞37 ℃共孵育15 min。 去除Mito-Tracker Red染色工作液，加入37 ℃預溫育的新鮮細胞培養(yǎng)液。隨后通常用熒光顯微鏡進行觀察分析。

1.5 乳酸及氧氣消耗定量

依照索萊寶乳酸定量試劑盒(貨號：BC2235)方法：收集5×106個細胞加入1 ml提取液，冰浴超聲波破碎細胞(功率300 w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3 min)，隨后4 ℃條件下12 000 g離心10 min取上清應用試劑盒測定。細胞氧耗檢測采用氧電極法(Strathkelvin)，信號采集間隔時間為0.5秒。

1.6 統(tǒng)計方法

應用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件進行數據分析。生存分析采用Kaplan-Meier法。為了選擇最佳FPKM截斷值(Best FPKM cut-offs)對患者進行最顯著分組，本研究使用所有處于20～80%的FPKM值對患者進行分組，檢查各組生存率的差異，并選擇產生最低log-rankP值的分組方式。利用Person函數對兩個變量之間的相關性開展分析。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 SSBP1在卵巢癌中的表達

TCGA數據集中正常卵巢組織中SSBP1的表達量最高為33.8 FPKM，最低為18.4 FPKM，平均數為26.5 FPKM。而在卵巢癌組織中SSBP1的表達量最高為58.2 FPKM，最低為5.3 FPKM，平均數為17.5 FPKM。統(tǒng)計分析可見，腫瘤組織中SSBP1表達水平顯著低于正常卵巢組織(P<0.001)，見圖1。

圖1 SSBP1在正常卵巢組織及卵巢癌組織中的表達分析

2.2 SSBP1表達水平與卵巢癌患者預后

利用373卵巢癌患者的轉錄組測序及預后數據的進行Kaplan-Meier Plotter生存分析得出，低表達SSBP1患者的預后顯著差于高表達患者(P<0.05，圖2)。進而提示，腫瘤組織中高水平的SSBP1是預后良好因素，低表達或不表達與患者生存期縮短顯著相關。

圖2 SSBP1表達水平與卵巢癌患者預后

2.3 SSBP1過表達對細胞糖代謝能力的影響

進一步研究發(fā)現，在卵巢癌細胞SKOV-3中穩(wěn)定過表達SSBP1(圖3A)可顯著增加線粒體含量及細胞氧耗速率(圖3B和3C)，抑制糖酵解(3D),提示卵巢癌細胞中SSBP1的降低可促進糖酵解、抑制線粒體氧化磷酸化，進而促進Warburg效應。

圖3 SSBP1過表達對細胞糖代謝能力的影響

2.4 SSBP1過表達對卵巢癌細胞生長的影響

如圖4所示，過表達SSBP1可顯著抑制結卵巢癌細胞的生長，提示腫瘤內低表達SSBP1與較較差預后可能存在因果關系。

圖4 SSBP1過表達對卵巢癌細胞生長的影響

3 討論

mtSSBP1在線粒體DNA(mtDNA)的復制、轉錄及修復過程發(fā)揮關鍵作用。因此，mtSSBP1突變或表達失調將導致mtDNA發(fā)生基因突變，最終可能會導致腫瘤的發(fā)生。在本研究中，我們首次發(fā)現了SSBP1在卵巢癌組織中的表達顯著低于正常卵巢組織，且腫瘤組織中低表達SSBP1的患者預后顯著差與高表達組患者。與之類似，Li等發(fā)現SSBP1基因多態(tài)性(rs6976500G)可顯著降低SSBP1的轉錄活性及表達水平，進而與胃癌的不良預后顯著相關[6]。進一步Jiang等研究發(fā)現，三陰性乳腺癌組織中SSBP1的表達下調可通過“線粒體-核交互信號通路”激活上皮-間質轉換(EMT)過程，繼而促進腫瘤細胞的轉移[7]。Wang等發(fā)現在非小細胞肺癌中SSBP1表達下降、mtDNA拷貝數降低，并導致腫瘤細胞的放療敏感性升高[5]。此外，Ye等還利用蛋白質印跡及免疫組化等方法對20例肝癌組織的進行分析發(fā)現，與對照組相比，SSBP1在腫瘤組織中表達異常上調，推測可能是由于mtSSBP1蛋白不能正確折疊而導致其在細胞中的異常累積，并可能造成了mtDNA的復制障礙及突變[8]。以上研究結果都提示SSBP1的表達異?？赏ㄟ^抑制mtDNA復制及線粒體正常功能，進而促進腫瘤的發(fā)生進展。

正常細胞通過線粒體氧化磷酸化產生ATP 提供能量，而腫瘤細胞則表現出了不同的能量代謝方式。因此，糖代謝重編程是腫瘤細胞的一個重要特征，其與腫瘤的發(fā)生發(fā)展互為因果。早在上個世紀，德國生理學家Otto.Warburg就提出了著名的Warburg效應：相比于正常細胞，腫瘤細胞糖酵解顯著增強，線粒體氧化磷酸化降低來滿足快速生長的需求[9]。在很長一段時間內，科研工作者一直認為腫瘤細胞有氧呼吸存在不同程度的損傷，即線粒體功能的不可逆性損傷是所有腫瘤的共同起因。然而，進來越來越多的研究表明絕大部分腫瘤細胞中線粒體數目下降。在本研究中我們發(fā)現SSBP1的表達下調可減少線粒體數目，并促使卵巢癌細胞糖酵解與增殖能力的增強。與之相類似，Huang等發(fā)現肝癌中高表達的CD147分子可通過抑制p53通路下調線粒體生物生成的關鍵調控分子PGC-1α、TFAM等進而導致腫瘤細胞線粒體數目減少，與腫瘤細胞的增殖[10]。

上述研究結果提示，線粒體數目有望成為1種新型標志物用于卵巢癌患者預后評估及藥物治療靶點。