低氧對(duì)惡性黑素瘤A375細(xì)胞中Nodal及細(xì)胞遷移相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

王艷云 高明敏 姚 麗 張永紅

惡性黑色素瘤是黑色素細(xì)胞發(fā)生的惡性腫瘤，以中老年人為主要發(fā)病對(duì)象，隨著年齡增加發(fā)生率有升高趨勢(shì)[1-3]，目前惡性黑色素瘤的治療仍然以外科手術(shù)為主，但是術(shù)后多需要進(jìn)行配合化療以延長(zhǎng)患者生存率。Nodal是1種胚胎成形素，是轉(zhuǎn)化因子β超家族成員之一，其與細(xì)胞的分化、增殖等有關(guān)，而且也與腫瘤發(fā)生、血管形成、損傷修復(fù)等有關(guān)[4-6]。惡性黑色素瘤的生長(zhǎng)環(huán)境具有低氧的特點(diǎn)，因此，本研究對(duì)低氧對(duì)惡性黑素瘤A375細(xì)胞中Nodal及細(xì)胞遷移相關(guān)蛋白表達(dá)的影響進(jìn)行了研究，以嘗試分析惡性黑素瘤A375細(xì)胞內(nèi)低氧的環(huán)境中Nodal及細(xì)胞遷移相關(guān)蛋白表達(dá)情況，現(xiàn)將相關(guān)研究結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源

人惡性黑色素瘤細(xì)胞株A375細(xì)胞來(lái)源于北京中科院科研中心，SB-431542及氯化鈷(CoCl2)均來(lái)源與美國(guó) Sigma公司，人抗鼠 Vimentin抗體、人抗鼠Nodal抗體、人抗鼠 ALK7抗體均來(lái)源于美國(guó) Santa Cruz公司，人抗鼠 MMP2抗體來(lái)源于英國(guó) Abcam公司。HRP標(biāo)記羊抗兔 IgG來(lái)源于美國(guó) Bioworld公司，HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgG來(lái)源于美國(guó) Bio-world公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)方法及低氧環(huán)境的設(shè)置 將冷凍儲(chǔ)存的A375細(xì)胞復(fù)蘇后置于含有10%FBS的完全培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：溫度37 ℃，5%CO2，恒溫細(xì)胞孵育箱內(nèi)孵育培養(yǎng)。每間隔24 h換培養(yǎng)液1次，在顯微鏡下觀察到培養(yǎng)的細(xì)胞已在培養(yǎng)基內(nèi)布滿80%面積后加入0.25%胰蛋白酶消化，后在離心機(jī)內(nèi)以3 000 r/min轉(zhuǎn)速、4 ℃溫度條件下離心，然后按照1∶2進(jìn)行傳代培養(yǎng)。參考相關(guān)文獻(xiàn)的方法[7]，以CoCl2誘導(dǎo)構(gòu)建A375細(xì)胞內(nèi)的低氧環(huán)境。

1.2.2 SB-431542阻斷Nodal信號(hào)通路的方法 在A375細(xì)胞培養(yǎng)到3～8代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行SB-431542阻斷，取5 μmol/l、10 μmol/l、20 μmol/l、30 μmol/l、40 μmol/l濃度的SB-431542母液，后在96孔板內(nèi)每孔接種5×103個(gè)細(xì)胞后進(jìn)一步培養(yǎng)12 h，在細(xì)胞貼壁后將不同濃度的SB-431542母液分組加入，每組為5個(gè)復(fù)孔，加入SB-431542母液后溫度37 ℃、5%CO2的條件下進(jìn)一步孵育培養(yǎng)直至72 h，分別觀察24 h、48 h、72 h時(shí)的阻斷結(jié)果。

1.2.3 A375細(xì)胞增殖的影響檢測(cè)方法 以MTT法繼續(xù)檢測(cè)SB-431542對(duì)A375細(xì)胞增殖活力的影響，在 SB-431542阻斷A375細(xì)胞增殖后，在每孔加入MTT溶液20 μl，加入時(shí)避光，然后繼續(xù)培養(yǎng)4 h，將培養(yǎng)液吸除后加入150 μl的DMSO，震蕩10 min，將晶體充分溶解，然后用波長(zhǎng)為490的酶聯(lián)儀對(duì)每孔的吸光度值(OD)進(jìn)行測(cè)定。

1.2.4 遷移相關(guān)蛋白表達(dá)的檢測(cè)方法 以Western Blot方法檢測(cè)相關(guān)蛋白水平。A375細(xì)胞放置于6孔板內(nèi)，每孔A375細(xì)胞個(gè)數(shù)為5×105個(gè)，培養(yǎng)之貼壁，吸除培養(yǎng)液，設(shè)置空白對(duì)照組、CoCl2組、SB-431542阻斷組和CoCl2+SB-431542組，每組為6孔，根據(jù)設(shè)置條件分別進(jìn)行相應(yīng)的干預(yù)，以BCA法計(jì)算蛋白濃度，然后加入SDS-PAGE電泳及目標(biāo)蛋白，通過(guò)轉(zhuǎn) PVDF膜及5%的脫脂牛奶溫室封閉等處理，最后加入目標(biāo)一抗蛋白，在4 ℃下孵育過(guò)夜，隔日進(jìn)行洗膜后加入目標(biāo)蛋白二抗然后在25 ℃下孵育1 h 30 min，最后采取ECL法顯影后對(duì)目標(biāo)蛋白表達(dá)水平采用Image Lab軟件測(cè)定分析表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 不同濃度SB-431542在不同時(shí)點(diǎn)對(duì)A375細(xì)胞增殖的阻斷結(jié)果

不同濃度的SB-431542阻斷A375細(xì)胞Nodal信號(hào)通路后細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯改變，以上不同濃度阻斷24 h、48 h、72 h時(shí)A375細(xì)胞增殖活力比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=152.39，P<0.05)，隨著時(shí)間增加細(xì)胞活力明顯增強(qiáng)，但是隨著濃度增加，細(xì)胞活力隨之下降，SB-431542對(duì)A375細(xì)胞增殖的阻斷具有劑量和時(shí)間依賴性，見表1。SB-431542濃度為 10 μmol/l阻斷A375細(xì)胞后繼續(xù)培養(yǎng)48 h時(shí)細(xì)胞增殖活力低的同時(shí)毒性也降低，因此本研究后續(xù)相關(guān)研究中SB-431542阻斷A375細(xì)胞的濃度和時(shí)間均選擇此條件下進(jìn)行相關(guān)研究。

表1 不同濃度SB-431542在不同時(shí)點(diǎn)對(duì)A375細(xì)胞Nodal信號(hào)通路阻斷結(jié)果

2.2 各組不同條件下Nodal及細(xì)胞遷移相關(guān)蛋白表達(dá)

各組Nodal、MMP2、ALK7、Vimentin的表達(dá)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=44.283、111.481、104.34、92.647，P<0.05)，CoCl2組A375細(xì)胞內(nèi) Nodal、MMP2、ALK7、Vimentin的表達(dá)均較空白對(duì)照組上調(diào)(t=10.410、21.127、43.274、/10.125，P<0.05)，與CoCl2組比較SB-431542阻斷組、CoCl2+SB-431542組表現(xiàn)為以上蛋白表達(dá)下調(diào)(SB-431542阻斷組:t=24.374、20.928、40.291、10.765，CoCl2+SB-431542組:t=15.319、7.259、6.306、4.718，P<0.05)，見表2。

表2 各組不同條件下Nodal及細(xì)胞遷移相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量

3 討論

惡性黑色素瘤的發(fā)生發(fā)展是1個(gè)多因素參與的復(fù)雜過(guò)程，其機(jī)制仍然不是很清楚[8-10]，但是研究顯示，惡性腫瘤的發(fā)生及發(fā)展與胚胎發(fā)育過(guò)程有一定的相關(guān)性。Nodal作為轉(zhuǎn)化因子β超家族成員之一，研究顯示Nodal可誘導(dǎo)干細(xì)胞的分化及參與到原始胚層的形成等途徑[6]，在胚胎的不同發(fā)育時(shí)期Nodal信號(hào)均對(duì)其進(jìn)行調(diào)控，隨著胚胎的發(fā)育，除了在胎盤、卵巢上皮、子宮內(nèi)膜等生殖系統(tǒng)，Nodal作為“胚胎信號(hào)”會(huì)逐漸關(guān)閉，但是有研究發(fā)現(xiàn)在子宮內(nèi)膜癌、膽囊癌、惡性黑色素瘤等惡性腫瘤中也能檢測(cè)到Nodal表達(dá)通道被再次重啟[11-13]，研究證實(shí)在以上惡性腫瘤組織中可檢測(cè)到Nodal的表達(dá)上調(diào)，同時(shí)還與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)。

腫瘤組織內(nèi)除了腫瘤組織外還有成纖維細(xì)胞、免疫細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞等，共同構(gòu)成了惡性腫瘤的微環(huán)境，但是這種微環(huán)境并不是固定不變化的，低氧環(huán)境是大多數(shù)實(shí)體瘤生存不可缺少的條件，大多數(shù)的惡性腫瘤在低氧環(huán)境中可以生存。MMP2是基質(zhì)金屬蛋白基因家族成員之一，研究發(fā)現(xiàn)與抑制細(xì)胞遷移密切相關(guān)[14-15]，對(duì)腫瘤血管有促進(jìn)新生血管生成作用。Nodal的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)由位于細(xì)胞膜上的Ⅰ型受體(ALKs)和Ⅱ型受體(ActRII)介導(dǎo)，因此ALK7是Nodal信號(hào)通路中主要的受體靶點(diǎn)，研究顯示，ALK7的阻斷可阻斷Nodal信號(hào)通路[16]。Vimentin屬于Ⅲ型中間絲，中間絲又是細(xì)胞結(jié)構(gòu)的主要組成部分，研究顯示[17-18]Vimentin在侵襲性的惡性腫瘤中表達(dá)會(huì)明顯升高，而且與腫瘤的轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)，對(duì)細(xì)胞的凋亡過(guò)程也有影響。在惡性黑色素瘤患者的腫瘤組織中，Nodal及其相關(guān)蛋白的表達(dá)是升高的[19]，以上相關(guān)蛋白也與惡性黑色素瘤的轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)[20-23]。

惡性黑色素瘤普遍分化程度較低，相對(duì)于高分化惡性腫瘤，惡性黑色素瘤更容易處于低氧的微環(huán)境狀態(tài)，因此，本研究對(duì)低氧狀態(tài)下對(duì)惡性黑素瘤A375細(xì)胞中Nodal及細(xì)胞遷移相關(guān)蛋白表達(dá)進(jìn)行了研究，采取CoCl2構(gòu)建低氧環(huán)境模型，以SB-431542作為阻斷Nodal信號(hào)通路的阻斷劑，觀察了最終Nodal及細(xì)胞遷移相關(guān)蛋白表達(dá)的變化，結(jié)果顯示低氧環(huán)境下Nodal及MMP2、ALK7、Vimentin表達(dá)均出現(xiàn)上調(diào)現(xiàn)象，表明低氧環(huán)境可促使惡性黑色素瘤A375細(xì)胞中Nodal的誘導(dǎo)進(jìn)一步表達(dá)，而且遷移相關(guān)蛋白MMP2、ALK7、Vimentin也可能參與了腫瘤的轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散。同時(shí)，以SB-431542作為阻斷Nodal信號(hào)通路的阻斷劑，Nodal信號(hào)通路被不同程度阻斷，A375細(xì)胞增殖出現(xiàn)不同程度抑制，研究表明，SB-431542可抑制惡性黑色素瘤A375細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移。分析A375細(xì)胞在低氧環(huán)境下加入SB-431542，雖然將單純低氧環(huán)境時(shí)以上蛋白水平表達(dá)有所下調(diào)，但是相對(duì)于未經(jīng)處理的空白對(duì)照組細(xì)胞，MMP2、ALK7、Vimentin的表達(dá)仍然高于空白對(duì)照組細(xì)胞，表明低氧環(huán)境下的A375細(xì)胞即使采取SB-431542阻斷，仍然存在一定程度的增殖、侵襲和遷移能力，低氧是A375細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的主要條件。

綜上所述，低氧環(huán)境可誘導(dǎo)惡性黑色素瘤A375細(xì)胞中Nodal及MMP2和Vimentin的表達(dá)上調(diào)，這可能與A375細(xì)胞的遷移和侵襲惡化有關(guān)，同時(shí)通過(guò)SB-431542可阻斷細(xì)胞增殖的Nodal信號(hào)通路。