UPLC-MS/MS 法同時(shí)檢測(cè)人血清中5 種微量?jī)?nèi)源性激素*

楊 娜，劉紫薇，王 敏，朱懷軍，葛衛(wèi)紅**

1 南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院藥學(xué)部，南京 210008；2 中國(guó)藥科大學(xué)，南京 210009

性激素檢測(cè)是臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)項(xiàng)目中公認(rèn)的難題，主要原因是其在血液中含量極低（通常在pmol·L-1水平）[1]，且結(jié)構(gòu)類似物眾多[2]，因此對(duì)方法的敏感度和特異度要求很高。在現(xiàn)階段臨床檢測(cè)中免疫法多用于性激素的檢測(cè)；但由于其易受其他內(nèi)源性類固醇、脂質(zhì)和基質(zhì)效應(yīng)的干擾，對(duì)血清中微量性激素測(cè)定的特異性和可靠性仍然存在疑惑。

在性激素檢測(cè)中，雄激素、孕激素的檢測(cè)對(duì)于臨床包括多囊卵巢綜合征[3]、不孕癥[4]、高雄激素血癥[5]等諸多疾病的診斷具有重要意義。然而，在臨床研究中發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)免疫法用于高雄激素血癥的差錯(cuò)率可高達(dá)1/3[3]。而質(zhì)譜法由于其高靈敏度和特異性的優(yōu)點(diǎn)，檢測(cè)具有較高的準(zhǔn)確性。本研究旨在建立快速、靈敏度高、穩(wěn)定性好的UPLC-MS/MS 分析方法，用于同時(shí)檢測(cè)人血清中包括睪酮（testosterone，T）、雄烯二酮（androstenedione，AD）、脫氫表雄酮（dehydroepiandrosterone，DHEA）、孕酮（progesterone，P）和17α-羥孕酮（17-α-hydoxy progesterone，17α-OHP）等在內(nèi)的5 種內(nèi)源性激素。本方法為臨床血清樣本的檢測(cè)及相關(guān)疾病的診斷和研究提供了技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 藥品與試劑 孕酮（P，純度99.7%，批號(hào)：G130207）、17α-羥孕酮（17α-OHP，純度99.5%，批號(hào)：G986202）、睪酮（T，純度99.2%，批號(hào)：G157843）、雄烯二酮（AD，純度99.3%，批號(hào)：G158946），均為德國(guó)DR.E 公司產(chǎn)品；脫氫表雄酮（DHEA，純度99.9%，批號(hào)：00004099-176,美國(guó)ChromaDex）；孕酮-d9[Pd9（IS），內(nèi)標(biāo)，純度98%，批號(hào)：8-GBH-69-3，加拿大TRC 公司]；鹽酸羥胺（純度99%，上海麥克林生化科技有限公司）；叔丁基甲醚（阿拉丁公司）；甲醇、乙腈（色譜純，德國(guó)Merck 公司）；純化水。

1.1.2 主要儀器 ACQUITY UPLC I-Class/XEVO TQD 超高效液相質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)Waters 公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件 Agilent ZORBAX Eclipse Plus Phenyl-Hexyl 色譜柱（2.1 mm×100 mm，3.5 μm）；流動(dòng)相：水相（A）：0.1%甲酸水，有機(jī)相（B）：乙腈（梯度洗脫程序：0.0～0.5min，40%B；0.5～3.0 min，40%～90%B；3.0～3.1 min，90%～40%B；3.1～5.0 min，40%B）；柱溫：40 ℃；流速：0.3 mL·min-1；整個(gè)運(yùn)行時(shí)間：5 min；進(jìn)樣體積5 μL。

1.2.2 質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧離子源（ESI）；正離子模式掃描；多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；毛細(xì)管電壓為3.5 kV；脫溶劑氣為氮?dú)?，脫溶劑溫度?00 ℃，脫溶劑氣流速為850 L·h-1；錐孔氣流速為50 L·h-1；離子源溫度為150 ℃；碰撞氣為氬氣；儀器工作站為MassLynx（version4.1）。各種相關(guān)離子見表1。

表1 MRM 模式離子參數(shù)

1.2.3 儲(chǔ)備液和標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 分別精密稱取T、AD、DHEA、P、17α-OHP 對(duì)照品和同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)P-d9（IS）粉末2 mg，置于10 mL 量瓶中，加入甲醇定容至刻度，顛倒搖勻配制成終濃度為200 μg·mL-1的儲(chǔ)備液，-20 ℃儲(chǔ)存。分別取各類激素儲(chǔ)備液，依次用甲醇梯度稀釋，分別配制成濃度為0.5、1、2、5、10、20、50、100、200、500、1000 ng·mL-1的激素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。取內(nèi)標(biāo)P-d9儲(chǔ)備液，用甲醇溶液逐級(jí)稀釋至10 ng·mL-1的內(nèi)標(biāo)溶液。

鹽酸羥胺溶液的配制：精密稱取鹽酸羥胺適量，采用50%甲醇-水溶液（v/v），配制成濃度為100 mmol·L-1的鹽酸羥胺溶液，置于-20 ℃儲(chǔ)存。

1.2.4 空白血清的制備 取空白血清50 mL，按1%比例加入葡聚糖-活性炭，于37 ℃搖床振搖5 h 后4000 r·min-1離心15 min，得上清液于12000 r·min-1低溫超速離心20min，取上層澄清液，即為空白血清。

1.2.5 血清樣品的處理方法 取300 μL 血清樣本，加入20 μL P-d9內(nèi)標(biāo)溶液（10 ng·mL-1）混勻，加入1.5 mL 甲基叔丁基醚溶液渦旋振蕩10 min，并在4 ℃下12000 r·min-1離心5 min，轉(zhuǎn)移上層有機(jī)相1.2 mL于真空濃縮裝置中，40 ℃揮干。加入100 μL 鹽酸羥胺溶液（100 mmol·L-1）于60 ℃水浴加熱30 min 作衍生化。取出在冰浴靜置，在4 ℃下12000 r·min-1離心5 min，轉(zhuǎn)移上清液于進(jìn)樣瓶中，以5 μL 進(jìn)樣分析。

2 結(jié)果

2.1 分析方法優(yōu)化

2.1.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化 采用濃度為200 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行衍生化后，對(duì)T、AD、DHEA、P、17α-OHP 及內(nèi)標(biāo)的母離子、子離子、錐孔電壓和碰撞能量進(jìn)行逐一優(yōu)化和確認(rèn)，得到最佳的錐孔電壓和碰撞能量。見表1。

通過對(duì)比峰強(qiáng)度，對(duì)離子源溫度、脫溶劑氣流量等進(jìn)行逐步優(yōu)化，使目標(biāo)化合物具有最高靈敏度。5 種激素經(jīng)衍生化處理后，極大提高了離子化效率，當(dāng)進(jìn)入質(zhì)譜均能產(chǎn)生響應(yīng)強(qiáng)度高且穩(wěn)定性好的[M+H]+分子離子峰。

2.1.2 液相條件優(yōu)化 分別采用甲醇和乙腈為有機(jī)相，進(jìn)行梯度或等度洗脫條件的摸索，并對(duì)不同色譜柱的峰形進(jìn)行對(duì)比考察。結(jié)果顯示，以“1.2.1”色譜條件進(jìn)行梯度洗脫，5 種激素和內(nèi)標(biāo)均顯示良好的峰形，且具有較高靈敏度。本法在UPLC 液相系統(tǒng)下，分析時(shí)間為5 min，能夠快速高效地分析目標(biāo)雄激素和孕激素，達(dá)到較好的效果。

2.1.3 樣品處理優(yōu)化 采用葡聚糖-活性炭法能夠高效去除人血清中內(nèi)源性雌激素的干擾。血清樣本前處理摸索試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)蛋白沉淀法雜質(zhì)干擾多，基質(zhì)效應(yīng)較高。液-液萃取法中叔丁基甲醚萃取法具有較好的提取回收率，目標(biāo)激素的提取回收率變異均能控制在15%以內(nèi)，并能保證較低的基質(zhì)干擾。此外，本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)衍生化的溫度、時(shí)間、試劑濃度等進(jìn)行優(yōu)化，得到了理想的衍生化條件。

2.2 方法學(xué)驗(yàn)證

2.2.1 特異性 按“1.2.5”項(xiàng)下方法處理空白血清樣本和加入各類激素對(duì)照品血清樣本，如圖1 所示。T、AD、DHEA、P、17α-OHP 和IS 的保留時(shí)間分別為2.04、1.99、1.92、2.55、1.98 和2.53 min。

圖1 UPLC-MS/MS 測(cè)定各激素及內(nèi)標(biāo)的典型色譜圖

各待測(cè)物和內(nèi)標(biāo)峰形良好，空白血清在各激素離子通道下無干擾，各激素在該方法下特異性良好。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量下限 取空白血清270 μL，分別加入含T、AD、DHEA、P、17α-OHP 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液30 μL，使其血清中濃度分別為0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100 ng·mL-1，每個(gè)濃度3 個(gè)樣本。按“1.2.5”項(xiàng)下方法處理樣本，以檢測(cè)目標(biāo)激素峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)Y，血清中各激素濃度為橫坐標(biāo)X（pg·mL-1），用加權(quán)最小二乘法計(jì)算回歸方程（權(quán)重1/X）。得到各激素的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：T，Y=5.3×10-3X+0.13（r=0.9998）；AD，Y=2.9×10-3X+0.081（r=0.9996）；DHEA，Y=5.0×10-4X+0.029（r=0.9994）；P，Y=1.7×10-3X-0.0085（r=0.9991）；17α-OHP，Y=1.3×10-3X+0.013（r=0.9998）。

各激素在0.05～100 ng·mL-1范圍內(nèi)具有良好的線性，定量下限（LLOQ）均為50 pg·mL-1（S/N>10）。

2.2.3 精密度和準(zhǔn)確度 取空白血清分別配制3 批含LLOQ，低、中、高濃度（0.05、0.1、2、80 ng·mL-1）的混合激素的血清樣品，每個(gè)濃度平行6 份，按照“1.2.5”項(xiàng)下方法處理樣本，分3 天連續(xù)檢測(cè)，計(jì)算日內(nèi)與日間精密度、準(zhǔn)確度。由結(jié)果可知，精密度（RSD）與準(zhǔn)確度（RE）均在15%以內(nèi)，符合生物樣本測(cè)定要求。見表2。

表2 精密度和準(zhǔn)確度（n=6）

2.2.4 提取回收率和基質(zhì)效應(yīng) 配制含有終濃度為0.1、2、80 ng·mL-1混合激素的血清樣本各6 份，按“1.2.5”項(xiàng)下方法處理血清樣本，記錄各激素峰面積A1和內(nèi)標(biāo)峰面積AIS1。另取空白血清，經(jīng)甲基叔丁基醚萃取后、加入各激素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液，處理后測(cè)得各激素峰面積A2和內(nèi)標(biāo)峰面積AIS2。取各激素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液加入內(nèi)標(biāo)溶液后處理進(jìn)樣，測(cè)得各類激素的峰面積A3和內(nèi)標(biāo)峰面積AIS3。計(jì)算峰面積比值：f1=A1/AIS1，f2=A2/AIS2，求得同一濃度樣本的比值平均值（f2）mean。計(jì)算相對(duì)提取回收率=f1/（f2）mean，并計(jì)算內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)因子=（A2/A3）/（AIS2/AIS3）及其RSD（%），結(jié)果見表3。

在5 種激素低、中、高濃度水平下，平均提取回收率在78.7%～106.8%，歸一化基質(zhì)因子在94.2～114.9。相對(duì)提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)因子的RSD均＜15%，符合生物樣本定量分析要求。

2.2.5 穩(wěn)定性 配制5 種激素低、中、高濃度（0.1、2、80 ng·mL-1）的血清樣本，分別置于室溫24 h、4 ℃自動(dòng)進(jìn)樣盤放置24 h、反復(fù)凍融3 次、-70 ℃冷凍保存1 個(gè)月，每種處置方式每個(gè)濃度平行6 份，比較測(cè)定樣本的精密度和準(zhǔn)確度。結(jié)果顯示，低、中、高濃度的精密度（RSD）和準(zhǔn)確度（RE）均在±15%內(nèi)，符合生物樣本測(cè)定要求。

表3 提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)（n=6）

2.2.6 實(shí)際血清樣本分析 采用已建立的分析方法，對(duì)5 份血清樣本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見表4。

表4 血清樣本的測(cè)定（ng·mL-1）

其中1、2 號(hào)樣本為2 名懷孕女性，年齡分別為29、31 歲；3～5 號(hào)樣本為3 名男性，年齡為24～36歲。由表4 可見，5 份血清樣本中均可檢測(cè)出不同濃度的T、AD、DHEA、P、17α-OHP，且存在明顯個(gè)體差異。以上表明，本方法適用于臨床血清樣本中關(guān)鍵雄激素和孕激素的同時(shí)測(cè)定。

3 討論

相比于免疫法，質(zhì)譜法用于類固醇激素的測(cè)定具有很大優(yōu)勢(shì)。自20 世紀(jì)70 年代以來，質(zhì)譜法被逐漸運(yùn)用到類固醇激素的測(cè)定中[6]。其中，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法在激素測(cè)定領(lǐng)域的發(fā)展比液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法更早[7]。研究證明，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法具有更高的選擇性、靈敏度以及更加簡(jiǎn)單的前處理過程。然而，由于類固醇激素的結(jié)構(gòu)特性，其在質(zhì)譜中的離子化效率很低，常采用衍生化技術(shù)對(duì)其結(jié)構(gòu)中的羥基、羰基等基團(tuán)進(jìn)行衍生化處理，以提高其在質(zhì)譜中的離子化效率。其中，酰化衍生化常用于雌激素的測(cè)定[8]。

本研究通過鹽酸羥胺肟化處理，極大增加了T、AD、DHEA、P、17α-OHP 在質(zhì)譜中的離子化效率。該方法測(cè)定時(shí)間短（5 min），可同時(shí)定量5 種目標(biāo)激素，且均為臨床檢測(cè)中用于腎上腺皮質(zhì)增生、生殖功能障礙、高雄激素血癥等疾病的關(guān)鍵檢測(cè)品種，故本方法具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。

研究表明，包含雌激素、孕激素和雄激素的性激素代謝網(wǎng)絡(luò)是一個(gè)緊密關(guān)聯(lián)的整體，以膽固醇為前體，首先經(jīng)側(cè)鏈縮短生成21 碳的孕激素，進(jìn)一步去側(cè)鏈代謝為19 碳的雄激素，再通過A 環(huán)芳香化生成18 碳雌激素。在腎上腺皮質(zhì)功能相關(guān)疾病的狀態(tài)下，孕激素和雄激素水平都顯示出很大的改變。高雄激素血癥被發(fā)現(xiàn)也可引起體內(nèi)孕激素、雌激素水平的變化，同時(shí)引起不孕癥的發(fā)生。傳統(tǒng)的免疫檢測(cè)法，受商品化試劑盒的影響，不能夠全面、準(zhǔn)確地了解不同個(gè)體性激素代謝的整體輪廓，故不能很好地提供個(gè)體化診療和用藥服務(wù)。

本研究采用了UPLC-MS/MS 法結(jié)合衍生化技術(shù)建立了可快速、同時(shí)檢測(cè)人血清中T、AD、DHEA、P 和17α-OHP 等5 種關(guān)鍵微量雄激素和孕激素的方法，結(jié)合本研究之前所建立的雌激素網(wǎng)絡(luò)質(zhì)譜測(cè)定方法[9]，可對(duì)性激素代謝網(wǎng)絡(luò)的整體定量描繪提供精準(zhǔn)的服務(wù)，在疾病診療、發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)分析和激素補(bǔ)充治療的個(gè)體化策略制定中，具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。