高效液相色譜法測(cè)定人腦脊液中萬(wàn)古霉素濃度及臨床應(yīng)用*

黃曉會(huì)，林志燕，沈艷琳，卜書紅，張 健

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院，上海 200092

顱內(nèi)感染是重型顱腦外傷開(kāi)顱術(shù)后嚴(yán)重并發(fā)癥，具有高致殘、致死率，會(huì)延長(zhǎng)住院時(shí)間、增加治療費(fèi)用，嚴(yán)重影響預(yù)后[1]。由于機(jī)體顱內(nèi)血腦屏障的作用，使常規(guī)藥物較難透過(guò)、較難進(jìn)入，因此降低了顱內(nèi)感染的治療效果[2]。

萬(wàn)古霉素（vancomycin，VAN）屬于三環(huán)糖肽類抗菌藥物，被譽(yù)為抗生素最后一道防線。臨床上是用于治療嚴(yán)重的顱內(nèi)感染的常用藥，但其通過(guò)血腦屏障達(dá)到最小殺菌濃度的維持時(shí)間短，需要?jiǎng)┝看骩2]，其具有一定的抗生素后效應(yīng)時(shí)間依賴性，并且有耳、腎毒性和血栓性靜脈炎等嚴(yán)重不良反應(yīng)。文獻(xiàn)報(bào)道，腦室內(nèi)或鞘內(nèi)注射抗菌藥物治療顱內(nèi)感染具有較好的臨床療效[3]，此治療方法逐漸普及，但缺乏相關(guān)基礎(chǔ)研究，對(duì)藥物的安全劑量、用藥間隔時(shí)間、療程沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)[4]，因此對(duì)監(jiān)測(cè)腦脊液中藥物濃度至關(guān)重要。本研究采用內(nèi)標(biāo)法，建立腦脊液中的萬(wàn)古霉素含量測(cè)定方法，對(duì)本院患者腦脊液濃度進(jìn)行監(jiān)測(cè)，可及時(shí)調(diào)整給藥方案，使其在安全有效濃度范圍內(nèi)。

1 材料與方法

1.1 儀器、藥品及試劑

1260 高效液相色譜儀，包括G1367E 自動(dòng)進(jìn)樣器，G1311B 四元泵，G4212B 二極管陣列檢測(cè)器（美國(guó)Agilent 公司）；Milli-Q 純水器（Millipore）；VORTEX KB3 型旋渦混懸器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；5424R 高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)eppendorf 公司）。

萬(wàn)古霉素對(duì)照品（批號(hào)：130329-200501）、去甲萬(wàn)古霉素對(duì)照品（批號(hào)：130359-200503），均中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈（色譜純，美國(guó)Fisher公司）；高氯酸、磷酸、磷酸二氫鉀均為分析純；純化水。

1.2 溶液配制

1.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取萬(wàn)古霉素對(duì)照品20 mg，用水定容至5 mL 量瓶中，配制成質(zhì)量濃度為4000 mg·L-1的對(duì)照品儲(chǔ)備溶液，經(jīng)水適當(dāng)稀釋成對(duì)照品溶液。

1.2.2 磷酸二氫鉀緩沖液 精密稱取磷酸二氫鉀6.8045 g，用水溶解并定容至1000 mL，用磷酸調(diào)節(jié)pH 值至3.2，配制成0.05mol·L-1的磷酸二氫鉀緩沖液。

1.2.3 內(nèi)標(biāo)溶液 精密稱取去甲萬(wàn)古霉素對(duì)照品20 mg，用水定容至10 mL 的量瓶中，配制成質(zhì)量濃度為2000mg·L-1的對(duì)照品儲(chǔ)備液，再取該溶液125μL至25 mL 量瓶中，加水定容至刻度，稀釋為10 mg·L-1的內(nèi)標(biāo)溶液，備用。

2 方法[5]與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Eclipse XDB C18（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：磷酸二氫鉀緩沖液（pH3.2）-乙腈（梯度洗脫：0～20 min：98%～90%A；20～25 min：90%～90%A；25～25.1 min：90%～98%A；25.1～30 min：98%A）；檢測(cè)波長(zhǎng)：236nm；柱溫：30 ℃；流速：1 mL·min-1；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 樣本前處理

精密取待測(cè)人腦脊液樣品180 μL 于1.5 mL Eppendorf 管中，加入內(nèi)標(biāo)溶液20 μL（100 mg·L-1），加入乙腈：6%高氯酸（1∶1，v/v）溶液200 μL，渦旋振蕩1 min，靜置10 min，13000 r·min-1離心10 min，取上清液20 μL 進(jìn)樣分析。

2.3 專屬性考察

取使用萬(wàn)古霉素的患者的人腦脊液樣本（見(jiàn)圖1A），再取空白腦脊液加入萬(wàn)古霉素及去甲萬(wàn)古霉素的對(duì)照品，經(jīng)“2.2”項(xiàng)下樣本前處理，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，結(jié)果萬(wàn)古霉素與去甲萬(wàn)古霉素分離完全，其中內(nèi)源性物質(zhì)及流動(dòng)相中的雜質(zhì)對(duì)測(cè)定無(wú)干擾，色譜圖見(jiàn)圖1B。

圖1 萬(wàn)古霉素腦脊液樣本（A）、萬(wàn)古霉素與去甲萬(wàn)古霉素加標(biāo)腦脊液（B）色譜圖

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線及定量下限

精密量取空白腦脊液900 μL，加入4000 mg·L-1的萬(wàn)古霉素100 μL，配制成400 mg·L-1，依次用空白腦脊液稀釋成1.5625、3.125、6.25、12.5、25、50、100、200 mg·L-1的腦脊液標(biāo)本，同時(shí)稀釋得低、中、高3種濃度的質(zhì)控腦脊液標(biāo)本，使其濃度分別為3.125、25、50 mg·L-1。經(jīng)“2.2”項(xiàng)下樣本預(yù)處理，每個(gè)濃度平行3 份及空白樣本1 份，進(jìn)樣測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線，以萬(wàn)古霉素與去甲萬(wàn)古霉素峰面積比值為縱坐標(biāo)，樣本濃度（μg·mL-1）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果在1.5625～200 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)萬(wàn)古霉素線性方程為：Y=8.41×10-2X+0.174，r=0.9990（n=3）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，本方法的定量限為1.5625 μg·mL-1。

2.5 基質(zhì)效應(yīng)試驗(yàn)[5]

經(jīng)“2.2”項(xiàng)下樣本預(yù)處理的空白腦脊液，離心沉淀后用上清液分別配制成含萬(wàn)古霉素濃度為3.125、25、50 mg·L-1基質(zhì)溶液，每個(gè)濃度配制3 份，待進(jìn)樣；另外，用水配制成相同含萬(wàn)古霉素濃度為3.125、25、50 mg·L-1的溶液，每個(gè)濃度配制5 份，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，分別比較3 個(gè)濃度的峰面積，空白腦脊液配制供試品比較水配制供試品，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.6 準(zhǔn)確度與精密度試驗(yàn)

取空白腦脊液作為基質(zhì)，配制萬(wàn)古霉素低、中、高濃度為3.125、25.0、50.0mg·L-1的腦脊液樣本，每個(gè)濃度平行配制5 份，經(jīng)“2.2”項(xiàng)下前處理，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，分別測(cè)定低、中、高3 個(gè)濃度水平的樣本各5 份，記錄峰面積。取配制好的萬(wàn)古霉素對(duì)照品，依次稀釋成為3.125、25.0、50.0mg·L-1對(duì)照品，每個(gè)濃度平行配制5 份，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，兩個(gè)峰面積比值計(jì)算絕對(duì)回收率，5 次進(jìn)樣峰面積計(jì)算日內(nèi)精密度（RSD）；每日按上述方法操作配制樣本，連續(xù)3 日，計(jì)算日間精密度。結(jié)果顯示，本方法測(cè)定腦脊液中萬(wàn)古霉素的準(zhǔn)確度均符合血藥濃度檢測(cè)條件；日內(nèi)、日間精密度均＜6%。見(jiàn)表1。

表1 測(cè)定腦脊液中萬(wàn)古霉素的準(zhǔn)確度、精密度、基質(zhì)效應(yīng)（n=5）

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取低、中、高濃度各5 個(gè)平行樣品，經(jīng)“2.2”前處理后將上清液在室溫下分別放置4、24、48 h，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算變異系數(shù)（CV%）；將配制好的質(zhì)控樣本置于4℃冰箱分裝保存，每隔1 周復(fù)測(cè)1 次，3 個(gè)水平分別測(cè)定5 組平行樣本，復(fù)測(cè)4 周，計(jì)算CV%。結(jié)果顯示，去甲萬(wàn)古霉素和萬(wàn)古霉素的樣本在上述試驗(yàn)情況下穩(wěn)定性良好，CV%均＜10%。

2.8 臨床應(yīng)用

采用本方法為本院重癥顱內(nèi)感染患者進(jìn)行腦脊液中萬(wàn)古霉素濃度監(jiān)測(cè)，采樣為連續(xù)給藥4 劑后、用藥前0～30 min，采集谷濃度樣本；給藥結(jié)束后1～2 h 采集峰濃度樣本。其中測(cè)定峰濃度的患者共6例，谷濃度的患者共8 例，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 測(cè)定患者腦脊液中萬(wàn)古霉素濃度結(jié)果

其中3 例患者腦脊液谷濃度低于10 μg·mL-1，4例患者谷濃度在10～20μg·mL-1，只有1 例大于20μg·mL-1，根據(jù)《桑福德抗微生物治療指南》[6]和美國(guó)傳染病學(xué)會(huì)[7]推薦：當(dāng)治療顱內(nèi)感染時(shí)，萬(wàn)古霉素腦脊液谷濃度目標(biāo)值范圍為10～20μg·mL-1，至少要保持在10μg·mL-1以上，以免發(fā)生耐藥。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，并結(jié)合患者實(shí)際情況，對(duì)藥物的用量做了適當(dāng)調(diào)整。血藥濃度監(jiān)測(cè)結(jié)果說(shuō)明萬(wàn)古霉素在患者中具有較大個(gè)體差異，對(duì)其進(jìn)行腦脊液濃度監(jiān)測(cè)非常重要。

3 討論

樣本處理方法的選擇直接影響HPLC 法的分離效果，萬(wàn)古霉素與去甲萬(wàn)古霉素樣本處理方法常用的有固相萃取法和直接沉淀法，其中直接沉淀法更為簡(jiǎn)便、省時(shí)?？紤]萬(wàn)古霉素和去甲萬(wàn)古霉素性質(zhì)等各方面的因素，初步選擇乙腈、甲醇、6%高氯酸及乙腈：6%高氯酸（1∶1）作為沉淀提取劑、進(jìn)行前處理優(yōu)化，結(jié)果顯示，單從外觀方面，乙腈、甲醇、6%高氯酸沉淀反應(yīng)較快；但使用乙腈、甲醇時(shí)回收率較低，6%高氯酸酸性較強(qiáng)，長(zhǎng)時(shí)間使用致色譜柱柱效降低，縮短壽命；最終選擇用乙腈：6%高氯酸（1∶1）做為沉淀提取劑，其凈化反應(yīng)較慢，需靜置10 min，充分反應(yīng)后，離心凈化效果最佳，回收率高。

萬(wàn)古霉素和去甲萬(wàn)古霉素的最大吸收波長(zhǎng)為220 nm，樣本中此吸收波長(zhǎng)干擾峰較多，參考有關(guān)文獻(xiàn)，采用236 nm 作為檢測(cè)波長(zhǎng)[1]。流動(dòng)相先后采用了水-甲醇、水-乙腈、pH3.2 磷酸二氫鉀緩沖液-乙腈進(jìn)行試驗(yàn)，在3 種流動(dòng)相中，磷酸二氫鉀緩沖液-乙腈分離的色譜峰型較好。又對(duì)磷酸二氫鉀緩沖液與乙腈作梯度洗脫和等度洗脫的對(duì)比，結(jié)果顯示，梯度洗脫分離度更好，且萬(wàn)古霉素與去甲萬(wàn)古霉素隨著色譜柱柱效下降，兩個(gè)峰分離會(huì)明顯變差，而采用梯度洗脫色譜柱的壽命會(huì)延長(zhǎng)，也可節(jié)約成本。本實(shí)驗(yàn)所建方法準(zhǔn)確可靠，簡(jiǎn)單靈敏，檢測(cè)限為0.5μg·mL-1，可滿足臨床腦脊液中萬(wàn)古霉素的藥動(dòng)學(xué)研究要求。后續(xù)可通過(guò)本方法對(duì)院內(nèi)患者進(jìn)行萬(wàn)古霉素腦脊液濃度測(cè)定，并收集病例進(jìn)行分析，可對(duì)萬(wàn)古霉素靜脈滴注聯(lián)合鞘內(nèi)注射的臨床療效及安全性進(jìn)行評(píng)估研究。