廿一味植物藥改善小鼠睡眠質(zhì)量及早期安全性研究

姜其慧，王云杰，王存芳，鄧金祥，余炳勝，李幼貞，龐濤

1 材料與方法

1.1 材料 (1)動(dòng)物：ICR小鼠，雄性，體質(zhì)量25～28 g，購自南京江寧區(qū)青龍山實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育中心，每只小鼠使用一次。飼養(yǎng)于中國藥科大學(xué)藥學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心清潔型動(dòng)物房，動(dòng)物房保持溫度(22±3)℃,相對濕度(55±3)%，采用12 h晝夜節(jié)律控制，保持食物和水源充足，適應(yīng)環(huán)境3 d進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。(2)儀器：Varioskan Flash全波長酶標(biāo)儀(美國ThermoFisher)；R500通用型小動(dòng)物麻醉機(jī)(瑞沃德生命科技有限公司)；一次性1 ml注射器(河南省歐冠醫(yī)療器械有限公司)；小型秒表計(jì)時(shí)器(上海皓元股份有限公司)；(3)藥物：廿一味植物藥是一種廿一味中藥植物復(fù)方功能制劑，由廣東隆賦藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)提供的成藥(批號：190401)，屬于夜用裝。戊巴比妥鈉購于上海信裕生物科技有限公司。異氟烷(深圳瑞沃德生命科技有限公司)；總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、乳酸脫氫酶(LDH)、α-羥基丁酸脫氫酶(α-HBDH)、肌酸激酶(CK)、尿素(UREA)等檢測試劑盒均購自于上?？迫A生物工程股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 將104只ICR小鼠分為3個(gè)實(shí)驗(yàn)組：安全性實(shí)驗(yàn)24只，戊巴比妥鈉閾上劑量睡眠實(shí)驗(yàn)40只，戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實(shí)驗(yàn)40只。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組按照體質(zhì)量隨機(jī)分為4亞組，分別為陰性對照(CN)亞組(生理鹽水)，廿一味植物藥低劑量亞組(0.1 g/kg)、中劑量亞組(1 g/kg)、高劑量亞組(2 g/kg)。灌胃給藥，將廿一味植物藥溶于適量生理鹽水，分別配制成低、中、高劑量，保持小鼠灌胃體積為0.2 ml，陰性對照亞組灌胃給等量生理鹽水，連續(xù)給藥28 d，隨小鼠生長體質(zhì)量變化而調(diào)整給藥。

1.2.1 安全性實(shí)驗(yàn)：每周測定并記錄各亞組小鼠體質(zhì)量。末次給藥后1 h，使用小型動(dòng)物麻醉機(jī)麻醉小鼠，摘取眼球收集血液，靜置2～3 h后，在4 ℃離心機(jī)離心收集血清，根據(jù)試劑盒說明書，檢測各臟器毒性指標(biāo)。其中肝臟毒性指標(biāo)為ALT、TC、TG，心臟毒性指標(biāo)為AST、LDH、CK及α-HBDH，腎臟毒性指標(biāo)為UREA；將小鼠安樂死，取心、肝、脾、肺、腎、腦等各亞組小鼠臟器，稱質(zhì)量，計(jì)算并臟器系數(shù)，臟器系數(shù)=臟器質(zhì)量/體質(zhì)量×100%，同時(shí)取各臟器進(jìn)行脫水固定及HE染色。

1.2.2 戊巴比妥鈉閾上劑量睡眠實(shí)驗(yàn)[5]：末次給藥30 min后，各亞組小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉45 mg/kg(戊巴比妥鈉使用生理鹽水配制，現(xiàn)配現(xiàn)用，所有小鼠100%入睡的最低劑量)，記錄小鼠從給藥后到翻正反射消失的時(shí)間，即為睡眠潛伏期；并記錄各亞組小鼠的睡眠時(shí)間，觀察廿一味植物藥對戊巴比妥鈉引起的睡眠潛伏期和睡眠時(shí)長的影響。

1.2.3 戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實(shí)驗(yàn)[6]：末次給藥30 min后，各亞組小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉30 mg/kg(戊巴比妥鈉使用生理鹽水配制，現(xiàn)配現(xiàn)用)，記錄各亞組小鼠翻正反射消失即入睡的只數(shù)，并計(jì)算睡眠發(fā)生率(睡眠發(fā)生率=入睡小鼠只數(shù)/各亞組小鼠總只數(shù)×100%)，比較廿一味植物藥不同劑量對戊巴比妥鈉閾下小鼠入睡發(fā)生率的影響。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Graph Pad Prism 6統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。表格計(jì)量數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示，圖計(jì)量數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SEM)；多組間比較均采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，采用Bonferroni檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 安全性實(shí)驗(yàn)

2.1.1 廿一味植物藥對小鼠體質(zhì)量的影響：實(shí)驗(yàn)開始前，各亞組小鼠稱質(zhì)量，給藥期間每周稱質(zhì)量。與陰性對照亞組相比，各亞組小鼠在不同時(shí)間段體質(zhì)量均無明顯差異(P>0.05)，即廿一味植物藥對各亞組小鼠體質(zhì)量的增長均無影響。見表1。

表1 各亞組小鼠28 d體質(zhì)量變化比較

2.1.2 廿一味植物藥對小鼠臟器系數(shù)的影響：隨著ICR小鼠生長周齡的變化，小鼠的臟器質(zhì)量和體質(zhì)量逐漸增加，但各亞組小鼠的臟器系數(shù)(臟器系數(shù)=臟器重量/體質(zhì)量×100%)并無明顯差異(P>0.05)。見圖1。

圖1 各亞組小鼠的臟器系數(shù)比較 (n=6)

2.1.3 廿一味植物藥對小鼠臟器毒性的影響：與陰性對照亞組相比，各濃度的廿一味植物藥對肝臟毒性指標(biāo)ALT、TC、TG，心臟毒性指標(biāo)AST、LDH、CK、α-HBDH及腎臟的毒性指標(biāo)UREA均未產(chǎn)生明顯影響(P>0.05)。見圖2。

圖2 各亞組小鼠的臟器毒性指標(biāo)比較 (n=6)

2.1.4 HE染色結(jié)果：HE染色觀察不同劑量廿一味植物藥對小鼠臟器的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與陰性對照亞組相比，不同劑量給藥組心臟心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，心肌纖維排列緊密，細(xì)胞核質(zhì)緊密，心肌毛細(xì)血管無擴(kuò)張充血現(xiàn)象；肝臟染色結(jié)果正常，細(xì)胞細(xì)胞核居中且大而圓，可以看到明顯核仁，肝小葉形態(tài)完整，無明顯變化。脾臟濾泡數(shù)量豐富，形態(tài)飽滿，脾竇形態(tài)完整，竇內(nèi)無壞死細(xì)胞和炎性細(xì)胞浸潤。肺部組織結(jié)構(gòu)正常，肺泡完整，支氣管黏膜上皮及肺泡無變形，無炎性細(xì)胞滲出及聚集。腎臟切片在顯微鏡下可見結(jié)構(gòu)形態(tài)正常，腎小球形態(tài)正常，球后毛細(xì)血管無擴(kuò)張充血現(xiàn)象。腦部組織神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整，無明顯形態(tài)變化，且無大量炎性細(xì)胞浸潤。見圖3。

圖3 各亞組小鼠各臟器的HE染色切片(×40)比較

2.2 廿一味植物藥改善小鼠睡眠質(zhì)量的作用分析

2.2.1 戊巴比妥鈉閾上劑量睡眠實(shí)驗(yàn)：在使用戊巴比妥鈉閾上劑量條件下，與陰性對照亞組相比，廿一味植物藥高、中、低各劑量均可明顯縮短小鼠進(jìn)入睡眠的潛伏期(P<0.001)，且高、中、低各劑量可明顯延長各亞組小鼠的睡眠時(shí)間(P<0.001)，說明廿一味植物藥在改善睡眠方面與戊巴比妥鈉具有協(xié)同作用。見圖4。

注：與陰性對照亞組比較，aP<0.001

2.2.2 戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實(shí)驗(yàn)：在使用戊巴比妥鈉閾下劑量條件下，與陰性對照亞組相比，廿一味植物藥高、中劑量可明顯增加小鼠入睡的數(shù)目，明顯升高小鼠睡眠發(fā)生率(P<0.05)。見表2。

表2 戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實(shí)驗(yàn)

3 討 論

廿一味植物藥夜用裝主要由21味植物藥材組合而成，與本課題之前研究的廿一味植物藥日用裝在藥材組成上略有不同。其中有15味藥材組成相同，主要包括薤白、茯苓、葛根、木耳、山楂、肉桂、梔子、枸杞子、黃精、沙棘、金針菇、桂圓、白芷、甘草、烏藥葉。在這些相同成分中，葛根具有悠久的藥食兩用歷史，對神經(jīng)有明顯的保護(hù)作用[10]；梔子的主要成分梔子黃色素具有清心除煩、治療心腎不交的功效，可治療虛煩不眠、驚悸多夢，具有改善睡眠的作用[11]。肉桂屬樟科常綠喬木植物，中華本草中記載[12]，肉桂具有增加冠狀動(dòng)脈及腦血流量的作用，通過改善腦血流量起到神經(jīng)保護(hù)作用，改善睡眠，且肉桂揮發(fā)油中桂皮醛具有鎮(zhèn)靜作用。桂圓、枸杞子性甘干無毒，是養(yǎng)腦益智上品[13]。這些相同藥材是廿一味植物藥實(shí)現(xiàn)保健品功能的基礎(chǔ)。

廿一味植物藥夜用裝與日用裝中有6味藥材組成不同。夜用裝中含有酸棗仁、百合、蓮子、黃花菜、橘皮、白果，而日用裝中含有桃仁、藿香、人參、丁香、干姜、菊花。本課題組之前的研究發(fā)現(xiàn)日用裝可通過增加腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子和抗氧化作用進(jìn)而起到改善記憶的作用[14]。而夜用裝中，百合味甘，性微寒，具有養(yǎng)陰潤肺、清心安神的功效[15-16]，百合作為中藥臨床上廣泛治療各種失眠癥狀。酸棗仁屬于中藥養(yǎng)心安神藥，為鼠李科植物酸棗的干燥成熟種子，味甘酸，性平，歸心肝經(jīng)，有養(yǎng)心益肝、安神斂汗之功效[17]，可治療虛煩不眠、驚悸多夢。酸棗仁味酸性平，有潤肺安神斂汗之效[18]；蓮子又名水芝丹，屬睡蓮科蓮屬，主要分布在福建等地[19]，蓮子性味甘寒無毒，具有安神解熱之功效[20]。黃花菜又名金針菜，古書記載“安五臟，利心志”，可治“夜少安寐”；黃花菜的乙醇提取物可通過強(qiáng)化小鼠大腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子系統(tǒng)和5-HT系統(tǒng)，進(jìn)而表現(xiàn)為抗抑郁和促睡眠作用[21]。白果的主要成分是白果內(nèi)酯，具有改善腦動(dòng)脈血流量的作用[22]。這幾種中藥組合使用，其復(fù)方制劑夜用裝可起到益氣補(bǔ)血、安神益腦的作用。

目前，受試藥物與巴比妥類聯(lián)合給藥檢測睡眠時(shí)間等指標(biāo)是最經(jīng)典的藥理方法。通過觀察小鼠的睡眠潛伏期，睡眠時(shí)間及小鼠的入睡發(fā)生率等指標(biāo)檢測實(shí)驗(yàn)藥物的催眠作用。但由于戊巴比妥鈉經(jīng)過肝藥酶代謝，對肝藥酶有影響的藥物可能會(huì)延長睡眠時(shí)間等。因此還需進(jìn)一步檢測戊巴比妥鈉閾下劑量實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物入睡發(fā)生率，進(jìn)一步確定受試藥物的催眠作用。本研究參照《保健食品檢驗(yàn)與評價(jià)技術(shù)規(guī)范》的有關(guān)睡眠功能實(shí)驗(yàn)改善后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在戊巴比妥鈉閾上睡眠實(shí)驗(yàn)中，與陰性對照亞組相比，廿一味植物藥夜用裝高、中、低各劑量亞組可明顯縮短小鼠的睡眠潛伏期，延長小鼠睡眠時(shí)間。在戊巴比妥鈉閾下催眠實(shí)驗(yàn)中，與陰性對照亞組相比，廿一味植物藥夜用裝高、中劑量亞組可明顯提高小鼠的睡眠發(fā)生率，實(shí)驗(yàn)證明廿一味植物藥夜用裝可起到協(xié)同戊巴比妥鈉改善睡眠的作用。并且在連續(xù)28 d的灌胃給藥后發(fā)現(xiàn)，與陰性對照亞組相比，廿一味植物藥夜用裝高、中、低各劑量亞組小鼠體質(zhì)量均無明顯變化，臟器系數(shù)、臟器毒性指標(biāo)檢測并無明顯變化，且各亞組小鼠HE染色切片顯示并無明顯病理變化。

綜上所述，廿一味植物藥夜用裝具有改善睡眠的作用，并且在早期安全性評價(jià)中安全，無不良反應(yīng)，具有開發(fā)保健食品及臨床用藥的潛力。