自由基在白血病干細(xì)胞衰老進(jìn)程中的作用研究進(jìn)展

李 淵 綜述，顧守美，張素琴，王燏芳，畢玉洮，郭太兵，周 玥 審校

(1.大理護(hù)理職業(yè)學(xué)院，云南 大理 671006；2.大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，云南 大理 671000；3.大理大學(xué)組織胚胎學(xué)教研室/云南省細(xì)胞生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 大理 671000)

白血病是血液系統(tǒng)的惡性腫瘤。白血病患者體內(nèi)有大量的白血病細(xì)胞，這些具有極強(qiáng)克隆性的細(xì)胞浸入人體的骨髓和各個(gè)組織器官中大量增殖，抑制骨髓的正常造血，破壞組織和器官的功能。白血病是一種非常復(fù)雜的疾病，包括分子生物學(xué)發(fā)病機(jī)制及病因、多樣性的臨床癥狀、因人而異的個(gè)體化表現(xiàn)及病癥、需不斷調(diào)整和更新的治療方案、難以預(yù)測(cè)的臨床預(yù)后及復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)等，都體現(xiàn)其復(fù)雜性。白血病細(xì)胞中存在的白血病干細(xì)胞(LSCs)是白血病發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)、耐藥的根本原因。在生物界中，衰老是物種的普遍規(guī)律，細(xì)胞作為生命個(gè)體最基本的結(jié)構(gòu)和功能單位，在不斷地進(jìn)行新生、衰老和死亡，LSCs也擺脫不了衰老的命運(yùn)[1]。人為地促進(jìn)和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的衰老是治療腫瘤的新觀點(diǎn)[2]。在衰老的機(jī)制中，有自由基學(xué)說(shuō)、遺傳學(xué)說(shuō)、免疫學(xué)說(shuō)等，本文從自由基學(xué)說(shuō)的角度綜述LSCs的衰老，進(jìn)而探究白血病的發(fā)生、發(fā)展。

1 LSCs生物學(xué)特性

對(duì)于LSCs的來(lái)源問(wèn)題，目前沒(méi)有完全統(tǒng)一的結(jié)論。有研究已證實(shí)，LSCs可能來(lái)源于以下4種途徑：正常的造血干細(xì)胞、血液血管干細(xì)胞、已分化完成的造血祖細(xì)胞、基本成熟的白血病細(xì)胞[3-4]。急性髓系白血病中的LSCs均由正常的造血干細(xì)胞轉(zhuǎn)化而來(lái)，其形成的結(jié)果是導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生病態(tài)造血，從而造成一系列的貧血、感染、出血等惡性血液病癥狀。LSCs可能來(lái)源于已分化完成的造血祖細(xì)胞，融合基因MLL-AF9能夠促進(jìn)重置造血祖細(xì)胞的基因組，從而可能重新自我更新成為L(zhǎng)SCs[5]。這類(lèi)LSCs與正常的造血干細(xì)胞特性完全不同，其具有明顯的腫瘤細(xì)胞特性，進(jìn)而破壞正常造血功能促進(jìn)白血病的發(fā)生[6]。LSCs也可能來(lái)源于血液血管干細(xì)胞和基本成熟的白血病細(xì)胞，這類(lèi)LSCs的產(chǎn)生機(jī)制目前還不是很明確，需進(jìn)一步證實(shí)。

與正常的造血干細(xì)胞比較，LSCs存在多種生物學(xué)特性，如獨(dú)特的生存優(yōu)勢(shì)、更強(qiáng)的自我更新機(jī)制、特異的免疫表型、復(fù)雜的多重耐藥機(jī)制特性等。LSCs可自主進(jìn)入細(xì)胞周期，通過(guò)無(wú)限增殖和抗細(xì)胞凋亡以獲得獨(dú)特的生存優(yōu)勢(shì)和更強(qiáng)的自我更新機(jī)制；CD34、CD38、CD123、CD117、CD71、CD44、HLA-DR、TIM3、CLL-1、CD96、CD47、CD32和CD25等表面分子標(biāo)志物，是LSCs特異的免疫表型；LSCs總是處在細(xì)胞周期之外的靜止期，躲避化療藥物的殺傷，從而形成耐藥性。LSCs有多種調(diào)控異常途徑,目前發(fā)現(xiàn)與LSCs相關(guān)的信號(hào)通路包括WNT/β-catenin、PCGF4、JAK/STAT、PI3K/AKT、RAS、NF-κB、Notch等，因此從這些信號(hào)通路和基因入手，進(jìn)行相應(yīng)的靶向研究，可能會(huì)引發(fā)出新的臨床治療思路[7-9]。

2 LSCs衰老

衰老自概念形成以來(lái)就備受人們的關(guān)注，研究熱度較高。就目前人們熟知的所有生物，衰老的基本過(guò)程是大體一致的。衰老是一個(gè)綜合的、復(fù)雜的過(guò)程，其發(fā)生與機(jī)體的結(jié)構(gòu)和功能退化相伴隨[10]，其中就人類(lèi)整體而言，普遍性、進(jìn)行性、退化性和內(nèi)因性是衰老的基本特征。隨著生理、生化方面的理論不斷革新，關(guān)于衰老機(jī)制也得到了更深層次的補(bǔ)充和完善。眾多的衰老機(jī)制中，自由基學(xué)說(shuō)一直被人們普遍關(guān)注和接受。

細(xì)胞衰老是指細(xì)胞在生命的進(jìn)程中,隨著機(jī)體的不斷老化而出現(xiàn)的功能紊亂和分化增殖能力下降的過(guò)程。如此，LSCs的衰老也是一種漸進(jìn)性的、伴發(fā)形態(tài)學(xué)改變的、不可逆性的退行性過(guò)程[11]。細(xì)胞衰老與細(xì)胞的形態(tài)改變相伴隨，絕大部分衰老的細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞膜的通透性和流動(dòng)性降低，染色質(zhì)會(huì)逐漸呈現(xiàn)凝聚、固縮、碎裂、溶解的不可逆性過(guò)程，線(xiàn)粒體數(shù)量減少且功能退化，高爾基體形態(tài)消失，細(xì)胞核染色加深且形態(tài)增大，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)脂類(lèi)含量增多。衰老的細(xì)胞分子水平也發(fā)生變化：DNA的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄在細(xì)胞衰老時(shí)均受抑制；RNA中mRNA和tRNA含量均降低；蛋白質(zhì)的合成量、穩(wěn)定性、抗原性、可消化性均下降；酶分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)、溶解度、等電點(diǎn)發(fā)生變化；不飽和脂肪酸被氧化，生物膜流動(dòng)性下降。

3 自由基

自由基又稱(chēng)游離基,是指化合物的共價(jià)鍵發(fā)生龜裂而形成的未配對(duì)電子的原子或原子團(tuán)。自由基是機(jī)體氧化反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的中間代謝產(chǎn)物，具有高能的化學(xué)活性。人體內(nèi)的自由基種類(lèi)有很多，用來(lái)說(shuō)明衰老發(fā)生機(jī)制的自由基主要是超氧陰離子自由基 (O2-)、羥自由基(·OH-)和類(lèi)脂質(zhì)過(guò)氧化氫自由基(H2O2)。它們具有強(qiáng)氧化的功能，存在于機(jī)體的各類(lèi)生理和病理進(jìn)程中，在機(jī)體的衰老進(jìn)程中也發(fā)揮著重要作用。機(jī)體內(nèi)的自由基不僅可以自我產(chǎn)生，也可以來(lái)源于外界。自由基對(duì)機(jī)體的作用是雙重的，過(guò)多的自由基可使正常細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能受損，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡，完全清除自由基也會(huì)對(duì)機(jī)體造成損傷，少量的自由基可以發(fā)揮其殺滅微生物和促進(jìn)基因突變適應(yīng)環(huán)境的作用，平衡機(jī)體內(nèi)氧化和抗氧化之間的關(guān)系。

4 自由基與LSCs衰老的關(guān)系

自由基含量的高低，直接影響了腫瘤干細(xì)胞的凋亡、分化、增殖與衰老。自由基含量增高，可抑制LSCs自我更新的生物學(xué)特性，進(jìn)而抑制其增殖，且促進(jìn)其分化、誘導(dǎo)其衰老及凋亡，導(dǎo)致LSCs減少；與已完全分化的白血病細(xì)胞相比，LSCs中的自由基含量更低，低含量的自由基對(duì)于維持LSCs的存活和特性尤為重要,自由基含量過(guò)高，極有可能誘發(fā)LSCs發(fā)生衰老，甚至死亡[12]。有研究證實(shí)：當(dāng)歸多糖可以調(diào)控CML骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞衰老，從而抑制LSCs的增殖，其可能的機(jī)制是提高細(xì)胞的抗氧化能力和降低細(xì)胞氧化損傷[13]。

4.1自由基引發(fā)端?？s短 端粒的主要功能是維持機(jī)體染色體的完整性。細(xì)胞周期性的復(fù)制會(huì)引發(fā)端粒進(jìn)行性縮短，端粒長(zhǎng)度低于最低限度時(shí)，染色體的穩(wěn)定性便被破壞，細(xì)胞此時(shí)雖然繼續(xù)存活，但是已經(jīng)不能進(jìn)行正常的增殖分裂[14]。有研究已經(jīng)表明，當(dāng)歸多糖能可通過(guò)p16INK4a/pRb信號(hào)通路在白血病小鼠體內(nèi)有效抑制LSCs端粒酶的活性，從而破壞端粒的穩(wěn)定性，導(dǎo)致端粒縮短，降低LSCs的自我更新能力，促進(jìn)LSCs的衰老[15]。也有研究證實(shí)，40 μg/mL的當(dāng)歸多糖在體外作用CD34+CD38-LSCs 48 h后，細(xì)胞的端粒長(zhǎng)度明顯縮短，端粒酶活性明顯下降，證實(shí)當(dāng)歸多糖在體外可通過(guò)調(diào)控端粒系統(tǒng)來(lái)誘導(dǎo)LSCs的衰老[16]。端粒酶活性調(diào)控著端粒的長(zhǎng)度，自由基的過(guò)度增多使得端粒的功能發(fā)生障礙，長(zhǎng)度進(jìn)行性地縮短，破壞了LSCs染色體的穩(wěn)定性，LSCs雖然存活，但是增殖受到抑制，出現(xiàn)衰老和凋亡的征象。

4.2自由基損傷線(xiàn)粒體 細(xì)胞內(nèi)的線(xiàn)粒體具有調(diào)控細(xì)胞凋亡的重要作用[17]。故細(xì)胞線(xiàn)粒體若想充分全面地發(fā)揮其功能，完整無(wú)受損是對(duì)線(xiàn)粒體的基本要求。有文獻(xiàn)報(bào)道，機(jī)體內(nèi)的自由基大部分來(lái)源于線(xiàn)粒體，線(xiàn)粒體在產(chǎn)生能量的過(guò)程中可以釋放大量的自由基，如自由基不能被及時(shí)清除，會(huì)導(dǎo)致mtDNA突變，進(jìn)而影響線(xiàn)粒體的功能，使得線(xiàn)粒體產(chǎn)能減少，細(xì)胞發(fā)生死亡，機(jī)體出現(xiàn)衰老的征象[18]。有研究顯示，POLG基因 (mtDNA 聚合酶γ)突變模型小鼠中，mtDNA 突變累積可導(dǎo)致模型小鼠出現(xiàn)衰老表型，同時(shí)小鼠的壽命大大縮短[19]。也有研究證實(shí)，mtDNA含量下降可致干細(xì)胞損耗,拓?fù)洧螃粱蛉毕軲1L系果蠅僅用短型(僅具有核定位信號(hào)，僅定位于細(xì)胞核)拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅲα治療可恢復(fù)生存能力，但細(xì)胞mtDNA含量下降,ATP水平也降低,致M1L系雄性果蠅生殖系干細(xì)胞進(jìn)行性損耗并引起不育;而用長(zhǎng)型(在N端保留線(xiàn)粒體導(dǎo)入序列，在C端保留核定位序列，主要定位于線(xiàn)粒體，但在細(xì)胞核中有一小部分)拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅲα治療則表型無(wú)明顯異常[20]。ABRAHAM等[21]的研究發(fā)現(xiàn)，SIRT1在LSCs線(xiàn)粒體的氧化磷酸化中起著重要作用，與SIRT1基因未敲除的慢性髓系白血病小鼠相比，基因敲除的小鼠白血病癥狀延緩，即抑制SIRT1基因的表達(dá)，可降低LSCs線(xiàn)粒體的功能和活性，導(dǎo)致氧化磷酸化作用減弱，誘發(fā)LSCs發(fā)生衰老。SINGH等[22]的研究發(fā)現(xiàn)，LSCs的生長(zhǎng)依賴(lài)于氧化代謝，通過(guò)抑制急性髓系LSCs中的線(xiàn)粒體膜間組裝(MIA)途徑，延緩了急性髓系白血病的發(fā)生，抑制了LSCs的自我更新，降低了LSCs的生存能力，誘發(fā)LSCs發(fā)生衰老。

4.3自由基誘發(fā)生物膜損傷 當(dāng)體內(nèi)自由基不斷增多時(shí)，可引發(fā)膜上的脂類(lèi)物質(zhì)出現(xiàn)結(jié)構(gòu)和功能的異常。生物膜由流動(dòng)狀態(tài)逐漸轉(zhuǎn)化為剛性狀態(tài)，胞內(nèi)的細(xì)胞器功能也受損。當(dāng)生物膜被破壞時(shí)，細(xì)胞的功能也會(huì)隨之退化，誘發(fā)細(xì)胞衰老進(jìn)程。ZHONG等[23]的研究發(fā)現(xiàn)，氧化固醇結(jié)合蛋白相關(guān)蛋白4L(ORP4L)是LSCs生存和生物能量所必需的蛋白，在正常的干細(xì)胞中不表達(dá)，但卻在LSCs中高度表達(dá)，ORP4L蛋白能夠從質(zhì)膜中提取磷脂分子PIP2，并將其呈遞給磷脂酶PLCβ3，從而產(chǎn)生第二信使IP3和Ca2+依賴(lài)生物能，維持LSCs的生存和能量生成；LYZ-81蛋白與ORP4L存在競(jìng)爭(zhēng)性作用，可抑制LSCs的能量生成，降低其生存能力，促進(jìn)LSCs的衰老。

4.4自由基促進(jìn)細(xì)胞凋亡 細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的一種程序性死亡過(guò)程。早期的研究發(fā)現(xiàn)，自由基過(guò)度增多可通過(guò)損傷DNA、影響信號(hào)傳導(dǎo)，以及參與p53、B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)和Bax等凋亡基因表達(dá)調(diào)控等途徑介導(dǎo)細(xì)胞凋亡[24]。干細(xì)胞因擁有穩(wěn)定的端粒酶，有效消除了端?？s短的問(wèn)題，而具有更強(qiáng)的自我更新特性；還可通過(guò)旁分泌效應(yīng)，分泌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、白血病抑制因子(LIF)、SDF等趨化因子、Bcl-2基因等抑制凋亡因子，從而抑制干細(xì)胞發(fā)生凋亡。王東萍等[25]的研究發(fā)現(xiàn)，秦巴硒菇的提取物FA-2-b-β可通過(guò)增強(qiáng)Bax和Caspase-3的表達(dá)來(lái)抑制KG1a干細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡，其抗腫瘤效應(yīng)是通過(guò)調(diào)控線(xiàn)粒體介導(dǎo)的凋亡途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的。周勇等[26]的研究發(fā)現(xiàn)，抗酗酒藥Disulfiram聯(lián)合銅通過(guò)上調(diào)腫瘤壞死因子-α表達(dá)誘導(dǎo)活性氧蓄積，促進(jìn)LSCs凋亡。

4.5自由基造成DNA損傷 過(guò)量的自由基可使堿基完整性被破壞，誘發(fā)機(jī)體的染色體出現(xiàn)變異，基因出現(xiàn)突變。被損傷的基因片段不能及時(shí)被修復(fù)，導(dǎo)致基因中轉(zhuǎn)錄的mRNA減少，蛋白質(zhì)表達(dá)減少，細(xì)胞功能減退，加速衰老的發(fā)生，導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)肌肉萎縮、智力減退、記憶力障礙等衰老的表征。羅堉暄等[27]的研究證實(shí)，STAT3抑制劑Stattic可能通過(guò)誘導(dǎo)白血病細(xì)胞發(fā)生DNA損傷并阻礙其修復(fù)，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡，加速LSCs的衰老進(jìn)程。PODSZYWALOW-BARTNICKA等[28]的研究發(fā)現(xiàn)，可以通過(guò)抑制CML白血病小鼠模型中的RAD52基因表達(dá)，進(jìn)而阻止CML的進(jìn)程。有科研人員將RAD52蛋白敲除后，LSCs的DNA出現(xiàn)結(jié)合修復(fù)雙鏈斷裂而發(fā)生衰老死亡[29]。CIMMINO等[30]的研究發(fā)現(xiàn)，維生素C聯(lián)合PARP抑制劑可以使TET2突變的LSCs DNA發(fā)生去甲基化，降低其自我更新的特性，發(fā)生衰老和死亡。

5 小 結(jié)

以上研究證明，自由基與LSCs的衰老有著密切聯(lián)系。不斷深入探究LSCs衰老與自由基之間的關(guān)系，不僅有重要的理論意義，也有廣泛的發(fā)展前景。在機(jī)制研究方面，可以更加多元化認(rèn)知LSCs的衰老機(jī)制，更深層次地理解衰老的過(guò)程，完善了LSCs衰老方面的知識(shí)框架，為開(kāi)發(fā)出新型抗衰老、抗白血病發(fā)生的藥物提供了新思路和理論模型。在臨床治療方面，可以為白血病的預(yù)防、防治及預(yù)后開(kāi)拓新的治療思路，有效降低白血病的發(fā)生率，延緩白血病的進(jìn)展，減輕白血病患者的癥狀。綜上所述，通過(guò)控制自由基的含量，進(jìn)而從基因分子水平來(lái)調(diào)控LSCs的凋亡和衰老，是未來(lái)治療白血病的一種新思路。自由基可以調(diào)控LSCs的衰老，但對(duì)于其他腫瘤及腫瘤干細(xì)胞是否也有調(diào)控作用尚不清楚。雖然現(xiàn)在關(guān)于LSCs衰老與自由基的關(guān)系這方面的機(jī)制和研究還不是很深入，但為后期研究白血病的發(fā)生機(jī)制及治療方案提供了有力的理論依據(jù)。