miR-448在潰瘍性結(jié)腸炎組織中的表達(dá)水平及意義

羅 鵬 丁 云 劉有理

潰瘍性結(jié)腸炎(UC)是一種慢性腸道炎性疾病，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢[1]。UC具有病程長、復(fù)發(fā)率高、并發(fā)癥多的特點(diǎn)，臨床特征常表現(xiàn)為便血、腹痛及高熱等[2-3]。隨著UC病情進(jìn)展，患者可出現(xiàn)腸道狹窄、梗阻、穿孔等結(jié)構(gòu)性損傷，嚴(yán)重時(shí)可誘發(fā)UC相關(guān)結(jié)直腸癌[4-5]。因此，早期評(píng)估UC疾病活動(dòng)度及預(yù)后情況，及時(shí)采取有效措施控制病情，對(duì)于改善患者預(yù)后具有重要意義。目前，臨床常通過腸道炎性反應(yīng)狀態(tài)評(píng)估腸黏膜愈合情況，但存在一定不足。改良Mayo評(píng)分及Truelove-Witts分級(jí)等臨床評(píng)分可反映UC患者的主觀癥狀，但有部分緩解期UC患者可能存在持續(xù)的黏膜炎性反應(yīng)[6]。部分常用的生物學(xué)標(biāo)志物受外界因素干擾較大，判斷腸道炎性反應(yīng)狀態(tài)的特異度較差[7]。結(jié)腸鏡檢查是目前界定UC患者腸道黏膜狀況的金標(biāo)準(zhǔn)，但其為侵入性檢查，且在評(píng)估患者黏膜病變時(shí)存在滯后性[8]，難以在臨床上廣泛應(yīng)用。因此，亟需探尋客觀、準(zhǔn)確的生物學(xué)指標(biāo)用于判定UC疾病活動(dòng)度及患者預(yù)后情況。核因子-κB(NF-κB)可調(diào)節(jié)多種參與腸道免疫反應(yīng)及炎性反應(yīng)的細(xì)胞因子的表達(dá)水平，進(jìn)而參與UC的發(fā)生、發(fā)展過程[9]，而miR-448可通過絲裂原活化蛋白激酶和磷脂酰肌醇3激酶/絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶途徑，誘導(dǎo)NF-κB的活化[10]，由此推測miR-448可能與UC的發(fā)生、發(fā)展存在聯(lián)系。本研究對(duì)miR-448與UC疾病活動(dòng)度及患者預(yù)后的關(guān)系進(jìn)行分析，以期為臨床評(píng)估提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

前瞻性選取2015年7月至2017年7月宣城市人民醫(yī)院收治的67例UC患者作為研究對(duì)象，設(shè)為UC組。UC患者均參照《中國炎癥性腸病診斷治療規(guī)范的共識(shí)意見》[11]中的標(biāo)準(zhǔn)確診。67例UC患者經(jīng)結(jié)腸鏡檢查發(fā)現(xiàn)，24例處于緩解期，43例處于活動(dòng)期。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)首次確診為UC；(2)入組前未服用免疫抑制劑、非甾體類抗炎藥等藥物；(3)簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)伴有惡性腫瘤；(2)伴有全身感染性疾?。?3)伴有中毒性結(jié)腸擴(kuò)張等；(4)妊娠期或哺乳期婦女；(5)隨訪失聯(lián)。選取同期在本院行結(jié)腸息肉切除術(shù)的60例受試者作為對(duì)照組。UC組男性40例，女性27例，年齡19～43歲，平均年齡為(28.57±3.19)歲，平均體質(zhì)量指數(shù)(BMI)為(20.69±3.28)kg/m2。對(duì)照組男性35例，女性25例，年齡為22～43歲，平均年齡為(29.05±3.37)歲，平均BMI為(21.42±3.15)kg/m2。兩組在性別(χ2=0.025，P=0.876)、年齡(t=0.824，P=0.411)、BMI(t=1.276，P=0.204)方面比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，具有可比性。本研究獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

收集患者的年齡、性別、BMI、吸煙、飲酒、病變范圍、腸道損傷、腸切除術(shù)史、不典型增生、肛周病變(肛裂、肛周膿腫、肛瘺)、家族史、基底漿細(xì)胞增多等資料。67例患者中有13例肛周病變，其中肛裂3例，肝周膿腫6例，肛瘺4例。

抽取受試者入組次日清晨空腹肘靜脈血5 mL，室溫下4 000 r/min離心10 min，分離上層血清，置于-20 ℃冰箱待測。采用免疫比濁法檢測血清C反應(yīng)蛋白(CRP)表達(dá)水平，試劑盒購自南京基蛋生物科技有限公司。采用MC-600Vet全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀(購自深圳市庫貝爾生物科技股份有限公司)測定血液紅細(xì)胞沉降率(ESR)、血紅蛋白表達(dá)水平。采用化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測血清白細(xì)胞介素-15(IL-15)表達(dá)水平，試劑盒購自北京普朗醫(yī)療有限公司。

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time PCR)法檢測UC患者的miR-448相對(duì)表達(dá)量，試劑盒購自德國羅氏公司。在無菌條件下取得患者的黏膜組織，30 min內(nèi)將保存組織的凍存管置于液氮罐中保存。檢測時(shí)在無菌條件下將UC黏膜組織及結(jié)腸息肉組織置于液氮中研磨，之后4 000 r/min離心15 min，分離上層清液置于EP管中，待驗(yàn)。應(yīng)用TRIzol試劑提取總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測RNA的純度及濃度。應(yīng)用核酸蛋白儀和瓊脂糖凝膠電泳對(duì)提取的RNA進(jìn)行分析。取2 μL總RNA置于反轉(zhuǎn)錄試劑盒中進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA。最后用PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min預(yù)變性，之后95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt表示miR-448的相對(duì)表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.3 UC疾病活動(dòng)度

采用改良Mayo評(píng)分評(píng)估UC疾病活動(dòng)度，主要從排便、便血、內(nèi)鏡及醫(yī)師總體評(píng)價(jià)4個(gè)方面進(jìn)行評(píng)估[11]，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表2。Mayo評(píng)分≤2分且無單個(gè)分項(xiàng)評(píng)分>1分為緩解期，>2分為活動(dòng)期，其中3～5分為輕度，6～10分為中度，11～12分為重度。

表2 UC疾病活動(dòng)度劃分

1.4 隨訪

采用復(fù)診方式對(duì)患者進(jìn)行隨訪，隨訪起始時(shí)間為2015年7月18日，截止時(shí)間為2019年8月6日。記錄患者預(yù)后情況，本研究將復(fù)發(fā)、行結(jié)腸手術(shù)、UC相關(guān)黏膜異型增生及UC相關(guān)結(jié)直腸癌定義為預(yù)后不良[12]。復(fù)發(fā)指經(jīng)藥物治療進(jìn)入緩解期后，UC相關(guān)癥狀再次出現(xiàn)，并有實(shí)驗(yàn)室炎性指標(biāo)、內(nèi)鏡檢查及影像學(xué)檢查的疾病活動(dòng)證據(jù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 兩組miR-448相對(duì)表達(dá)量比較

UC組miR-448的相對(duì)表達(dá)量為1.42±0.36，高于對(duì)照組(0.81±0.19)，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=11.739，P<0.001)。

2.2 不同病變部位miR-448相對(duì)表達(dá)量比較

67例患者中病變位于直腸有18例，左半結(jié)腸30例，廣泛結(jié)腸19例。直腸組、左半結(jié)腸組和廣泛結(jié)腸組中miR-448的相對(duì)表達(dá)量分別為1.38±0.33、1.43±0.35、1.44±0.38，3組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.163，P=0.855)。

2.3 不同疾病活動(dòng)度UC患者miR-448相對(duì)表達(dá)量比較

67例患者中，緩解期24例，活動(dòng)期43例，其中輕度12例、中度16例、重度15例。緩解期、輕度組、中度組、重度組UC患者miR-448的相對(duì)表達(dá)量分別為1.11±0.18、1.29±0.21、1.55±0.28、1.88±0.30，4組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=34.098，P<0.001)。緩解期miR-448相對(duì)表達(dá)量低于輕度組、中度組及重度組(q=2.985，P<0.05；q=7.992，P<0.05；q=13.715，P<0.05)，輕度組低于中度組及重度組(q=3.991，P<0.05；q=8.931，P<0.05)，中度組低于重度組(q=5.383，P<0.05)。

2.4 miR-448與UC患者預(yù)后的關(guān)系

67例UC患者隨訪期間預(yù)后不良發(fā)生率為41.79%(28/67)，其中復(fù)發(fā)23例(34.33%)，腸腔狹窄行結(jié)腸切除術(shù)1例(1.49%)，腸梗阻反復(fù)發(fā)作行腸切除術(shù)2例(2.99%)，UC相關(guān)黏膜異型增生2例(2.99%)。預(yù)后不良組miR-448的相對(duì)表達(dá)量為1.52±0.39，高于預(yù)后良好組(1.34±0.31)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.103，P=0.039)。miR-448評(píng)估UC患者預(yù)后的AUC、敏感度、特異度、最大約登指數(shù)、最佳截?cái)帱c(diǎn)分別為0.854(95%CI：0.747～0.929)、75.00%、92.31%、0.673、1.55。見圖1。

圖1 miR-448評(píng)估UC患者預(yù)后的ROC曲線

2.5 預(yù)后不良組與預(yù)后良好組的基本資料比較

預(yù)后不良組與預(yù)后良好組在年齡、性別、BMI、吸煙、飲酒、病變范圍、腸道損傷、腸切除術(shù)史、不典型增生、CRP、ESR、IL-15、血紅蛋白、治療方案方面比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；而在肛周病變、家族史、基底漿細(xì)胞增多方面比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見表3。

表3 預(yù)后不良組與預(yù)后良好組的基本資料比較

2.6 影響UC患者預(yù)后的相關(guān)因素

根據(jù)miR-448評(píng)估UC患者預(yù)后的最佳截?cái)帱c(diǎn)(1.55)將其轉(zhuǎn)換為二分類變量。將肛周病變(無=0，有=1)、家族史(無=0，有=1)、基底漿細(xì)胞增多(無=0，有=1)、miR-448(<1.55=0，≥1.55=1)作為自變量，α入=0.05，α出=0.10，將UC患者的預(yù)后情況(預(yù)后良好=0，預(yù)后不良=1)作為因變量納入多因素Logistic回歸模型，結(jié)果顯示肛周病變、miR-448與UC患者預(yù)后密切相關(guān)。見表4。

表4 影響UC患者預(yù)后的因素

3 討論

微RNA(miRNA)是由約22個(gè)核苷酸組成的內(nèi)源性非編碼RNA，在進(jìn)化上趨于保守，通過以序列特異性方式結(jié)合靶基因的特定區(qū)域，從而調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后基因的表達(dá)[13-14]。近年來研究表明miRNA與多種疾病的病理生理過程密切相關(guān)，已成為臨床研究的熱點(diǎn)[15-16]。miR-448為miRNA家族一員，有研究表明其可參與結(jié)直腸癌、心肌病等的發(fā)生、發(fā)展過程[17-18]。有報(bào)道指出，miR-448可誘導(dǎo)NF-κB的活化[10]，而NF-κB過表達(dá)可誘發(fā)腸道免疫性疾病[9]。目前關(guān)于miR-448在UC中的表達(dá)水平及其與UC疾病活動(dòng)度、患者預(yù)后關(guān)系的報(bào)道較少。

本研究結(jié)果顯示，UC患者miR-448相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組，提示miR-448可能與UC的發(fā)生有關(guān)。本研究比較了緩解期與活動(dòng)期患者miR-448的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示活動(dòng)期患者miR-448相對(duì)表達(dá)量高于緩解期，重度組miR-448相對(duì)表達(dá)量高于中度組及輕度組，中度組miR-448相對(duì)表達(dá)量高于輕度組，以上結(jié)果提示miR-448與UC疾病活動(dòng)度可能相關(guān)。此外，本研究對(duì)UC患者的隨訪發(fā)現(xiàn)，預(yù)后不良組患者miR-448相對(duì)表達(dá)量高于預(yù)后良好組，提示檢測miR-448相對(duì)表達(dá)量有助于評(píng)估UC患者預(yù)后。本研究構(gòu)建了miR-448評(píng)估UC患者預(yù)后的ROC曲線，結(jié)果顯示miR-448評(píng)估UC患者預(yù)后的AUC大于0.8，提示miR-448評(píng)估UC患者預(yù)后的效能較高。本研究采用多因素Logistic回歸分析影響UC患者預(yù)后的相關(guān)因素，結(jié)果顯示肛周病變、miR-448與UC患者預(yù)后密切相關(guān)，結(jié)果與既往研究相符[19-20]。

NF-κB的活性狀態(tài)與腸道炎性反應(yīng)密切相關(guān)。機(jī)體處于穩(wěn)態(tài)時(shí)，NF-κB與其抑制因子IκB單體耦聯(lián)，以無活性復(fù)合體形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，受到細(xì)胞外信號(hào)刺激后IκB磷酸化后降解，NF-κB釋放并移入核內(nèi)與靶基因序列上特定的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合[21]，啟動(dòng)或調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子-α及黏附因子-1的基因轉(zhuǎn)錄，介導(dǎo)炎性細(xì)胞因子的活化、趨化、浸潤，參與UC的發(fā)生、發(fā)展過程[22]。有細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，miR-448表達(dá)變化可引起雙向調(diào)節(jié)因子及表皮生長因子水平升高，進(jìn)而介導(dǎo)NF-κB的激活[10]。由此推測，miR-448可能通過誘導(dǎo)NF-κB的活化，參與UC的疾病進(jìn)展。

綜上所述，miR-448與UC疾病活動(dòng)度及患者預(yù)后關(guān)系密切，檢測miR-448表達(dá)水平有助于評(píng)估患者預(yù)后情況。本研究今后將進(jìn)一步分析miR-448參與UC疾病活動(dòng)度及預(yù)后的病理生理機(jī)制。