克羅恩病患者外周血miR-125a水平與疾病活動度的相關(guān)性分析

劉 亮 羅曉雅 李 鵬 張澍田 李春濤

克羅恩病(CD)為自身免疫性腸道疾病，在腸道各個部位均可發(fā)生，尤其好發(fā)于右半結(jié)腸和末端回腸[1]。CD在歐美較中國多見，歐美CD年發(fā)病率為3.1/10萬～14.6/10萬，中國為0.848/10萬，近年來呈升高趨勢[2]。CD以腸道炎性病變?yōu)樘卣?，易反復發(fā)作，目前的治療方法無法治愈[3]，對CD的疾病活動進行長期監(jiān)測有重要的臨床意義。微RNA(miRNA)是一類單鏈非編碼內(nèi)源性的小分子RNA，能廣泛參與細胞增殖、分化、凋亡、遷移等諸多生命活動，并在炎性疾病、自身免疫性疾病、感染性疾病中發(fā)揮重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)miR-125a與自身免疫性疾病密切相關(guān)[4]。另有研究顯示，小鼠敲除miR-125a后其免疫系統(tǒng)失衡，可發(fā)生免疫亢進反應，并可誘發(fā)免疫性結(jié)腸炎、免疫性腦脊髓膜炎等自身免疫性疾病[5]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-125a可通過降低調(diào)節(jié)活化蛋白(RANTES)表達水平抑制系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SE)的發(fā)生、發(fā)展[6]。目前miR-125a與CD的關(guān)系尚不清楚，本研究分析了CD患者外周血miR-125a水平與疾病活動度的相關(guān)性，以期為臨床診治CD提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2017年3月至2020年3月北京市順義區(qū)醫(yī)院收治的183例CD患者，根據(jù)簡化克羅恩病活動指數(shù)(CDAI)[7]分為緩解組(64例，CDAI≤4分)和活動組(119例，CDAI>4分)。緩解組男性45例，女性19例；年齡18～75歲，平均年齡為(47.88±5.75)歲；病程6～60個月，平均病程為(40.12±16.23)個月；平均體質(zhì)量指數(shù)(BMI)為(22.66±3.47)kg/m2；吸煙史19例，飲酒史25例；病變部位位于結(jié)腸11例，回腸29例，回結(jié)腸24例；臨床類型為穿透型10例，狹窄型16例，非狹窄非穿透型38例?；顒咏M男性84例，女性35例；年齡20～78歲，平均年齡為(48.52±5.14)歲；病程6～62個月，平均病程為(40.47±16.12)個月；平均BMI為(22.80±3.51)kg/m2；吸煙史36例，飲酒史48例；病變部位位于結(jié)腸20例，回腸54例，回結(jié)腸45例；臨床類型為穿透型19例，狹窄型17例，非狹窄非穿透型83例。另選擇同期在本院體檢的60名健康者作為對照組，男性43例，女性17例；年齡20～76歲，平均年齡為(49.02±5.58)歲；平均BMI為(22.92±3.47)kg/m2；吸煙史18例，飲酒史24例。3組的性別、年齡、BMI、吸煙史、飲酒史差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。

納入標準：(1)CD的診斷參照《我國炎癥性腸病診斷與治療的共識意見(2012年·廣州)》[1]中相關(guān)診斷標準；(2)病歷資料完整；(3)無其他腸道疾病；(4)心、肝、腎、腦、肺等重要臟器功能正常；(5)簽署知情同意書。排除標準：(1)合并凝血系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤、其他自身免疫性疾病、過敏性疾病、精神性疾病、傳染性疾病、甲狀腺疾病、內(nèi)分泌疾病、代謝性疾??；(2)妊娠期或哺乳期婦女；(3)依從性不好，不能配合完成本研究。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。

簡化CDAI評分標準[7]：包括一般情況(0～4分)、腹痛(0～4分)、腹瀉(每日稀便1次計1分)、腹部腫塊(0～4分)、伴發(fā)疾病(虹膜炎、裂溝、壞疽性膿皮病、新瘺管、膿腫、結(jié)節(jié)性紅斑等)，這5個方面綜合計分，CDAI≤4分判定為CD處于緩解期，CDAI>4分判定為CD處于活動期。

1.2 研究方法

所有受試者入院后，記錄其年齡、性別、吸煙史、BMI、飲酒史、病程等一般資料，采集入院次日清晨空腹外周靜脈血4 mL，采用臺式低速血液離心機(天津鈞星瑞科技有限公司)，3 000 r/min離心10 min，取上清液進行實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(Real-time qRT-PCR)檢測，其步驟為：采用總RNA提取試劑盒(上海雅吉生物科技有限公司)提取血清中的總RNA，檢測總RNA的濃度及純度，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京智杰方遠科技有限公司)將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以此cDNA為模板并參照引物序列(表1)進行PCR擴增。PCR擴增體系為：反應體系共25 μL，cDNA模板5 μL，10×Taq DNA聚合酶反應緩沖液2.5 μL，dNTP 1 μL，10 μmol/L上游引物各0.5 μL，10 μmol/L下游引物0.5 μL，ddH2O 15 μL。PCR反應條件為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性10 s，72 ℃退火延伸30 s，35次循環(huán)。擴增產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，凝膠掃描采集電泳照片，測定各擴增條帶吸光度值。以GAPDH 為內(nèi)參，miR-125a相對表達量=miR-125a擴增條帶吸光度值/GAPDH擴增條帶吸光度值×100%。

表1 引物序列

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 3組外周血miR-125a相對表達量分析

對照組、緩解組、活動組的外周血miR-125a相對表達量分別為0.72±0.23、1.88±0.49、2.96±0.68，組間比較差異有統(tǒng)計學意義(F=338.280，P=0.000)；與對照組比較，緩解組、活動組的外周血miR-125a相對表達量均明顯升高(Q=16.574，P<0.01；Q=36.324，P<0.01)；與緩解組比較，活動組的外周血miR-125a相對表達量升高(Q=17.889，P<0.01)。見圖1。

圖1 3組的外周血miR-125a相對表達量比較

2.2 CD患者的外周血miR-125a相對表達量與疾病活動度的相關(guān)性分析

如圖2所示，CD患者的外周血miR-125a相對表達量與疾病活動度呈正相關(guān)(r=0.872，P<0.001)。

圖2 CD患者的外周血miR-125a相對表達量與疾病活動度的相關(guān)性分析

2.3 活動期CD影響因素的Logistic回歸分析

將變量賦值，包括年齡(<48.52歲=0，≥48.52歲=1)、性別(女=0，男=1)、病程(≥40.47個月=0，<40.47個月=1)、BMI(≥22.80 kg/m2=0，<22.80 kg/m2=1)、吸煙史(無=0，有=1)、飲酒史(無=0，有=1)、病變部位(回結(jié)腸=0，回腸=1，結(jié)腸=2)、臨床類型(非狹窄非穿透型=0，狹窄型=1，穿透型=2)、miR-125a相對表達量(<2.96=0，≥2.96=1)，納入多因素分析，結(jié)果顯示外周血miR-125a相對表達量升高是活動期CD的危險因素(P<0.05)。見表2。

表2 活動期CD影響因素的Logistic回歸分析

2.4 外周血miR-125a預測活動期CD的價值分析

外周血miR-125a預測活動期CD的ROC曲線下面積(AUC)為0.844(95%CI：0.793～0.899)，敏感度為69.92%，特異度為80.06%，陽性預測值為77.81%，陰性預測值為72.69%，準確度為79.14%，截斷值為1.20。見圖3。

圖3 外周血miR-125a預測活動期CD的ROC曲線

3 討論

CD由遺傳易感性、免疫系統(tǒng)紊亂、環(huán)境因素共同作用所致，臨床表現(xiàn)為腹部包塊、腹痛、腹瀉、發(fā)熱、瘺管、肛門病變等，可累及皮膚、肝臟、視覺、關(guān)節(jié)等系統(tǒng)，并發(fā)腸梗阻、大量便血、急性穿孔等，嚴重時可危及生命[8]。CD具有難治愈性、慢性復發(fā)性等特點，病情監(jiān)測尤為重要。目前臨床監(jiān)測CD病情的方法多為侵入性檢查，具有操作繁瑣、檢查時間長、費用較高等缺點，限制了臨床推廣應用[9]。近年來多種血清分子標志物檢測逐漸應用于CD的診療中，但其特異度和敏感度不高，在中國尚未納入常規(guī)檢查中，故亟需深入探究更有價值的血清學分子標志物[10]。

miRNA是進化上高度保守的內(nèi)源性非編碼小分子RNA，可通過與靶mRNA互補結(jié)合，阻止其翻譯，對基因進行轉(zhuǎn)錄后表達調(diào)控，其還在細胞的生物學行為、機體應激、某些疾病(如惡性腫瘤、炎性疾病、自身免疫性疾病、心血管疾病、感染性疾病)的病理生理過程中發(fā)揮著重要作用[11]。人類基因組中近30%基因受到miRNA的調(diào)控。miR-125a是近年來研究較多的miRNA，其定位于19q13，根據(jù)不同的轉(zhuǎn)錄方向可產(chǎn)生miR-125a-3p和miR-125a-5p[12]。研究顯示，miR-125a在部分惡性血液疾病中表達異常，如淋巴瘤、白血病、多發(fā)性骨髓瘤等，并能抑制這些腫瘤細胞增殖和轉(zhuǎn)移[13]。此外，在CD、潰瘍性結(jié)腸炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病患者中也發(fā)現(xiàn)miR-125a水平異常[14-16]。研究顯示，miR-125a敲除后可上調(diào)信號轉(zhuǎn)導及轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)、白細胞介素-13(IL-13)、干擾素-γ(IFN-γ)水平，打破T細胞介導的免疫平衡，從而引發(fā)自身免疫性疾病[5]。另有研究報道，miR-125a在橋本甲狀腺炎患者中表達降低，并與甲狀腺球蛋白抗體(TgAb)呈負相關(guān)[17]。本研究顯示，緩解組和活動組的外周血miR-125a相對表達量均較對照組明顯升高(P均<0.01)，提示miR-125a在CD患者外周血中呈高表達，miR-125a可能參與了CD的發(fā)生。本研究還顯示，活動組的外周血miR-125a相對表達量較緩解組明顯升高(P<0.01)，提示CD患者的外周血miR-125a表達水平可能與疾病活動度呈正相關(guān)，后續(xù)進行的Spearman相關(guān)性分析證實了這一推論。本研究Logistic回歸分析顯示，外周血miR-125a相對表達量升高是活動期CD的危險因素，提示外周血miR-125a表達水平升高可能提高CD進展的風險。白細胞介素-23受體(IL-23R)已被證實為CD的易感基因，IL-23R及其配體IL-23在腸道慢性炎性疾病尤其是CD的發(fā)病過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，IL-23R的單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點rs7517847與CD有明顯關(guān)聯(lián)[18]。研究發(fā)現(xiàn)miR-125a能靶向調(diào)控IL-23R的表達，因此推測miR-125a可能通過上調(diào)IL-23R來增加CD的發(fā)病風險[17]。此外，本研究顯示外周血miR-125a相對表達量預測活動期CD的AUC為0.844，敏感度為69.92%，特異度為80.06%，準確度為79.14%，提示外周血miR-125a表達水平對CD病情有較高的評估價值，外周血miR-125a水平檢測有助于了解CD病情活動度，當外周血miR-125a的相對表達量>1.20時，臨床醫(yī)師應及時給予干預，從而延緩病情進展。

綜上所述，CD患者的外周血miR-125a水平與病情活動度呈正相關(guān)，miR-125a有潛力作為評估CD病情的指標。本研究尚存在樣本量較小、研究時間較短等不足，今后需深入進行相關(guān)研究。