炎癥性腸病患者血清miR-181a-5p和miR-126表達(dá)水平及其與腸道菌群相關(guān)性的研究

崔 昭 梁 博 李國(guó)東 李會(huì)榮

炎癥性腸病(IBD)為腸道慢性炎性疾病，包括潰瘍性腸炎(UC)與克羅恩病(CD)，其臨床癥狀主要為腹瀉、腹痛、血便等，目前IBD的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確[1-2]。研究顯示腸道黏膜免疫異?？梢l(fā)炎性反應(yīng)，而腸道菌群異?？蓪?dǎo)致免疫紊亂[3]，因此深入分析腸道菌群組成變化與IBD發(fā)病的相關(guān)性具有重要意義。既往研究顯示微RNA(miRNA)在IBD發(fā)生過程中發(fā)揮著重要作用[4-5]。miR-181a-5p在急性胰腺炎模型細(xì)胞中呈高表達(dá)，可導(dǎo)致細(xì)胞炎性損傷[6]。研究表明miR-126在支氣管哮喘患者的血漿中表達(dá)異常，并參與了炎性疾病的發(fā)生、發(fā)展[7]。目前miR-181a-5p、miR-126在IBD血清中的表達(dá)情況尚不明確。因此，本研究主要探討miR-181a-5p、miR-126在IBD患者血清中的表達(dá)水平及其與腸道菌群的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2016年10月至2018年12月保定市第二醫(yī)院收治的100例活動(dòng)期IBD患者作為研究組，所有患者均符合相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]，其中男性56例，女性44例，年齡25～60歲，平均年齡為(43.26±5.48)歲；研究組中包括60例UC患者(UC組)和40例CD患者(CD組)；60例UC患者中，男性31例，女性29例，年齡25～58歲，平均年齡為(44.16±6.12)歲；40例CD患者中，男性25例，女性15例，年齡28～60歲，平均年齡為(42.16±7.11)歲。另選擇同期于本院體檢的50名健康志愿者作為對(duì)照組，其中男性30名，女性20名，年齡23～60歲，平均年齡為(45.26±7.48)歲。各組年齡、性別的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有入組者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 采集血液樣本 抽取所有入組者清晨空腹靜脈血5 mL，4 ℃條件下1 000 r/min離心10 min，吸取血清置于離心管內(nèi)，保存于-20 ℃冰箱內(nèi)。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)miR-181a-5p、miR-126表達(dá)水平 采用TRIzol法提取血清中的總RNA，應(yīng)用Nanodrop2000c超微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度。引物序列見表1，引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)合成。反轉(zhuǎn)錄體系：5×gDNA Buffer 2 μL，10×King RT Buffer 2 μL，F(xiàn)astKing RT Enzyme Mix 1 μL，F(xiàn)Q-RT Primer Mix 2 μL，RNA 2 μg，RNase-Free ddH2O補(bǔ)足體系至20 μL；反應(yīng)條件：42 ℃ 15 min，95 ℃ 3 min。反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time qPCR)擴(kuò)增，反應(yīng)體系：2×SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 10 μL，cDNA 2 μL，上下游引物各0.8 μL，50×ROX Reference Dye 0.4 μL，ddH2O 6 μL；反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min預(yù)變性，之后95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-181a-5p、miR-126的相對(duì)表達(dá)量。TRIzol試劑、反轉(zhuǎn)錄與PCR試劑盒均購(gòu)自大連寶生物工程有限公司。

表1 引物序列

1.2.3 細(xì)菌培養(yǎng)與鑒定 采集所有入組者糞便10 g，置于厭氧罐內(nèi)，采用日本光岡知足法培養(yǎng)細(xì)菌，本研究選用以下腸道菌群進(jìn)行培養(yǎng)：腸球菌屬、酵母菌屬、擬桿菌屬、雙歧桿菌屬、消化球菌屬、乳桿菌屬、小梭菌屬、真桿菌屬、腸桿菌屬、葡萄球菌屬。細(xì)菌經(jīng)革蘭染色、生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行陽性判斷，并計(jì)算樣本中各菌屬水平。菌落數(shù)據(jù)取其對(duì)數(shù)值lgN(CFU/g)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組血清miR-181a-5p、miR-126表達(dá)比較

與對(duì)照組相比，研究組、UC組、CD組的血清miR-181a-5p、miR-126的相對(duì)表達(dá)量均顯著升高(P均<0.05)。見表2。

表2 各組血清miR-181a-5p、miR-126相對(duì)表達(dá)量比較()

2.2 各組菌群數(shù)量比較

與對(duì)照組相比，UC組腸球菌屬、酵母菌屬、擬桿菌屬、雙歧桿菌屬、消化球菌屬、乳桿菌屬、小梭菌屬數(shù)量顯著增多(P<0.05)，CD組腸球菌屬、酵母菌屬、擬桿菌屬、雙歧桿菌屬、消化球菌屬、乳桿菌屬數(shù)量顯著增多(P<0.05)。見表3。

表3 各組菌群數(shù)量比較(lgN)

2.3 各組菌群培養(yǎng)陽性率比較

細(xì)菌培養(yǎng)與鑒定結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，UC組擬桿菌屬、雙歧桿菌屬、消化球菌屬、乳桿菌屬的培養(yǎng)陽性率顯著升高(P<0.05)；與對(duì)照組相比，CD組酵母菌屬、雙歧桿菌屬、消化球菌屬、乳桿菌屬的培養(yǎng)陽性率顯著升高(P<0.05)。見表4。

表4 各組菌群陽性率比較

2.4 血清miR-181a-5p、miR-126不同表達(dá)組的菌群數(shù)量比較

根據(jù)miR-181a-5p、miR-126表達(dá)水平的平均數(shù)(2.58、2.64)將患者分為miR-181a-5p高表達(dá)組和miR-181a-5p低表達(dá)組、miR-126高表達(dá)組和miR-126低表達(dá)組。與miR-181a-5p低表達(dá)組相比，miR-181a-5p高表達(dá)組腸球菌屬、酵母菌屬、葡萄球菌屬的數(shù)量顯著增多(P<0.05)；與miR-126低表達(dá)組相比，miR-126高表達(dá)組腸球菌屬、雙歧桿菌屬、消化球菌屬、葡萄球菌屬的數(shù)量顯著增多(P<0.05)。見表5。

表5 IBD患者血清miR-181a-5p、miR-126不同表達(dá)組間菌群數(shù)量比較[lgN，]

2.5 血清miR-181a-5p、miR-126表達(dá)與菌群數(shù)量的相關(guān)性分析

采用Pearson法分析IBD患者血清miR-181a-5p、miR-126表達(dá)水平與菌群數(shù)量的相關(guān)性，結(jié)果顯示血清miR-181a-5p表達(dá)水平與腸球菌屬、酵母菌屬、雙歧桿菌屬、腸桿菌屬呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，血清miR-126表達(dá)水平與消化球菌屬、葡萄球菌屬呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。見表6。

表6 血清miR-181a-5p、miR-126表達(dá)與菌群數(shù)量的相關(guān)性

3 討論

miRNA在IBD患者血清中異常表達(dá)，其表達(dá)水平與機(jī)體炎性反應(yīng)密切相關(guān)[9-10]。但miRNA表達(dá)水平與IBD患者腸道菌群的相關(guān)性研究相對(duì)較少。因此，本研究探討了miR-181a-5p、miR-126在IBD患者血清中的表達(dá)水平，并分析其與IBD患者腸道菌群的相關(guān)性，為揭示IBD發(fā)病機(jī)制提供參考。

miR-181a-5p在血管炎性疾病、膿毒癥等多種疾病中表達(dá)上調(diào)，并可促進(jìn)炎性反應(yīng)的發(fā)生[11-12]。與上述研究結(jié)果相似，本研究結(jié)果顯示miR-181a-5p在IBD患者血清中呈高表達(dá)，提示miR-181a-5p表達(dá)水平升高可能促進(jìn)IBD的發(fā)生。研究表明miR-126在消化系統(tǒng)疾病患者中表達(dá)異常并可促進(jìn)IBD的發(fā)生[13]。另有研究指出miR-126在支氣管肺炎患者血清中表達(dá)水平升高，并可能促進(jìn)炎性反應(yīng)[14]。本研究結(jié)果顯示IBD患者血清miR-126表達(dá)水平升高，提示miR-126表達(dá)水平升高可能參與IBD發(fā)生過程。腸道菌群可形成相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)并可保護(hù)腸道健康，若腸道環(huán)境發(fā)生改變可引起腸道菌群組成異常，進(jìn)而促使腸道微生態(tài)破壞而導(dǎo)致腸道感染的發(fā)生[15]。本研究結(jié)果顯示UC組腸球菌屬、酵母菌屬、擬桿菌屬、雙歧桿菌屬、消化球菌屬、乳桿菌屬、小梭菌屬數(shù)量顯著多于對(duì)照組，CD組腸球菌屬、酵母菌屬、擬桿菌屬、雙歧桿菌屬、消化球菌屬、乳桿菌屬數(shù)量顯著多于對(duì)照組；UC組擬桿菌屬、雙歧桿菌屬、消化球菌屬、乳桿菌屬的培養(yǎng)陽性率顯著高于對(duì)照組，CD組酵母菌屬、雙歧桿菌屬、消化球菌屬、乳桿菌屬的培養(yǎng)陽性率顯著高于對(duì)照組，與相關(guān)報(bào)道結(jié)果相符[16]。這提示IBD患者存在腸道菌群失調(diào)，分析原因可能是腸道菌群中致病菌數(shù)量增加可破壞腸道微生態(tài)造成腸黏膜功能障礙，研究表明腸黏膜功能障礙的發(fā)生可降低機(jī)體免疫力，從而促進(jìn)腸道炎性反應(yīng)的發(fā)生[17]。本研究結(jié)果顯示miR-181a-5p和miR-126高表達(dá)組的腸球菌屬、葡萄球菌屬數(shù)量顯著高于低表達(dá)組，進(jìn)一步分析miR-181a-5p、miR-126表達(dá)水平與菌群數(shù)量的相關(guān)性，結(jié)果顯示miR-181a-5p表達(dá)水平與腸球菌屬、酵母菌屬、雙歧桿菌屬、腸桿菌屬呈負(fù)相關(guān)，miR-126表達(dá)水平與消化球菌屬、葡萄球菌屬呈負(fù)相關(guān)，提示IBD患者血清miR-181a-5p、miR-126水平與腸道菌群組成的變化密切相關(guān)。分析原因可能為菌群數(shù)量改變導(dǎo)致腸道黏膜功能障礙，造成腸道免疫應(yīng)答功能紊亂，而腸道菌群可參與機(jī)體糖脂代謝過程，血清miR-181a-5p、miR-126水平升高可促進(jìn)炎性反應(yīng)的發(fā)生，促進(jìn)IBD發(fā)生，進(jìn)而導(dǎo)致腸道功能障礙。

綜上所述，IBD患者血清中miR-181a-5p與miR-126的表達(dá)水平升高，兩者表達(dá)水平與腸道菌群組成變化密切相關(guān)，其具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探究。