過(guò)表達(dá)miR-140-5p對(duì)高脂飼養(yǎng)誘導(dǎo)的非酒精性脂肪性肝病大鼠的作用及機(jī)制

盧的一 郭茂東 葉曉華

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是一種常見(jiàn)的肝病，若不及時(shí)加以控制，易隨病程進(jìn)展為肝纖維化、肝硬化，甚至肝細(xì)胞癌[1]。目前，全球約三分之一人口患有不同程度的NAFLD[2-4]。雖然通過(guò)增加運(yùn)動(dòng)量、控制飲食及應(yīng)用法尼醇X受體(FXR)激動(dòng)劑可在一定程度上抑制NAFLD進(jìn)展，但仍無(wú)法起到保護(hù)肝臟的作用[5]。因此，臨床上迫切需要一種安全、有效且適用面廣的治療方式用于NAFLD的治療。已有多項(xiàng)研究表明，Toll樣受體4(TLR4)/核因子-κB(NF-κB)信號(hào)通路參與了NAFLD的發(fā)病及進(jìn)展[6-7]。另有研究指出，miR-140-5p可靶向TLR4/NF-κB信號(hào)通路，調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞因子水平[8-9]。目前關(guān)于miR-140-5p是否可通過(guò)調(diào)控TLR4/NF-κB信號(hào)通路參與NAFLD的發(fā)病及進(jìn)展的報(bào)道較少。本研究探討了過(guò)表達(dá)miR-140-5p對(duì)NAFLD大鼠的作用及其機(jī)制與TLR4/NF-κB信號(hào)通路的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取44只SD大鼠，SPF級(jí)，雌雄各半，購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(粵)2018-0002]。44只大鼠均適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，控制晝夜交替頻率為12 h，期間給予充足的水和普通飼料飼養(yǎng)。

1.2 造模及分組

從44只SD大鼠中隨機(jī)選取34只，高脂飼料飼養(yǎng)12周，構(gòu)建NAFLD大鼠模型[10]。飼養(yǎng)12周末，隨機(jī)選取4只大鼠處死，采用蘇木精-伊紅(HE)染色法判斷NAFLD大鼠模型是否構(gòu)建成功。將造模成功的30只大鼠隨機(jī)分為模型組、空載體組和過(guò)表達(dá)組，每組10只。空載體組于飼養(yǎng)第13周、第18周尾靜脈注射含空載質(zhì)粒的慢病毒，過(guò)表達(dá)組于飼養(yǎng)第13周、第18周尾靜脈注射含過(guò)表達(dá)miR-140-5p質(zhì)粒的慢病毒。剩余10只大鼠為對(duì)照組，給予普通飼料飼養(yǎng)。

1.3 HE染色

在飼養(yǎng)第18周末，各組禁食不禁水12 h后，用2%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，處死大鼠，取其肝臟組織，用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，然后使用RM2016病理組織切片機(jī)(購(gòu)自上海徠卡儀器有限公司)切片。取病理切片，脫蠟，梯度乙醇水化，HE染色(試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司)，觀察肝臟組織病理學(xué)變化[11]。

1.4 肝功能及血脂相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)

處死大鼠后，取各組大鼠心臟靜脈血5 mL，以3 500 r/min離心15 min，取上層清液。采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的表達(dá)水平。上述實(shí)驗(yàn)所用試劑盒均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.5 肝組織中TLR4、NF-κB的檢測(cè)

采用蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)肝組織中TLR4、NF-κB的表達(dá)水平[12]。將RIPA裂解液滴加至盛有肝組織的容器中，提取總蛋白，并用BCA蛋白質(zhì)定量檢測(cè)試劑盒(購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行定量。滴加勻漿緩沖液，4 ℃下以3 500 r/min離心15 min，取上清液；電泳100 min，漂洗3次，轉(zhuǎn)膜；分別滴加兔抗鼠TLR4單克隆抗體、兔抗鼠NF-κB單克隆抗體、β肌動(dòng)蛋白(購(gòu)自美國(guó)Abcam公司)，4 ℃孵育過(guò)夜；滴加二抗(購(gòu)自美國(guó)Abcam公司)，室溫孵育2 h；曝光顯影，采用ImageJ軟件進(jìn)行分析。

1.6 肝組織中miR-140-5p的檢測(cè)

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)肝組織中miR-140-5p的表達(dá)水平[13]。應(yīng)用TRIzol試劑盒提取各組肝組織中的總RNA，然后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，最后用PCR擴(kuò)增儀擴(kuò)增cDNA，擴(kuò)增條件為94 ℃預(yù)變性10 min，之后94 ℃ 45 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，共40個(gè)循環(huán)。內(nèi)參為β肌動(dòng)蛋白。采用 2-ΔΔCt表示肝組織中miR-140-5p的相對(duì)表達(dá)量。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組肝組織病理學(xué)變化

HE染色結(jié)果顯示，對(duì)照組肝細(xì)胞排列正常，肝細(xì)胞內(nèi)無(wú)脂肪堆積，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等情況；模型組和空載體組的肝細(xì)胞內(nèi)均有大量脂肪堆積，存在明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況，且有肝細(xì)胞壞死；過(guò)表達(dá)組有輕微脂肪堆積和少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，較模型組有明顯改善。具體見(jiàn)圖1。

圖1 各組肝組織病理圖像 HE染色 ×400 A 對(duì)照組 B 模型組 C 空載體組 D 過(guò)表達(dá)組

2.2 各組miR-140-5p的相對(duì)表達(dá)量比較

對(duì)照組、模型組、空載體組和過(guò)表達(dá)組的肝組織中miR-140-5p的相對(duì)表達(dá)量分別為1.02±0.05、0.48±0.08、0.50±0.11和2.31±0.10。與對(duì)照組比較，模型組肝組織中miR-140-5p的相對(duì)表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組和空載體組比較，過(guò)表達(dá)組肝組織中miR-140-5p的相對(duì)表達(dá)量升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。

2.3 各組肝功能及血脂水平比較

與對(duì)照組比較，模型組AST、ALT、TC、TG和LDL-C表達(dá)水平均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。與模型組和空載體組比較，過(guò)表達(dá)組AST、ALT、TC、TG和LDL-C水平均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組AST、ALT、TC、TG和LDL-C表達(dá)水平比較()

2.4 各組IL-6、TNF-α的表達(dá)水平比較

與對(duì)照組比較，模型組IL-6、TNF-α的表達(dá)水平均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。與模型組和空載體組比較，過(guò)表達(dá)組IL-6、TNF-α的表達(dá)水平均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組IL-6、TNF-α的表達(dá)水平比較()

2.5 各組肝組織中TLR4、NF-κB的相對(duì)表達(dá)量比較

與對(duì)照組比較，模型組肝組織中TLR4、NF-κB的相對(duì)表達(dá)量均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。與模型組和空載體組比較，過(guò)表達(dá)組肝組織中TLR4、NF-κB的相對(duì)表達(dá)量均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見(jiàn)表4、圖2。

表4 各組肝組織中TLR4、NF-κB的相對(duì)表達(dá)量比較()

圖2 各組肝組織中TLR4、NF-κB的蛋白電泳圖 A 對(duì)照組 B 模型組 C 空載體組 D 過(guò)表達(dá)組

3 討論

NAFLD是一種除外過(guò)量飲酒和其他明確的損肝因素所致的，以肝臟脂質(zhì)變性和脂肪過(guò)度貯積為特征的臨床綜合征[14]。研究顯示，全球NAFLD的發(fā)病率呈逐年升高趨勢(shì)，西方國(guó)家NAFLD發(fā)病率為20%～30%，近年來(lái)中國(guó)NAFLD發(fā)病率明顯升高，且有年輕化趨勢(shì)[15]。目前，有關(guān)NAFLD的病因及進(jìn)展的機(jī)制尚未完全闡明，針對(duì)NAFLD的治療尚缺少直接、有效的治療方案。

微RNA(miRNA)是一種由18～25個(gè)核苷酸組成的不具備編碼蛋白質(zhì)功能的RNA，具有調(diào)控細(xì)胞增殖、遷移、凋亡等多種生物學(xué)功能[16]。miR-140-5p作為miRNA中一員，已被報(bào)道可通過(guò)靶向轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞分化[17]，還參與了肝細(xì)胞癌、結(jié)直腸癌的疾病進(jìn)展過(guò)程[18-19]。本研究主要就miR-140-5p對(duì)參與NAFLD發(fā)病及進(jìn)展的TLR4/NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用進(jìn)行初步探究。

本研究通過(guò)HE染色法觀察各組大鼠肝組織病理學(xué)變化，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)組肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)堆積及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況均較模型組和空載體組有明顯改善，提示過(guò)表達(dá)miR-140-5p對(duì)NAFLD有保護(hù)作用，可改善NAFLD肝組織病變。通過(guò)檢測(cè)各組AST、ALT、TC、TG、LDL-C的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)組AST、ALT、TC、TG、LDL-C的表達(dá)水平低于模型組，提示過(guò)表達(dá)miR-140-5p可改善高脂飼養(yǎng)誘導(dǎo)的NAFLD大鼠肝臟功能和脂質(zhì)代謝紊亂狀態(tài)。有研究表明，TNF-α在NAFLD患者中高表達(dá)，且與其進(jìn)展為非酒精性脂肪性肝炎密切相關(guān)；此外，TNF-α基因多態(tài)性與較高的胰島素抵抗指數(shù)關(guān)系密切，兩者相互作用參與了NAFLD的發(fā)病及進(jìn)展過(guò)程[20]。IL-6不僅可促進(jìn)肝組織再生，同時(shí)還可以通過(guò)誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡和胰島素抵抗等刺激肝組織損傷，進(jìn)而導(dǎo)致NAFLD進(jìn)展為非酒精性脂肪性肝炎[20]。本研究結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)組的IL-6、TNF-α表達(dá)水平均低于模型組，提示過(guò)表達(dá)miR-140-5p可降低高脂飼養(yǎng)誘導(dǎo)的NAFLD大鼠炎性細(xì)胞因子水平，進(jìn)而發(fā)揮保護(hù)作用。

TLR4是細(xì)胞表面識(shí)別病原體的受體之一，對(duì)革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁成分脂多糖尤為敏感。NAFLD患者腸道菌群多處于紊亂狀態(tài)，進(jìn)而可產(chǎn)生大量的脂多糖。脂多糖可刺激TLR4表達(dá)并與之結(jié)合激活NF-κB表達(dá)，從而刺激大量炎性細(xì)胞因子合成、分泌，誘發(fā)肝臟炎性反應(yīng)，致使肝細(xì)胞壞死，肝部損傷[21]。本研究結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)組肝組織中TLR4、NF-κB的相對(duì)表達(dá)量均低于模型組，提示過(guò)表達(dá)miR-140-5p可能通過(guò)抑制TLR4和NF-κB的表達(dá)，從而降低炎性細(xì)胞因子水平，改善肝臟炎性損傷。

綜上所述，過(guò)表達(dá)miR-140-5p可改善高脂飼養(yǎng)誘導(dǎo)的NAFLD大鼠肝臟功能，糾正其脂質(zhì)代謝紊亂，減輕炎性反應(yīng)，其機(jī)制可能與調(diào)控TLR4和NF-κB的表達(dá)水平有關(guān)。固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c信號(hào)通路、腸道菌群紊亂及脂聯(lián)素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等均與NAFLD發(fā)病有關(guān)，今后本課題組將進(jìn)一步探究miR-140-5p對(duì)上述通路的影響，全面闡釋miR-140-5p與NAFLD的關(guān)系。