苯甲酸雌二醇對(duì)新吉富羅非魚雌性化的影響

王茂元，黃洪貴，鐘全福，田 田，吳妹英

(福建省淡水水產(chǎn)研究所，福建 福州 350002)

魚類生長(zhǎng)普遍存在著雌雄個(gè)體差異現(xiàn)象，有的表現(xiàn)為雄性生長(zhǎng)速度快，成年個(gè)體大于雌性，例如羅非魚(Oreochromisspp.)、黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)、烏鱧(Channaargus)等；有的表現(xiàn)為雌性生長(zhǎng)速度快，成年個(gè)體大于雄性，例如鯉(Cyprinuscarpio)、泥鰍(Misgurnusanguillicaudatus)、半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis)等。因此，控制魚類性別和加快單性別養(yǎng)殖對(duì)其產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。

羅非魚因具有適應(yīng)性強(qiáng)、生長(zhǎng)快、肉質(zhì)鮮嫩等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為被全世界廣泛養(yǎng)殖的魚類之一，在淡水養(yǎng)殖中占有重要地位，是我國(guó)南方地區(qū)重要的出口創(chuàng)匯品種。由于雄性羅非魚生長(zhǎng)速度快于雌性，因此，開發(fā)單雄性羅非魚一直是羅非魚養(yǎng)殖業(yè)十分關(guān)注的焦點(diǎn)。目前，羅非魚雄性化苗種生產(chǎn)中用到的方法主要有人工挑選、種間雜交、雄性誘導(dǎo)和三系配套技術(shù)，其中三系配套技術(shù)中，假雌性魚的獲得最為關(guān)鍵，常用的方法是通過外源雌激素進(jìn)行人工誘導(dǎo)。而有關(guān)使用雌激素誘導(dǎo)羅非魚雌化的研究已有相關(guān)報(bào)道，但使用的激素、方法以及試驗(yàn)魚各不相同。在二十世紀(jì)八九十年代，國(guó)內(nèi)一些專家[1-3]就用口服苯甲酸雌二醇(Estradiol benzoate，EB)的方法成功誘導(dǎo)了莫桑比克羅非魚(Oreochromismossambicus)雌性化；也有一些學(xué)者通過使用乙烯雌酚(Diethylstilbesterole，DES)[4-5]、乙炔基雌二醇(Ethinylestradiol，EE2)[6]、雌酮(Estrone，E1)[7]投喂尼羅羅非魚(O.niloticu)的方法誘導(dǎo)其雌性化。

由于DES等具有很強(qiáng)的毒性，已被禁止在生產(chǎn)中使用[3-4]，而雌二醇是魚類內(nèi)源性激素[8]，對(duì)硬骨魚類性別決定與分化起重要作用。在美國(guó)、日本、以色列等國(guó)家，關(guān)于利用類固醇激素控制羅非魚性別[9]的研究已經(jīng)廣泛存在，且比較成熟。雖然我國(guó)將苯甲酸雌二醇列為食品動(dòng)物禁用獸藥，但規(guī)定是指以促生長(zhǎng)為目的的使用受到禁止，而在制種的過程中并未禁止。因此，本研究以苯甲酸雌二醇作為誘導(dǎo)激素，設(shè)定不同誘導(dǎo)濃度和時(shí)間梯度，通過口服、浸浴方法研究其對(duì)新吉富羅非魚雌性化的影響，為將來利用三系配套技術(shù)進(jìn)行全雄性羅非魚制種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)魚種取自由同一對(duì)親魚生產(chǎn)的卵黃囊剛吸收完的第0天新吉富羅非魚苗，該親魚從上海海洋大學(xué)水產(chǎn)動(dòng)物種質(zhì)試驗(yàn)站引進(jìn)。苯甲酸雌二醇(EB)為分析純，購(gòu)自湖北遠(yuǎn)城藥業(yè)有限公司。

1.2 受精卵的獲取與孵化

選擇繁育用雌、雄新吉富羅非魚親魚，在2.0 m×1.0 m×1.5 m的網(wǎng)箱中進(jìn)行配對(duì)繁殖，雌雄配比為1∶2。配對(duì)完成后15 d左右，每日檢查雌魚口中是否有受精卵，一旦觀察到受精卵，立即從其口中取出，放置在0.45 m×0.35 m×0.30 m孵化缸中進(jìn)行孵化，水溫(25.0±0.5)℃。

1.3 含有EB飼料的配制

試驗(yàn)前將EB溶于95%酒精中，待充分溶解后，使用噴壺均勻地噴灑在鰻魚配合飼料上，混合均勻后，在室溫下晾曬，待酒精揮發(fā)后，裝袋冷藏備用。

1.4 雌性化誘導(dǎo)試驗(yàn)

1.4.1 口服含有EB飼料的雌性化誘導(dǎo)

隨機(jī)取出剛孵化的新吉富羅非魚苗3 000尾，分成3組。Ⅰ組飽食投喂50 mg/kg EB的激素飼料，30 d后取180尾平均分成3組，投喂不含激素的正常飼料；剩余的魚苗繼續(xù)投喂含有激素的飼料，60 d后取180尾平均分成3組，投喂不含激素的正常飼料；剩余的魚苗繼續(xù)投喂含有激素的飼料，90 d后取180尾平均分成3組，投喂不含激素的正常飼料。Ⅱ組和Ⅲ組分別投喂100 mg/kg EB、150 mg/kg EB的激素飼料，方法同Ⅰ組。對(duì)照組全程投喂不含EB的人工配合飼料。試驗(yàn)在100 m2水泥池網(wǎng)箱中進(jìn)行，網(wǎng)箱規(guī)格為2.0 m×1.0 m×1.0 m，試驗(yàn)期間水溫范圍在25～29℃之間。

1.4.2 浸浴含有EB的雌性化誘導(dǎo)

取剛孵化的新吉富羅非魚苗分別放進(jìn)含有50、100、150 μg/L EB的養(yǎng)殖水體中浸浴培育，每種浸浴濃度設(shè)置3個(gè)平行，每個(gè)平行60尾魚苗，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組。浸浴培養(yǎng)時(shí)間為30 d，隨后轉(zhuǎn)入正常方式培養(yǎng)。

1.5 性別鑒定

性別判定采用觀察生殖孔和性腺染色鏡檢[10]雙重判定標(biāo)準(zhǔn)，雌魚腹部后下方、臀鰭前方有3個(gè)孔，分別為肛門、生殖孔和泌尿孔，而雄魚只有肛門和泌尿孔。泌尿孔在生殖突的頂端，生殖孔位于肛門和泌尿孔之間，為一字形的狹長(zhǎng)開口，與生殖突垂直。為保證本實(shí)驗(yàn)的可靠性，當(dāng)魚生長(zhǎng)至15 cm時(shí)再進(jìn)行性別鑒定。性腺染色判定標(biāo)準(zhǔn)見圖1。

注：A.10×10倍鏡下雌性羅非魚性腺壓片圖；a.卵原細(xì)胞；B.10×10倍鏡下雄性羅非魚性腺壓片圖；b.精原細(xì)胞。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

利用Excel 2007和SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理與檢驗(yàn)分析，用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(M±SD)表示，顯著性水平設(shè)置為α=0.05。用單因子方差分析(One-way ANOVA)比較雌性率和成活率的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 口服含有EB飼料的雌性化誘導(dǎo)效果

從表1可以看出，口服EB飼料的濃度和投喂時(shí)間均對(duì)新吉富羅非魚雌性化誘導(dǎo)存在不同程度的影響。從雌性率來看，無論從處理濃度還是處理時(shí)長(zhǎng)，3個(gè)試驗(yàn)處理組與對(duì)照組均存在極顯著差異(P<0.01)，且均高于對(duì)照組，其中150 mg/kg飼料處理組投喂90 d的雌性率最高為94.45%，比對(duì)照組的46.11%高49.34%，50 mg/kg飼料處理組投喂30 d的雌性率最低為65.00%，但與對(duì)照組相比仍高出17.22%；各個(gè)處理組間，口服50 mg/kg飼料處理組的雌性率隨著投喂時(shí)間延長(zhǎng)而增高，投喂60 d和90 d的雌性率均與投喂30 d的雌性率差異極顯著(P<0.01)，但60 d和90 d的雌性率之間無明顯差異(P>0.05)；同樣，口服100 mg/kg和150 mg/kg飼料處理組的雌性率發(fā)展趨勢(shì)與50 mg/kg飼料處理組基本一致，但雌性率均高于50 mg/kg飼料處理組，且存在極顯著差異(P<0.01)。

另外，從成活率方面來看，口服含有EB飼料的試驗(yàn)處理組與對(duì)照組均未有顯著差異(P>0.05)，且未發(fā)現(xiàn)畸形魚，表明口服苯甲酸雌二醇未對(duì)羅非魚造成畸形傷害。

表1 不同藥物濃度對(duì)新吉富羅非魚雌性化誘導(dǎo)結(jié)果比較

2.2 浸浴含有EB的雌性化誘導(dǎo)效果

從表2可以看出，浸浴在含有EB的水體中培養(yǎng)新吉富羅非魚30 d，不同藥物濃度對(duì)雌性化誘導(dǎo)存在不同程度的差異。三個(gè)浸浴梯度的雌性率隨著浸浴濃度的升高，雌性率逐漸升高，且均極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)；處理組中，使用50 μg/L浸浴濃度雌性率為63.33%，顯著低于100 μg/L和150 μg/L的雌性率；但100 μg/L和150 μg/L之間，雌性率無顯著差異(P>0.05)。各處理組與對(duì)照之間羅非魚的成活率未有顯著差異(P>0.05)，且未見畸形魚，表明浸浴苯甲酸雌二醇未對(duì)羅非魚造成畸形傷害。

表 2 不同浸浴濃度對(duì)新吉富羅非魚雌性化誘導(dǎo)結(jié)果比較

2.3 投喂與浸浴含有EB的雌性化誘導(dǎo)效果比較

從表3可以看出，在30 d的雌性誘導(dǎo)過程中，投喂與浸浴含有EB對(duì)新吉富羅非魚雌性化誘導(dǎo)的效果不一致。通過投喂含有EB飼料的方法與浸浴含有EB的方法進(jìn)行雌性化誘導(dǎo)，結(jié)果顯示，在相同誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)劑量條件下，口服方法的雌性化率均高于浸浴方法。三個(gè)誘導(dǎo)梯度中，口服100 mg/kg EB的雌性率顯著高于浸浴100 μg/L的雌性化率(P<0.01)，而其余兩個(gè)梯度之間雌性化率差異不顯著(P>0.05)。

表 3 口服與浸浴對(duì)新吉富羅非魚雌性化誘導(dǎo)結(jié)果比較

3 討論

在魚類的性別決定與分化中起關(guān)鍵作用的是遺傳物質(zhì)，但其也受到環(huán)境因素的影響。特別是外源激素可以起到性逆轉(zhuǎn)的作用，Yamamoto最先報(bào)道了通過外源雌激素或雄激素處理青鳉(Oryziaslatipes)導(dǎo)致性逆轉(zhuǎn)[11]，后來其他學(xué)者也在魚類性逆轉(zhuǎn)的研究中發(fā)現(xiàn)，在性腺性分化的關(guān)鍵時(shí)期，通過使用外源激素在處理受精卵、仔魚、稚魚，可以導(dǎo)致雄魚的雌性化或雌魚的雄性化[12-14]。激素誘導(dǎo)魚類性逆轉(zhuǎn)常用的方法主要有投喂、浸浴和注射，其中使用較多的是口服投喂。目前在關(guān)于使用外源激素控制羅非魚性別轉(zhuǎn)化的研究中，關(guān)注較多的是如何向雄性化性逆轉(zhuǎn)[15-16]，而羅非魚雌性化的性逆轉(zhuǎn)研究不多，且使用的外源雌激素種類、方法、濃度以及試驗(yàn)魚種各不相同，效果也不一樣，如Jensen等分別使用劑量為30 mg/kg、60 mg/kg、120 mg/kg的雌三醇、雌酮以及雌二醇誘導(dǎo)奧利亞羅非魚(Oreochromiscoaureus)21 d和35 d，雌化無效果[17]；Hopkins使用劑量為20～100 mg/kg的己烯雌酚誘導(dǎo)奧利亞羅非魚35 d和56 d，雌性率僅為64%[18]；楊永銓等使用劑量為50～80 mg/kg的雌激素分別誘導(dǎo)奧利亞羅非魚30 d、60 d和100 d，雌性化效果均不明顯[19]；Liu采用雌酮對(duì)奧利亞羅非魚苗進(jìn)行雌性化，實(shí)驗(yàn)效果不顯著[20]；Melard使用乙炔基雌二醇進(jìn)行奧利亞羅非魚雌性化實(shí)驗(yàn)，獲得少量轉(zhuǎn)化雌魚[21]；Melchor等分別使用劑量為25～10 mg/kg、100～200 mg/kg的已烯雌酚和雌酮誘導(dǎo)尼羅羅非魚25 d、35 d和59 d，雌性率為62%～90%[22]；Nakamura等使用劑量為50 mg/kg的乙炔基雌二醇誘導(dǎo)莫桑比克羅非魚20 d，雌性率為100%[23]。本研究中，口服含有EB飼料的雌性化誘導(dǎo)，新吉富羅非魚的雌性率隨著濃度的增加、處理時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，其中雌性率最高為150 mg/kg飼料處理組(94.45%)，這與萬松良等[24]使用100 mg/kg EB飼料持續(xù)誘導(dǎo)59 d的羅非魚雌性率為94%的效果一樣，表明口服含有一定劑量EB飼料誘導(dǎo)新吉富羅非魚性反逆，具有較好的雌性化效果。

另外，本研究中，還通過設(shè)置養(yǎng)殖水體中含有50 μg/L、100 μg/L和150 μg/L EB濃度，浸浴30 d誘導(dǎo)新吉富羅非魚性逆轉(zhuǎn)，結(jié)果顯示新吉富羅非魚的雌性率隨著濃度的增加而升高，其中以100 μg/L和150 μg/L誘導(dǎo)效果較好，雌性率分別為68.89%和77.78%，相反，Eekstein等使用50～1 000 μg/L濃度的己烯雌酚浸浴奧利亞羅非魚35～42 d，由于死亡率和畸形率高，未獲得雌性化魚[25]，這可能是由于本實(shí)驗(yàn)所使用的雌激素種類和受試試驗(yàn)魚種類不同造成的。根據(jù)我國(guó)《食品動(dòng)物禁用的獸藥及其它化合物清單》(農(nóng)業(yè)部發(fā)公告第193號(hào))規(guī)定，苯甲酸雌二醇被列為“不準(zhǔn)以抗應(yīng)激、提高飼料報(bào)酬、促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)為目的在食品動(dòng)物飼養(yǎng)過程中使用”范圍內(nèi)，而未規(guī)定在制種過程中不得使用。而且關(guān)于利用類固醇激素控制羅非魚性別的研究在國(guó)外已經(jīng)廣泛存在，且比較成熟，進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)絕大部分隨著排泄物代謝至體外[9]。

綜上所述，本研究以新吉富羅非魚作為試驗(yàn)魚種，以苯甲酸雌二醇作為外源性雌激素，通過對(duì)比雌性化誘導(dǎo)效果，表明口服和浸浴兩種雌性化方法誘導(dǎo)新吉富羅非魚性逆轉(zhuǎn)均具有良好的效果，但綜合考慮實(shí)效性和方便性，建議以后利用三系配套技術(shù)進(jìn)行雄性羅非魚制種，采用口服的方法更容易誘導(dǎo)和獲得雌性化魚。