金魚(Carassius auratus)咽部寄生洪湖碘泡蟲(Myxobolus honghuensis)的分子鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析

郭 睿，張善霹，江小斌，王 偉，王洪城，蔡雷鳴，楊小強

(福州市海洋與漁業(yè)技術(shù)中心，福建 福州 350007)

粘孢子綱(Myxosporea)類群是一類種類繁多、分布廣泛的后生動物寄生蟲，已鑒定的種類約2 200種，其主要寄主為魚類[1-2]，也可寄生于昆蟲、兩棲類、爬行類及哺乳動物等[3-4]，是水生動物養(yǎng)殖中的重要寄生蟲病原。碘泡蟲在廣義上泛指胞質(zhì)內(nèi)含有嗜碘泡的一類粘孢子蟲；狹義上指碘泡科(Myxobolidae)的種類，為粘孢子綱最大的一科，該科種類及相關(guān)類群在屬和種階元的分類問題上一直存在爭議[5]。

金魚(Carassiusauratus)隸屬于硬骨魚綱、鯉形目、鯉科、鯽屬，是我國傳統(tǒng)的名貴觀賞魚類和人們樂于飼養(yǎng)的觀賞魚類。金魚在養(yǎng)殖過程中易受到寄生蟲、細菌和病毒等病原的侵襲，不僅影響觀賞價值，嚴重時還會引起死亡，造成較大經(jīng)濟損失。金魚養(yǎng)殖中常見寄生蟲有多子小瓜蟲(Ichthyophthiriusmultifilis)、車輪蟲(Trichodinaspp.)、指環(huán)蟲(Dactylogyrusspp.)和粘孢子蟲，其中粘孢子蟲中的碘泡蟲寄生部位在鰓較為常見，未見有寄生在金魚咽部的碘泡蟲報道。

在2018年開展福州地區(qū)金魚病害監(jiān)測調(diào)查中，筆者首次發(fā)現(xiàn)某養(yǎng)殖場所采集部分金魚的咽部存在大量粘孢子蟲(碘泡蟲)，為確定病原，對其使用18SrDNA和ITS-5.8S基因進行了分子鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建和分析，以期為金魚粘孢子蟲病的防控提供理論參考和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 樣本采集和保存

金魚病樣采自福州地區(qū)某金魚養(yǎng)殖場，隨機采樣20尾，體質(zhì)量5～10 g。采樣時水溫27～29℃，病魚離群獨游、游動乏力、浮頭消瘦。鰓絲及體表黏液水封片未見寄生蟲，但發(fā)現(xiàn)部分魚體咽部發(fā)紅略腫大，將病魚鰓蓋沿鰓弓線剪開，可見咽部存在大量白色包囊，刮取包囊制備水封片使用Zeiss Axio Imager A2顯微鏡觀察拍照，發(fā)現(xiàn)大量碘泡蟲。吸取部分蟲體使用95%乙醇固定后，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 蟲體基因組DNA的提取

將95%乙醇固定的部分孢子，5 000 r/min離心10 min后去除上清，使用DNeasy Blood & Tissue Kit(Qiagen，德國)按照說明書操作提取基因組DNA，標記為FZCL18，作為寄生蟲分子鑒定模板，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 蟲體目的片段的克隆和測序

使用C1000 Touch基因擴增儀(Bio-rad，美國)進行PCR。擴增18SrDNA基因所用引物參考Andree等[6]，擴增ITS-5.8S基因所用引物參考李丹等[7]，引物序列、退火溫度及擴增片段大小見表1，具體為94℃預(yù)變性5 min，運行32個循環(huán)，包括94℃變性30 s、52℃(或57℃)退火30 s、72℃延伸100 s(或30 s)、72℃充分延伸7 min。PCR反應(yīng)體系(50 μL)包括：Go Taq Green Master Mix(Promega，美國)25 μL，25 mM的引物各1 μL，模板DNA 1 μL，用去離子水調(diào)整終體積至50 μL。PCR產(chǎn)物經(jīng)15 g/L瓊脂糖凝膠電泳后使用E.Z.N.A Gel Extraction Kit(Omega，美國)切膠回收目的片段，參照pMD18-T克隆試劑盒的操作步驟對目的片段進行連接和轉(zhuǎn)化。經(jīng)菌落PCR篩選陽性克隆后提取質(zhì)粒使用ABI 3730 DNA 測序儀測序，并用Mega 5.2對測序結(jié)果進行校正。

表1 PCR反應(yīng)所用引物及目的片段大小

1.4 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建和分析

將FZCL18的18SrDNA和ITS-5.8S基因序列與GenBank中已報道核酸序列進行在線BLAST分析，調(diào)出與所測序列同源性較高的核酸序列，并參照劉曉聰?shù)萚2]下載相關(guān)蟲株對應(yīng)序列。將上述序列使用Mega 5.2完成序列比對后，以相近蟲屬尾孢蟲(Henneguyaspp.)或單極蟲(Thelohanellussp.)為外群，采用臨接近法(Neighbor-joining method，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，通過自舉分析(Bootstrap)進行置信度檢測，自舉次數(shù)1 000次，以估算內(nèi)分支支持率。

首先，在縮減開支方面，不少大中型企業(yè)極力縮減不必要的營銷崗位，以鏈家網(wǎng)為例，今年下半年，房地產(chǎn)業(yè)在高杠桿的影響下開始進行產(chǎn)業(yè)調(diào)整，鏈家網(wǎng)旗下?lián)碛谢ヂ?lián)網(wǎng)、二手房中介、自如長租公寓、大數(shù)據(jù)分析等數(shù)項業(yè)務(wù)，但受近年來企業(yè)信貸融資的萎縮，除自如公寓接收到社會天使融資外，鏈家網(wǎng)線下實體店已經(jīng)實行大規(guī)模減少二手房置業(yè)經(jīng)理的策略，縮減開支，熬過房地產(chǎn)行業(yè)的嚴冬。

2 結(jié)果

2.1 蟲體形態(tài)

孢子正面觀察呈梨形，縫面觀察呈梭形，前端稍尖后端鈍圓。孢子長為14.5～18.0 μm，平均值為(16.0±0.8)μm；孢子寬8.5～11.0 μm，平均值為(10.1±0.8)μm，有2個大小略有差異的極囊，極絲圈數(shù)為6～7(圖1)。

注：A為光學(xué)顯微鏡下孢子形態(tài)，標尺=20 μm；B為單孢子經(jīng)數(shù)碼放大圖片。

2.2 蟲株18S rDNA基因和ITS-5.8S基因序列分析

蟲株FZCL18的18SrDNA基因測序結(jié)果經(jīng)校正后獲得長度為1 353 bp的序列(GenBank登錄號為MT303850)，與GenBank中已報道的洪湖碘泡蟲(M.honghuensis)和瓶囊碘泡蟲(M.ampullicapsulatus)的對應(yīng)序列同源性較高，序列相似性在97.27%～98.08%，F(xiàn)ZCL18與洪湖碘泡蟲在1 353個堿基中有26個差異位點；ITS-5.8S基因測序結(jié)果經(jīng)校正后獲得長度為480 bp的序列(GenBank登錄號為MT303857)，因GenBank中暫未收錄洪湖碘泡蟲對應(yīng)序列，故BLAST后發(fā)現(xiàn)與本文蟲株序列相似性最高的為GenBank中收錄的2株瓶囊碘泡蟲的對應(yīng)序列，序列相似性在94.58%～94.80 %之間，F(xiàn)ZCL18與瓶囊碘泡蟲在480個堿基中有25個差異位點。

2.3 依據(jù)18S rDNA基因和ITS-5.8S基因的系統(tǒng)發(fā)育樹分析

結(jié)合比對結(jié)果，選取相關(guān)碘泡蟲屬蟲株，采用NJ法基于18SrDNA和ITS-5.8S基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2和圖3，可見蟲株FZCL18與多株報道的洪湖碘泡蟲聚類，且具有較高Bootstrap值。在依據(jù)18SrDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中，F(xiàn)ZCL18與洪湖碘泡蟲和咽碘泡蟲(M.pharynae)聚為一個分支，在依據(jù)ITS-5.8S序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中，F(xiàn)ZCL18與瓶囊碘泡蟲分別形成一個分支，沒有聚類。

3 討論

粘孢子蟲是一類世界性分布的動物寄生蟲，主要寄生于魚類。碘泡蟲(Myxobolusspp.)是粘孢子蟲中的最大類群，全世界報道850多種[8]，我國記錄有320余種，其中寄生鯽(C.auratus)的碘泡蟲種類最多，達到50余種。部分碘泡蟲種類寄生魚類后引起嚴重的碘泡蟲病，導(dǎo)致魚類生長緩慢、畸形甚至致死[9]。其中寄生在異育銀鯽咽部的洪湖碘泡蟲是異育銀鯽“喉孢子蟲病”的病原，給其養(yǎng)殖帶來嚴重經(jīng)濟損失，因Liu等[10]最早在湖北洪湖地區(qū)發(fā)現(xiàn)，遂鑒定命名為洪湖碘泡蟲(M.honghuensisn.sp.)。同年陸宏達等[11]報道一例江蘇鹽城地區(qū)池養(yǎng)異育銀鯽咽寄生碘泡蟲病原，命名為咽碘泡蟲(M.pharynaen.sp.)，并認為該寄生蟲特異寄生在異育銀鯽口咽腔上顎的咽組織內(nèi)，具有寄主和寄生咽部的專一性。之后，劉曉聰?shù)萚2]在河南龍湖地區(qū)發(fā)現(xiàn)異育銀鯽的鰓部感染洪湖碘泡蟲，但未見形成孢囊，沒有造成嚴重病害。以往有關(guān)洪湖碘泡蟲的報道，其寄主皆為異育銀鯽，主要寄生在咽部，未見有寄生在金魚咽部的碘泡蟲報道。筆者在福州地區(qū)某池養(yǎng)金魚的咽部檢出一種咽寄生的碘泡蟲，從孢子形態(tài)上觀察，與Liu等[10]和陸宏達等[11]描述的洪湖碘泡蟲或咽碘泡蟲相似，從寄生部位和形態(tài)上可初步判斷本研究碘泡蟲為洪湖碘泡蟲或咽碘泡蟲。

由于碘泡蟲屬種類繁多以及種間形態(tài)結(jié)構(gòu)的相似性，僅通過顯微觀察依靠孢子形態(tài)學(xué)對碘泡蟲屬種類進行分類鑒定存在不確定性，故對本文蟲株進行分子鑒定。除了在碘泡蟲屬等粘孢子蟲中廣泛應(yīng)用的18SrDNA序列，還使用了ITS-5.8SrDNA序列外，后者包含的變異區(qū)域較多，適合于種間和種內(nèi)差異研究，可用于相似物種的區(qū)別和鑒定[7，12]。在ITS-5.8SrDNA序列的擴增中，選用的引物為李丹等[7]報道的洪湖碘泡蟲特異性檢測方法中的引物，具有較高的特異性和靈敏度。本文碘泡蟲18SrDNA測序結(jié)果顯示與洪湖碘泡蟲對應(yīng)序列的相似性在98.08%，依據(jù)18SrDNA構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中，F(xiàn)ZCL18與洪湖碘泡蟲聚為一支，其中咽碘泡蟲與洪湖碘泡蟲聚在一起，暗示二者可能是同物異名，與劉曉聰?shù)萚2]認為二者是同一物種的結(jié)論一致。ITS-5.8S測序結(jié)果顯示與瓶囊碘泡蟲對應(yīng)序列的相似性小于95 %，而GenBank中未見報道洪湖碘泡蟲或咽碘泡蟲的ITS-5.8S序列，故在依據(jù)ITS-5.8S構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中，F(xiàn)ZCL18與瓶囊碘泡蟲形成姊妹群，由于本文使用的ITS-5.8S為洪湖碘泡蟲特異性檢測引物，可推測本文碘泡蟲與洪湖碘泡蟲更為接近。綜上，鑒于優(yōu)先命名的原則，將本文碘泡蟲鑒定為洪湖碘泡蟲。此外，本文所鑒定碘泡蟲與寄生異育銀鯽鰓部的瓶囊碘泡蟲[13]相比，在形態(tài)上較短、較寬，2個極囊大小略有差異且極絲圈數(shù)少于瓶囊碘泡蟲的9～10圈，在分子序列信息上，依據(jù)18SrDNA構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中，瓶囊碘泡蟲沒有與洪湖碘泡蟲聚為一支，二者ITS-5.8S基因序列差異較大，再結(jié)合本文碘泡蟲與瓶囊碘泡蟲的寄生部位不同，可區(qū)分本文碘泡蟲與瓶囊碘泡蟲。

洪湖碘泡蟲多寄生于湖北、江蘇等地區(qū)池養(yǎng)異育銀鯽上，引起諸如“喉孢子蟲病”的大規(guī)模碘泡蟲病害[10-11]，也有寄生在河南地區(qū)和吉林地區(qū)養(yǎng)殖異育銀鯽的報道[2，14]，可見洪湖碘泡蟲會對異育銀鯽的養(yǎng)殖造成嚴重損失。筆者發(fā)現(xiàn)洪湖碘泡蟲除了危害異育銀鯽外，也可寄生于金魚，當(dāng)感染嚴重時亦可阻塞咽部或使咽部穿孔，危害金魚養(yǎng)殖。異育銀鯽是以方正銀鯽為母本與興國紅鯉為父本經(jīng)人工授精所產(chǎn)生的子代，在遺傳進化關(guān)系上，大部分學(xué)者認為銀鯽起源于鯽[15]，故異育銀鯽屬于比鯽起源分化還晚的類群，以往報道洪湖碘泡蟲僅寄生于異育銀鯽，而異育銀鯽因和鯽的生境和食性相似，在養(yǎng)殖過程中可能存在混養(yǎng)，本文發(fā)現(xiàn)洪湖碘泡蟲可寄生金魚(鯽)，或可說明洪湖碘泡蟲可寄生有限種的鯽屬魚類。此外，本文金魚咽寄生碘泡蟲18SrDNA與異育銀鯽的咽寄生碘泡蟲對應(yīng)序列存在較多差異位點，可能與同一碘泡蟲與不同宿主經(jīng)歷協(xié)同進化的自然歷史過程有關(guān)，尚需更多種群序列信息，有待進一步研究。