綠球藻多糖的抑菌活性及成分分析

李旭東，馮佳，呂俊平，劉琪，南芳茹，劉旭東，謝樹蓮

（山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006）

0 引言

多糖是生物體內(nèi)重要的生物大分子。研究表明，多糖有特殊的生物活性，能提高機體的免疫功能，在預(yù)防醫(yī)學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、保健食品等方面發(fā)揮有作用。過去對多糖的研究多集中于高等植物或海洋大型藻類，而對微藻多糖活性的研究很少［1-2］。

在各類疾病發(fā)生率中，食源性疾病高居第二位［3］。在250多種食源性疾病中，食品致病菌引起的食物中毒事件約占2/3［4］。2007—2013年我國就有3 900多起食源性疾病事件發(fā)生［5］，食品致病菌已成為食品污染的重大源頭。隨著生活水平的日益提高，人們對食品的安全性關(guān)注度越來越高，特別是食品添加劑成了焦點，各種合成防腐劑使用易引起致癌、致畸及食物中毒的問題［6-7］。

一些生物富含殺菌、抑菌活性物質(zhì)受到關(guān)注，成為食品工業(yè)研究的熱點。報道較多的是植物類，特別是香辛料和一些中草藥植物類，也有少量動物和微生物［8］。近年來人們逐步認(rèn)識到微藻是一類具有抑菌潛力的寶貴天然生物資源，在醫(yī)藥、化妝、洗浴用品及食品防腐保鮮等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景，如小球藻多糖和紫球藻多糖對細菌與真菌都顯示了不同程度的抑制作用，抗菌譜極廣，海帶多糖對氧自由基吸收能力、ABTS+自由基清除能力和還原力等均有較顯著的抗氧化能力，杜氏鹽藻、集胞6803、三角褐指藻、發(fā)狀念珠藻、螺旋藻、魚腥藻7120、柵藻等的粗多糖均具有抑菌活性，而且螺旋藻多糖和小球藻多糖以不同質(zhì)量比例制得的復(fù)合多糖，其抑制效果和抗氧化活性優(yōu)于單一多糖［9］。本文研究了綠球藻多糖對常見致病菌的抑菌活性，并對其單糖組成進行了分析，以期為天然食品抑菌劑新資源開發(fā)提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料、試劑與儀器

綠球藻（Chlorococcumsp.GD），采自山西省關(guān)帝山（37°49′N，111°27′E，海拔1 861 m）。藻種由山西大學(xué)藻類學(xué)實驗室分離、保藏并培養(yǎng)。

供試細菌5種，金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）、大腸桿菌（Escherichiacoli）、枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）、變形桿菌（Proteusspecies）和產(chǎn)氣桿菌（Acrobacteraerogenes）。菌種由山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實驗室提供，以牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)。

甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖和巖藻糖（質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞99%，上海生工生物工程有限公司）；三氟乙酸（質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞99%，天津致遠化學(xué)試劑有限公司）；右旋糖酐（D1、D2、D3、D4、D5、D6、D7、D8、D9、D10，標(biāo)準(zhǔn)分子量分別為 180、2 500、4 600、7 100、10 000、21 400、41 100、84 400、133 800、2 000 000 Da，中國藥品生物制品檢定所）；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞99%，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；甲醇和乙腈（色譜純，美國Tedia公司）；氯化鈉、鹽酸、氯仿、NaOH和無水乙醇（分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；牛肉膏、蛋白胨和瓊脂（生化純，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司）。

電熱鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9070A，上海一恒科學(xué)儀器有限公司），電熱恒溫水浴鍋（HH-2，常州國華電器有限公司）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（DH4000Ⅱ，天津市泰斯特儀器有限公司），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RF-02，上海普渡生化科技有限公司），高效凝膠滲透色譜（P230II型，廣州艾欣科學(xué)儀器有限公司），高效液相色譜儀（Waters e2695，費爾伯恩精密儀器（上海）有限公司），色譜柱溫箱（HT-330，上海吉理科學(xué)儀器有限公司），色譜柱（TSK-gel G-4000 PWXL，北京金歐亞科技發(fā)展有限公司），示差折光檢測器檢測儀（Shodex RI-201，天津琛航科苑科技發(fā)展有限公司），液相色譜柱（Agela Venusil XBP-C18，杭州紐藍科技有限公司），電子天平（TB-214，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司），便攜式多參數(shù)分析儀（雷磁DZB-718，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司），微孔濾膜（0.22 μm，島津遐邇（上海）商貿(mào)有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 綠球藻多糖及菌懸液的制備

依照有關(guān)文獻的方法制備綠球藻干粉［10］。稱取綠球藻粗多糖（CCP）0.2 g，用最少量的蒸餾水溶解。上層析柱（50 cm×2.6 cm），用蒸餾水洗至無糖檢出，依次用 0、0.1、0.3、0.5 mol/L NaCl洗脫，洗脫速度為1 mL/min，分管收集，每管5 mL，洗脫時間為4 h。收集各洗脫峰部分，濃縮、透析、冷凍干燥。

取上述洗脫峰部分最多的多糖2 mg，溶于1 mL蒸餾水，上層析柱（100 cm×1.5 cm），用蒸餾水以0.2 mL/min速度洗脫，按每管5 mL接洗脫液。綠球藻粗多糖經(jīng)除蛋白、柱純化，得到綠球藻純多糖（CPP）。稱取一定量的綠球藻多糖，用滅菌蒸餾水準(zhǔn)確配制成濃度為30 mg/mL的抑菌液，在4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

將菌種接入到已經(jīng)備好的斜面試管中（15 mm×150 mm）活化，細菌37℃培養(yǎng)24 h，真菌28℃培養(yǎng)48 h。在無菌條件下，勾一環(huán)單菌落于50 mL新配制的相應(yīng)培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，制成菌懸原液。采用10倍稀釋法將菌懸原液稀釋至10-1～10-8倍的菌懸液，選取合適濃度菌懸液涂平板，通過平板菌落計數(shù)法確定菌懸液濃度，并配制濃度1×106CFU/mL的菌懸液備用。

1.2.2 抑菌活性的測定

采用瓊脂孔注入法測定抑菌活性。取20 mL滅菌的培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿制成平板，冷卻10 min，吸取100 μL菌懸液均勻涂布于平皿表面，靜置10 min，用直徑6 mm打孔器在平板表面打孔，每板3個孔（1個為無菌水對照，1個為3 mg/mL綠球藻粗多糖液，1個為3 mg/mL綠球藻純多糖液）。將平皿置于恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，細菌37℃培養(yǎng)24 h。采用十字交叉法測定抑菌圈直徑［11］，每組重復(fù)3次，取平均值。

最低抑菌濃度（MIC）的測定參照羅愛國的方法［12］，略做修改。將綠球藻純多糖溶液稀釋成濃度為20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.313、0.156、0.078、0.039 mg/mL濃度梯度，每個濃度取1 mL，菌懸液取0.1 mL，加入60℃左右的固體培養(yǎng)基，充分混勻，待冷卻凝固后，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察并記錄菌落生長情況，以不長菌的最低綠球藻多糖溶液濃度為最低抑菌濃度。

細菌生長曲線的測定，以金黃色葡萄球菌為代表。取菌懸液按體積分?jǐn)?shù)1%接種于含30 mg/mL綠球藻純多糖的液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)。分別于0 h、3 h、6 h、9 h、12 h、15 h、18 h、21 h、24 h取樣，在波長600 nm處測定菌懸液吸光度，繪制生長曲線［13-14］。以無菌蒸餾水代替多糖作為對照。

細胞膜通透性的測定是將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的金黃色葡萄球菌于5 000 r/min離心10 min，收集菌體。用滅菌生理鹽水洗滌3次后重新懸浮，使懸液 OD630nm＝0.6［15］，即為金黃色葡萄球菌懸液。向其中加入綠球藻純多糖，使其濃度達到1/2 MIC、MIC、2 MIC及4 MIC，以未加綠球藻多糖的菌懸液為對照。37 ℃培養(yǎng)，分別于2、4、6、8、10和12 h時取樣，離心10 min（4 000 r/min），取上清液，測定不同培養(yǎng)時間的OD260nm。實驗重復(fù)3次，取平均值。

溶解氧的測定是向處于對數(shù)生長期的金黃色葡萄球菌的菌懸液分別加入綠球藻純多糖，使其濃度達到MIC、2 MIC和4 MIC，以未加入綠球藻純多糖的菌懸液為對照，37°C振蕩培養(yǎng)24 h，每隔2 h記錄溶氧［16］。

1.2.3 綠球藻多糖分子量測定和單糖組成分析

將不同分子量的系列葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品和待測綠球藻純多糖樣品配置成5 mg/mL溶液，采用高效凝膠滲透色譜法測定多糖分子量［17］。流動相：超純水；柱溫：（35±0.5）℃；進樣量：20 μL；運行時間：30 min；流速：1.0 mL/min；手動進樣。精密稱取右旋糖酐分子量分別為180、2 500、4 600、7 100、10 000、21 400、41 100、84 400、133 800和2 000 000 Da的10種標(biāo)品，配成質(zhì)量濃度為5 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)0.22 μm的微孔濾膜過濾，進樣。記錄保留時間，代入回歸方程求分子量。

綠球藻純多糖中單糖組成采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮柱前衍生高效液相色譜法進行分析［18-20］。液相色譜柱：Agela Venusil XBP-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相：A相為磷酸二氫鉀緩沖液83%（pH＝6.7），B相為乙腈17%，流速1.0 mL/min，進樣量 20 μL，柱溫 35 ℃，檢測波長250 nm。稱取5 mg綠球藻純多糖置于水解管中，加入2 mol/L三氟乙酸3 mL，溶解，密封，置于120℃烘箱，加熱水解2 h。取出放置至室溫，轉(zhuǎn)移至25 mL圓底燒瓶。45℃減壓，反復(fù)加入少量甲醇，取出殘余的三氟乙酸。準(zhǔn)確稱取甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、巖藻糖、鼠李糖對照品 0.09 g、0.097 g、0.09 g、0.09 g、0.075 g、0.075 g、0.082 g、0.091 g，放入同一個 10 mL離心管中，加5 mL超純水，溶解并混勻，終濃度100 mmol/L，得混合標(biāo)準(zhǔn)品母液。取1 mL濃度為100 mmol/L的混合標(biāo)準(zhǔn)品，加入9 mL超純水，稀釋成10 mmol/L，置于20 mL量筒中，加水溶解至刻度，得混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。取混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液200 μL至2 mL EP管中，與240 μL 0.5 mol/L1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮及0.2 mL 0.3 mol/L NaOH溶液混合，充分振搖，放置于恒溫金屬浴中，70℃、300 r/min反應(yīng)70 min。冷卻至室溫，加入200 μL 0.3 mol/L HCl中和，加入1 mL氯仿萃取，離心，棄去有機層。重復(fù)萃取3次，得上層水液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，備用。準(zhǔn)確吸取多糖水解液200 μL，進行高效液相分析。根據(jù)單糖標(biāo)準(zhǔn)品出峰的保留時間分析樣品的單糖組成。

1.2.4 統(tǒng)計分析

所有試驗均重復(fù)3次，結(jié)果以±SD表示，采用SPSS 17.0軟件進行方差分析處理，并以Duncan′s多重比較檢驗，比較綠球藻多糖對不同菌種的抑制效果，已t-檢驗比較綠球藻多糖對金黃色葡萄球菌細胞膜滲透性的影響。當(dāng)P＜0.05時被認(rèn)為具有顯著性差異，當(dāng)P＜0.01時被認(rèn)為具有極顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 綠球藻多糖的抑菌效果

綠球藻多糖對5種細菌均表現(xiàn)出明顯的抑制作用（表1）。從形成的抑菌圈直徑可看出，純多糖的抑菌效果普遍好于粗多糖，且差異顯著（P＜0.05）。純多糖對細菌抑制作用大小順序依次為：金黃色葡萄球菌＝枯草芽孢桿菌＞產(chǎn)氣桿菌＝變形桿菌＞大腸桿菌。綠球藻純多糖對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的抑制作用較強，抑菌圈直徑分別達到16.57 mm和16.41 mm，顯著高于粗多糖的11.94 mm和10.42 mm（圖1）。羅愛國等［21］曾報道過7種可食藻水提物和醇提物的抑菌效果，與其比較，綠球藻多糖的抑菌效果明顯優(yōu)于除鈍頂螺旋藻Arthrospiraplatensis外的其他6種可食藻。

圖1 綠球藻多糖對細菌的抑菌效果a：金黃色葡萄球菌；b：大腸桿菌；c：枯草芽孢桿菌；d：變形桿菌；e：產(chǎn)氣桿菌；①：對照；②：綠球藻粗多糖；③：綠球藻純多糖Fig.1 Antibacterial effects of Chlorococcus sp.polysaccharides on bacteriaa：Staphylococcus aureus；b：Escherichia coli；c：Bacillus subtilis；d：Proteus vulgaris；e：Acrobacter aerogenes；①：Control；②：Bacteriostatic circle of Chlorococcus sp.crude polysaccharide；③：Bacteriostatic circle of Chlorococcus sp.pure polysaccharide

表1 綠球藻多糖的抑菌效果Table 1 Antibacterial effects of polysaccharide from Chlorococcus sp.（n=3）

2.2 綠球藻多糖的最低抑菌濃度（MIC）

CPP對5種細菌均有抑制作用，敏感性順序由弱到強依次為：大腸桿菌、變形桿菌、產(chǎn)氣桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌，其MIC依次分別為20 mg/mL、20 mg/mL、10 mg/mL、5 mg/mL，2.5mg/mL。可見，供試細菌中對革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌的抑菌作用較強。與之前文獻報道相比［12］，鈍頂螺旋藻水提物對金黃色葡萄球菌的MIC為1.25 mg/mL，對大腸桿菌的MIC為2.5 mg/mL，本研究綠球藻純多糖對金黃色葡萄球菌的MIC為2.5 mg/mL，對大腸桿菌的MIC為20 mg/mL，說明綠球藻純多糖抑菌效果較鈍頂螺旋藻略差（表2）。

表2 綠球藻多糖最低抑菌濃度Table 2 Minimum inhibitory concentration of polysaccharide from Chlorococcus sp.

2.3 綠球藻多糖對金黃色葡萄球菌生長曲線的影響

綠球藻多糖對金黃色葡萄球菌的抑制效果最好，故以金黃色葡萄球菌為例，研究了綠球藻多糖對其生長曲線的影響。由圖2可知，與對照組相比，處理組生長進入對數(shù)期的時間明顯延后，且吸光度值降低，粗多糖和純多糖處理組分別較對照組降低了5.4%和15.2%，說明綠球藻多糖抑制了金黃色葡萄球菌細胞的正常生長，菌體細胞生長代謝被延緩。從實驗結(jié)果也可以看出，純多糖的抑菌效果明顯優(yōu)于粗多糖，這是因為粗多糖中含有一些非多糖類雜質(zhì)，如脂類，影響了其抑菌活性。這一結(jié)果與有關(guān)文獻對鈍頂螺旋藻的研究結(jié)果一致［12］。

圖2 綠球藻多糖對金黃色葡萄球菌生長曲線的影響Fig.2 Effects of polysaccharide from Chlorococcus sp.on growth curve of Staphylococcus aureus

2.4 綠球藻多糖對金黃色葡萄球菌細胞膜滲透性的影響

細胞內(nèi)容物在260 nm有吸收，表明細胞膜受到了破壞［22］。圖3是不同濃度的CPP對金黃色葡萄球菌作用下，細胞上清液的OD260nm值。當(dāng)用1/2 MIC濃度的CPP作用于金黃色葡萄球菌時，在所檢測的時間范圍內(nèi)，上清液OD260nm與對照相比，沒有顯著性差異（P＞0.05）。當(dāng)用MIC的CPP作用于金黃色葡萄球菌時，上清液OD260nm與對照相比，有顯著差異（P＜0.05）。當(dāng)用2 MIC和4 MIC的CPP作用于金黃色葡萄球菌時，上清液OD260nm與對照相比，有極顯著差異（P＜0.01）?？梢姡珻PP會導(dǎo)致金黃色葡萄球菌OD260nm特征吸收物質(zhì)的泄露，而且這種現(xiàn)象與濃度有關(guān)。本實驗說明了綠球藻純多糖是破壞了金黃色葡萄球菌細胞的完整性，使細胞膜通透性增加，導(dǎo)致胞內(nèi)核酸物質(zhì)流出，細胞代謝發(fā)生紊亂，OD260nm值增加。隨后，OD260nm減小，可能是CPP使釋放出的DNA、mRNA變性所致?？傮w來看，不同濃度的CPP對金黃色葡萄球菌的影響也不同。

圖3 綠球藻多糖對金黃色葡萄球菌細胞膜滲透性的影響（對照為無綠球藻多糖處理時金黃色葡萄球菌上清液的OD260 nm值；1/2 MIC、MIC、2 MIC和4 MIC分別表示綠球藻純多糖的處理濃度為1/2最低抑菌濃度、最低抑菌濃度、2倍最低抑菌濃度和4倍最低抑菌濃度；與對照組相比，*P＜0.05為差異顯著，**P＜0.01為差異極顯著）Fig.3 Effects of polysaccharide from Chlorococcus sp.on cell permeability of Staphylococcus aureus（The control is the OD260 nmvalue of Staphylococcus aureus supernatant without Chlorococcus sp.polysaccharide；1/2 MIC，MIC，2 MIC and 4 MIC respectively indicated that the treatment concentration of pure polysaccharide of Chlorococcus sp.is 1/2 of the minimum inhibitory concentration，the minimum inhibitory concentration，the double minimum inhibitory concentration and the four times minimum inhibitory concentration；Compared with the control group，*P ＜0.05 means the difference is significant，**P＜0.01 means the difference is very significant）

2.5 綠球藻多糖對金黃色葡萄球菌液溶氧量的影響

由圖4可知，沒有綠球藻多糖處理的對照中，金黃色葡萄球菌菌體大量生長，呼吸作用較強，培養(yǎng)液中溶解氧顯著下降。而添加綠球藻多糖的金黃色葡萄球菌菌體生長受到抑制，呼吸作用減弱，培養(yǎng)液中溶解氧較對照高。未經(jīng)CPP處理的菌體在最初的12 h內(nèi)，呼吸作用較強，培養(yǎng)基中的溶氧量顯著下降（P＜0.05）。當(dāng)培養(yǎng)時間為12 h，培養(yǎng)基中的溶氧量達到最低，12 h之后溶氧量又顯著升高。用MIC和2 MIC濃度的CPP作用于金黃色葡萄球菌時，培養(yǎng)基中的溶氧量在16 h內(nèi)顯著下降（P＜0.05）。培養(yǎng)時間為16 h，培養(yǎng)基中的溶氧量達到最低，16 h之后溶氧量又緩慢升高。用4 MIC濃度的CPP作用于金黃色葡萄球菌時，培養(yǎng)基中的溶氧量在8 h內(nèi)略微下降。培養(yǎng)時間為8 h，培養(yǎng)基中的溶氧量達到最低，8 h之后溶氧量又緩慢升高，菌體耗氧量變化幅度很小?？梢酝茢?，該系統(tǒng)中細菌的呼吸作用由于受到綠球藻多糖的影響而大大減弱。這一結(jié)果也與有關(guān)文獻的報道類似［23］。

圖4 綠球藻多糖對金黃色葡萄球菌液溶氧量的影響（對照為無綠球藻多糖處理，MIC、2 MIC和4 MIC分別表示綠球藻純多糖的處理濃度為最低抑菌濃度、2倍最低抑菌濃度和4倍最低抑菌濃度）Fig.4 Effects of polysaccharide from Chlorococcus sp.on dissolved oxygen of Staphylococcus aureuss（The control is the treatment without Chlorococcus sp.polysaccharide.MIC，2 MIC and 4 MIC respectively indicate that the treatment concentration of Chlorococcus sp.polysaccharide is the minimum inhibitory concentration，2 times the minimum inhibitory concentration and 4 times the minimum inhibitory concentration）

2.6 綠球藻多糖的分子量

采用高效凝膠滲透色譜法測定已知分子量葡聚糖，結(jié)果見表3。以表3數(shù)據(jù)回執(zhí)標(biāo)準(zhǔn)曲線，并做回歸處理，得到的回歸方程為：Log分子量＝—1.129t+13.973（R2＝ 0.990 6）。

表3 右旋糖酐分子量分析Table 3 Molecular weight analysis of dextrose radicals

將5 mg/mL綠球藻純多糖溶液，通過高效凝膠色譜進行測定，記錄色譜峰保留時間（圖5）?？梢钥闯?，綠球藻多糖在高效凝膠滲透色譜上呈單一對稱峰，說明其純度較高。根據(jù)樣品測定的保留時間，通過前述回歸方程，計算得綠球藻多糖的分子量為8 090.31 Da，小于鈍頂螺旋藻多糖和雨生紅球藻（Haematococcuspluvialis）多糖的分子量［12，24］。有文獻報道，分子量相對較低的多糖可能具有更高的生物活性［25-26］?？梢娋G球藻多糖其它生物活性是值得進一步深入研究的。

圖5 綠球藻多糖的高效凝膠滲透色譜圖Fig.5 High-performance gel permeation chromatogram of polysaccharide from Chlorococcus sp.

2.7 綠球藻多糖的組成

多糖生物活性與其單糖組成有關(guān)，因此，確定多糖中的單糖組分是分析多糖結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)［6］。圖6是標(biāo)準(zhǔn)單糖溶液色譜圖和綠球藻純多糖樣品測試結(jié)果，可以看出，色譜峰分離效果較好，保留時間穩(wěn)定，能夠準(zhǔn)確定性和定量。通過分析比較可知，綠球藻多糖組成主要為甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖和木糖，還含有少量的半乳糖醛酸和巖藻糖。通過計算得出，綠球藻多糖中甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖和巖藻糖的摩爾比為1.68∶3.26∶0.09∶1.00∶4.56∶8.11∶0.28。這與鈍頂螺旋藻的單糖組成（木糖、巖藻糖、鼠李糖醇、阿拉伯糖醇、半乳糖、葡萄糖和甘露醇）［12］，有一定差異。

圖6 單糖標(biāo)準(zhǔn)品（上）和綠球藻純多糖（下）色譜圖1：甘露糖；2：鼠李糖；3：半乳糖醛酸；4：葡萄糖；5：半乳糖；6：木糖；7：阿拉伯糖；8：巖藻糖。Fig.6 Chromatogram of standard chromatogram of monosaccharide and polysaccharide from Chlorococcus sp1：Mannose；2：Rhamnose；3：Galacturonic acid；4：Glucose；5：Galactose；6：Xylose；7：Arabinose；8：Fucose

3 結(jié)論

（1）綠球藻多糖具有明顯的抑菌活性，且純多糖抑菌效果好于粗多糖，其中對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌抑制效果最強。綠球藻多糖的抑菌效果也優(yōu)于常見微藻鈍頂螺旋藻水提物和醇提物的抑菌效果，與鈍頂螺旋藻純多糖相似。

（2）綠球藻純多糖分子量為8 090.31 Da，單糖組成包括甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖和巖藻糖。綠球藻多糖的分子量小于鈍頂螺旋藻和雨生紅球藻，推測具有較強的生物活性。

（3）綠球藻多糖可作為天然食品防腐劑和新型食品抑菌劑，在食品生產(chǎn)應(yīng)用方面具有重要潛力。