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    褐煤微生物成氣的影響因素與菌群變化的關(guān)系分析

    2021-03-03 06:47:52丁超韓作穎楊秀清
    關(guān)鍵詞:古菌褐煤固液

    丁超,韓作穎,楊秀清*

    (1.山西大學(xué) 生物技術(shù)研究所 化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山西 太原 030006;2.煤與煤層氣共采國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山西 晉城 048000)

    0 引言

    國民經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展促使我們?cè)诿禾渴偷炔豢稍偕Y源外尋找可替代的優(yōu)質(zhì)清潔能源,煤層氣作為一種非常規(guī)天然氣,正憑借其自身的優(yōu)勢(shì)獲得越來越多的關(guān)注[1]。褐煤等煤化程度較低的煤,直接燃燒效益不高且會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染。但是其中氧含量及側(cè)鏈官能團(tuán)較多,適合微生物利用,為生物產(chǎn)氣提供了物質(zhì)基礎(chǔ)[2]。生物成因煤層氣是由產(chǎn)甲烷菌等厭氧菌代謝煤或煤層物質(zhì)產(chǎn)生的以甲烷(CH4)為主要成分的氣體。微生物增產(chǎn)煤層氣技術(shù)已成為煤層氣開采、增產(chǎn)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[3]。

    研究結(jié)果表明,多種因素影響產(chǎn)甲烷菌群將煤轉(zhuǎn)化為煤層氣的效率。林海等[4]發(fā)現(xiàn)從含氧低的污泥中富集得到的厭氧微生物能利用褐煤產(chǎn)氣,當(dāng)菌種經(jīng)褐煤馴化后,產(chǎn)氣周期明顯縮短且產(chǎn)氣量提高。王艷婷等[5]經(jīng)過篩選得到溫度、pH、NaCl濃度、煤漿濃度4個(gè)因素對(duì)褐煤產(chǎn)氣影響較為顯著。Green等[6]以粉河盆地產(chǎn)出水中富集的產(chǎn)甲烷菌群為研究對(duì)象,證明溫度、pH、煤的顆粒度等理化因素均會(huì)對(duì)產(chǎn)氣速率有顯著影響。但是目前國內(nèi)外關(guān)于產(chǎn)氣影響因素、微生物菌群結(jié)構(gòu)和產(chǎn)氣情況之間的關(guān)系特別是菌群結(jié)構(gòu)變化與產(chǎn)氣的關(guān)聯(lián)性分析并不多見。

    煤層氣相關(guān)微生物多樣性分析常見于克隆文庫、T-RFLP、DGGE、高通量測(cè)序等,PCR-DGGE技術(shù)憑借其精確性、高效性、便捷性等優(yōu)點(diǎn)被視作較為合適的選擇。但是PCR-DGGE本身存在一些缺點(diǎn),如需要一定的實(shí)驗(yàn)周期對(duì)多樣性分析過程中DGGE條帶克隆及測(cè)序,從而無法對(duì)DGGE條帶種屬地位進(jìn)行快速直觀地表征。為了克服這些缺點(diǎn),Mavragani等[7]在研究核腔菌污染樣品時(shí)引入物種參照,不僅提高結(jié)果的精確性,避免克隆的偏好性,而且不需要切膠克隆,可以節(jié)省大量時(shí)間。Nalepa等[8]在研究生鮮奶和奶酪中的微生物時(shí),根據(jù)樣品中微生物開發(fā)了一套物種DNA Marker,研究結(jié)果同樣證實(shí)了Mavragani的結(jié)論。本課題組在前期工作的基礎(chǔ)上,開發(fā)了2套煤層氣微生物物種DNA Maker[9-10](發(fā)明專利,已公開),為快速批量分析煤層水樣或生物成氣過程中煤微生物多樣性,及時(shí)反饋調(diào)控生物成氣提供了極大的方便。本文我們引入煤層氣微生物物種DNA Maker,通過PCR-DGGE對(duì)樣品種群結(jié)構(gòu)進(jìn)行快速分析,研究不同影響因素對(duì)應(yīng)的產(chǎn)氣情況,并對(duì)微生物菌群結(jié)構(gòu)變化和產(chǎn)氣進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析,以期加速信息反饋進(jìn)而指導(dǎo)產(chǎn)氣調(diào)控,同時(shí)為生物成因煤層氣的增產(chǎn)提供借鑒。

    1 材料和方法

    1.1 褐煤樣品采集

    褐煤煤樣取自內(nèi)蒙古錫林浩特市神華勝利煤田。依據(jù)后期顆粒度單因素實(shí)驗(yàn)需要,將褐煤樣本經(jīng)破碎后篩分至不同粒度。實(shí)驗(yàn)所用菌種分離自山西寺河礦區(qū)煤層氣井中產(chǎn)出水樣富集馴化后的培養(yǎng)液。

    1.2 主要試劑及儀器

    核糖核酸酶A溶液、去離子甲酰胺、尿素、瓊脂粉、瓊脂糖N、4S Red Plus核酸染色劑(10 000X水溶液)、過硫酸銨(APS)、四甲基乙二胺(TEMED)、SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒、SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒,生工生物工程(上海)股份有限公司;EasyTaq?DNA Polymerase、DNA Ladder,北京全式金生物技術(shù)有限公司。

    基本培養(yǎng)基、褐煤產(chǎn)氣培養(yǎng)基、微量元素及維生素的配方參照梁祺[11]的相關(guān)報(bào)道。

    機(jī)械振蕩器Mini-Beadbeater,美國Biospec公司;YQX-Ⅱ型厭氧手套箱,上海海向儀器設(shè)備廠;氣相色譜儀,安捷倫6890N;DYY-6C型電泳儀,北京六一生物科技有限公司;T100?Thermal Cycler PCR儀、DCode?通用突變檢測(cè)系統(tǒng),美國BIORAD公司;Thermo Scientific Nicolet iS50傅立葉變換紅外(FT-IR)光譜儀。

    1.3 褐煤生物成氣單因素實(shí)驗(yàn)

    以500 mL厭氧瓶作為褐煤產(chǎn)氣實(shí)驗(yàn)反應(yīng)容器。在厭氧工作站中按設(shè)置分裝好煤粉、菌液和培養(yǎng)基,35℃恒溫培養(yǎng)。利用氣相色譜儀檢測(cè)氣體組分并記錄產(chǎn)氣量。

    (1)煤顆粒度因素設(shè)置40目、80目、120目、160目和對(duì)照(不加煤)共5組實(shí)驗(yàn),除顆粒度外其余參數(shù)相同(固液比1∶15,接種量20%),每組3個(gè)重復(fù);

    (2)固液比因素設(shè)置1∶10(30 g煤粉+300 mL液體)、1∶15(20 g煤粉+300 mL 液體)、1∶20(15 g煤粉+300 mL液體)和對(duì)照(不加煤)共4組實(shí)驗(yàn),除固液比外其余參數(shù)相同(顆粒度120目,接種量20%),每組3個(gè)重復(fù);

    (3)接種量因素設(shè)置5%(286 mL培養(yǎng)基+14 mL菌液)、10%(273 mL培養(yǎng)基+27 mL菌液)、15%(261 mL培養(yǎng)基+39 mL菌液)、20%(250 mL培養(yǎng)基+50 mL菌液)和對(duì)照(不加接種物)共5組實(shí)驗(yàn),除接種量外其余參數(shù)相同(顆粒度120目,固液比1∶15),每組3個(gè)重復(fù)。

    1.4 PCR-DGGE指紋圖譜分析

    1.4.1 微生物總基因組DNA提取

    在發(fā)酵周期的前中后階段取樣,并提取基因組,具體方法參照文獻(xiàn)[12]。

    1.4.2 PCR擴(kuò)增

    提取的樣品基因組作為模板,用細(xì)菌V3區(qū)和古菌V3-V4區(qū)通用引物進(jìn)行目的片段的擴(kuò)增。在質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%的瓊脂糖凝膠中檢測(cè)目的片段。

    1.4.3 煤地質(zhì)微生物物種DNA Marker的制備

    所用煤地質(zhì)微生物細(xì)菌和古菌物種PCR-DGGE DNA Marker參照楊秀清等方法[9-10]制備,并結(jié)合各泳道內(nèi)DNA Marker條帶數(shù)和條帶間距等要素作出適當(dāng)?shù)男薷摹?/p>

    1.4.4 變性梯度凝膠電泳(DGGE)分析

    采用BIO-RAD Dcode系統(tǒng)對(duì)樣品16S rRNA基因片段PCR產(chǎn)物進(jìn)行DGGE指紋圖譜分析。樣品電泳時(shí),將煤層微生物物種DNA marker和樣品16S rRNA基因片段PCR產(chǎn)物上樣于同一塊變性膠上。變性梯度40%~60%,溫度60℃、電壓85 V條件下電泳12 h。凝膠成像儀采集膠圖信息并用定量軟件Quantity One進(jìn)行后續(xù)操作。

    1.5 數(shù)據(jù)分析

    單因素實(shí)驗(yàn)產(chǎn)氣結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì);統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS Statistics 22中的單因素方差分析(One-way ANOVA)方法分析顆粒度等因素對(duì)產(chǎn)氣的影響,顯著性水平設(shè)定為0.05;應(yīng)用生態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)處理軟件Canoco 5中的冗余分析(RDA)方法分析各因素樣本、環(huán)境因子與微生物群落之間的關(guān)系。

    1.6 褐煤FTIR分析及分峰擬合

    取KBr載體置于瑪瑙研缽中,加入少許煤樣,充分研磨、混勻、裝模,用壓片機(jī)把樣品壓制成透明薄片。固定薄片進(jìn)行掃描測(cè)試,掃描波數(shù)范圍為650 cm-1~4 000 cm-1,分辨率為 4 cm-1,累加掃描次數(shù)為16次。

    使用Origin 8.5軟件對(duì)紅外光譜譜圖進(jìn)行分段分峰擬合(Gaussian Fitting)。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 褐煤生物成氣單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

    2.1.1 煤顆粒度對(duì)甲烷產(chǎn)量的影響

    煤顆粒度對(duì)產(chǎn)氣的影響結(jié)果如圖1所示,隨著煤顆粒目數(shù)的增大(即粒徑的減?。?0 d發(fā)酵周期內(nèi)甲烷累計(jì)產(chǎn)量不斷增加。當(dāng)顆粒度為160目時(shí),最大甲烷產(chǎn)氣量達(dá)到543 mL。

    圖1 不同煤顆粒度對(duì)甲烷產(chǎn)量的影響Fig.1 Effects of different coal particle size on methane production

    有報(bào)道稱褐煤利用外源產(chǎn)甲烷菌群的產(chǎn)氣周期,可以分為產(chǎn)氣速率顯著增高、緩慢增高、趨于停止3個(gè)階段[13]。本實(shí)驗(yàn)中各因素所對(duì)應(yīng)的產(chǎn)氣情況符合這一趨勢(shì)。前期產(chǎn)氣較慢可能因?yàn)槊罕旧硎且环N復(fù)雜的生物大分子。當(dāng)煤經(jīng)降解成為小分子物質(zhì)時(shí),才易于被微生物利用。隨著煤粒徑目數(shù)的增大,煤表面破碎程度也增大,某些難降解的復(fù)雜結(jié)構(gòu)被打碎,適合產(chǎn)甲烷菌群的降解[14]。煤的比表面積也相應(yīng)提升,固液之間接觸面積越大,相應(yīng)的固液傳質(zhì)速率越快,即煤中有機(jī)質(zhì)溶出速率越快。單因素方差分析結(jié)果顯示,高目數(shù)組(160目)的產(chǎn)氣值與低目數(shù)組(40目)相比存在顯著性差異(P<0.01)。

    2.1.2 固液比對(duì)甲烷產(chǎn)量的影響

    不同固液比對(duì)甲烷產(chǎn)量的影響如圖2所示。固液比為1∶20,即煤粉添加量15 g時(shí),累計(jì)產(chǎn)甲烷量為510 mL,此時(shí)產(chǎn)氣情況最好。

    圖2 不同固液比對(duì)甲烷產(chǎn)量的影響Fig.2 Effects of different solid-liquid ratio on methane production

    煤可被微生物利用的有機(jī)物有限。隨著煤量增加,理論上微生物能夠利用的底物也隨之增加,從而導(dǎo)致產(chǎn)氣量的增長。但是當(dāng)煤粉添加量突破一定限度,如本實(shí)驗(yàn)中添加量至15 g以上時(shí),煤粉顆??赡墚a(chǎn)生堆積,有效參與傳質(zhì)的比表面積并未增加。單因素方差分析固液比因素對(duì)產(chǎn)氣的影響,低煤粉添加量組(1∶20)對(duì)應(yīng)產(chǎn)氣值相比高添加量組(1∶10)不存在顯著性差異(P>0.05)。

    2.1.3 接種量對(duì)甲烷產(chǎn)量的影響

    接種量因素對(duì)甲烷產(chǎn)量的影響見圖3,甲烷產(chǎn)量隨接種量的增加而小幅上升。接種量為20%時(shí),產(chǎn)氣情況最好,發(fā)酵周期內(nèi)累計(jì)產(chǎn)甲烷504 mL。

    圖3 不同接種量對(duì)甲烷產(chǎn)量的影響Fig.3 Effects of different inoculation amount on methane production

    在厭氧發(fā)酵中,加入一定量的微生物作為接種物是必要的。該組實(shí)驗(yàn)中,不接種的對(duì)照處理組產(chǎn)氣情況差,而接種量越大,啟動(dòng)越快,CH4累積量越多。比較低接種量組與高接種量組產(chǎn)氣數(shù)據(jù),單因素方差分析結(jié)果表明二者存在顯著性差異(P<0.05)。

    2.2 PCR—DGGE指紋圖譜分析

    2.2.1 樣品基因組的提取及16S rRNA目的片段擴(kuò)增

    質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所提基因組,質(zhì)量完好,可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)16S rRNA目的片段擴(kuò)增產(chǎn)物,條帶符合理論預(yù)期,可用于DGGE分析。

    2.2.2 DGGE分析

    鑒于顆粒度對(duì)產(chǎn)氣影響極顯著,我們以顆粒度樣品為例,進(jìn)行成氣過程中菌群結(jié)構(gòu)的分析。細(xì)菌16S rRNA V3區(qū)PCR-DGGE圖譜見圖4。本文引入煤地質(zhì)微生物細(xì)菌物種DNA Marker,根據(jù)DGGE能將片段大小相同而堿基組成不同的DNA片段分開的特性,認(rèn)為樣品中與Marker處于同一水平位置的條帶所屬菌屬地位與對(duì)應(yīng)的Marker相同。分析DGGE指紋圖譜,與煤地質(zhì)微生物細(xì)菌物種DNA Marker相匹配的有Clostridium、Tissierella、Desulfovibrio、Proteus、Citrobacter、Syntrophus、Lutaonella和Parabacteroides等屬菌種,它們分屬厚壁菌門、變形菌門和擬桿菌門等三個(gè)細(xì)菌門類。

    注:M1-M5:細(xì)菌物種DNA Marker 1—4分別代表顆粒度組目數(shù)為40目、80目、120目和160目的樣品圖4 細(xì)菌16S rRNA V3區(qū)PCR-DGGE圖譜M1-M5:Bacterial species DNA Marker 1-4 represents samples with a particle size of 40 mesh,80 mesh,120 mesh,and 160 mesh,respectivelyFig.4 PCR-DGGE fingerprint of bacterial 16S rRNA V3 region

    厚壁菌門(Firmicutes)中的微生物主要參與生成部分混合酸、醇和中性物質(zhì),Clostridium菌屬在一些淀粉、纖維質(zhì)和幾丁質(zhì)的解聚過程中起到關(guān)鍵作用[15],Tissierella菌屬可以利用有機(jī)物代謝產(chǎn)生乙酸、丁酸、氨氮和二氧化碳等物質(zhì)[16]。變形菌門(Proteobacteria)是細(xì)菌中最大的一門,所有變形菌門細(xì)菌均為革蘭氏陰性菌,其外膜主要由脂多糖組成。Desulfovibrio為硫酸鹽還原菌,為微生物提供能量同時(shí)減輕對(duì)甲烷菌的競(jìng)爭(zhēng)性抑制及毒害作用[17]。Proteus是一類兼性厭氧細(xì)菌,以氧化和發(fā)酵形式分解糖類產(chǎn)酸產(chǎn)氣。Citrobacter菌屬具有降解長鏈烷烴和還原硫酸鹽等功能[18-19]。Syntrophus菌屬具有降解烷烴和長鏈脂肪酸等功能[20-21]。擬桿菌門(Bacteroidetes)是一大類化能自養(yǎng)型微生物,樣品中屬于該門的菌屬有Lutaonella、Parabacteroides等,它們主要參與蛋白質(zhì)、糖、纖維素等大分子物質(zhì)的降解,發(fā)酵產(chǎn)生甲酸、氫氣和二氧化碳等。各樣品細(xì)菌相對(duì)物種豐度情況如圖5所示,細(xì)菌群落多樣性較為豐富,樣品間細(xì)菌種類相對(duì)豐度有較明顯差異。

    圖5 細(xì)菌菌群相對(duì)豐度柱狀圖Fig.5 Histogram of relative abundance of bacterial flora

    古菌16S rRNA V3-V4區(qū)PCR-DGGE圖譜見圖6。本實(shí)驗(yàn)中引入煤地質(zhì)微生物古菌物種DNA Marker,認(rèn)為樣品中與Marker處于同一水平位置的條帶所屬菌屬地位與對(duì)應(yīng)的Marker相同。與煤地質(zhì)微生物古菌物種DNA Marker相匹配的有Methanosarcina、Methanoculleus和Methanobacterium屬的菌種。需要說明的是,DGGE圖譜顯示樣品內(nèi)共有4組古菌條帶,經(jīng)過匹配,其中兩組均為Methanosarcina菌屬,可以認(rèn)為它們是甲烷八疊球菌屬下的不同種。產(chǎn)甲烷菌代謝類型主要包括氫營養(yǎng)型、乙酸營養(yǎng)型、甲基營養(yǎng)型和混合營養(yǎng)型,最新報(bào)道中可利用甲氧基的芳香族化合物直接產(chǎn)甲烷[22-23]。分類學(xué)上產(chǎn)甲烷菌被分為甲烷桿菌綱、甲烷球菌綱、甲烷微菌綱和甲烷火菌綱4綱7目。本文與煤地質(zhì)微生物古菌物種DNA Marker相匹配的菌種均為廣古菌門(Euryarchaeota),從屬水平分析可以發(fā)現(xiàn)群落中甲烷八疊球菌目的甲烷八疊球菌屬(Methanosarcina)和甲烷微菌目的甲烷囊菌屬(Methanoculleus)占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。另外,還有豐度較低的甲烷桿菌目的甲烷桿菌屬(Methanobacterium)。

    注:M1-M2:古菌物種DNA Marker 1—4分別代表顆粒度組目數(shù)為40目、80目、120目和160目的樣品圖6 古菌16S rRNA V3-V4區(qū)PCR-DGGE圖譜M1-M2:Archaea DNA Marker 1-4 represents samples with a particle size of 40 mesh,80 mesh,120 mesh,and 160 mesh,respectivelyFig.6 PCR-DGGE fingerprint of Archaea 16S rRNA V3-V4 region

    甲烷八疊球菌目是形態(tài)最豐富的一個(gè)目,在自然界分布廣泛,極端嚴(yán)格厭氧。當(dāng)生長于H2時(shí),CH4由甲醇和甲基胺還原而來;還可以代謝H2+CO2或乙酸,但從不利用甲酸。氮源為氨、甲基胺和N2,硫化物和元素硫可作為硫源[24-25]。Methanobacterium極端嚴(yán)格厭氧,能量代謝來源于還原CO2為CH4,電子供體只有H2、甲酸鹽、二元醇和CO,不能代謝甲基胺和乙酸,可在水田、沉積物或其他缺氧的且除CO2外無其他無機(jī)電子受體(如硝酸鹽或硫酸鹽)存在的環(huán)境分離到。Methanoculleus屬于甲烷微菌綱,以H2+CO2作為代謝底物,大部分也可以利用甲酸鹽為電子供體來還原CO2[26]。各樣品古菌相對(duì)物種豐度情況如圖7所示,古菌群落多樣性較為單一,樣品間古菌種類相對(duì)豐度存在較大差異,Methanosarcina和Methanobacterium的含量隨煤樣目數(shù)增加而增加,Methanoculleus的含量則呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。

    圖7 古菌菌群相對(duì)豐度柱狀圖Fig.7 Histogram of relative abundance of Archaea

    2.3 影響因素、菌群結(jié)構(gòu)與產(chǎn)氣量的關(guān)聯(lián)性分析

    RDA分析可以檢測(cè)環(huán)境因子、樣品、菌群三者之間的關(guān)系或者兩兩之間的關(guān)系?;诩?xì)菌物種和古菌物種進(jìn)行的RDA分析結(jié)果見圖8和圖9。從圖8可知,3種環(huán)境因子間無明顯交互作用。Citrobacter、Lutaonella、Parabacteroides、Syntrophus與接種量因素成正相關(guān)關(guān)系,且Lutaonella的響應(yīng)程度較大。Clostridium、Desulfovibrio、Tissierella、Proteus與顆粒度因素成正相關(guān)關(guān)系,且Clostridium和Tissierella的響應(yīng)程度較大。Parabacteroides、Syntrophus、Proteus、Tissierella與固液比因素成正相關(guān)關(guān)系,Tissierella的響應(yīng)程度較大。

    注:圓圈表示不同單因素條件下的樣本組(P:顆粒度,S:固液比,I:接種量);紅色箭頭表示環(huán)境因子;藍(lán)色箭頭表示不同屬的細(xì)菌/古菌物種。圖中部分菌種名采取簡寫形式。圖8 基于細(xì)菌物種進(jìn)行的RDA分析Circles indicate sample groups under different single factor conditions(P:granularity,S:solid-liquid ratio,I:inoculation amount);red arrows indicate environmental factors;blue arrows indicate bacteria/archae species of different genera;species and environment.Some strain names in the picture are abbreviated.Fig.8 RDA analysis based on bacterial species

    圖9 基于古菌物種進(jìn)行的RDA分析Fig.9 RDA analysis based on archaea species

    觀察圖9結(jié)合分析導(dǎo)出結(jié)果,顆粒度因素對(duì)古菌物種的影響具有顯著性(P<0.05),可以認(rèn)為是驅(qū)動(dòng)群落變異的主要因子。環(huán)境因子層面,固液比與接種量,固液比與顆粒度之間都是正相關(guān)關(guān)系。Methanoculleus與三個(gè)環(huán)境因子間均為負(fù)相關(guān)關(guān)系,Methanosarcina與Methanobacterium與三個(gè)環(huán)境因子間均為正相關(guān)關(guān)系。顆粒度因素組的四個(gè)樣本(P1:40目,P2:80目,P3:120目,P4:160目)隨著煤粒徑目數(shù)的增大,Methanosarcina與Methanobacterium的含量也增多。結(jié)合古菌菌群結(jié)構(gòu)變化和顆粒度因素組產(chǎn)氣數(shù)據(jù)繪制氣泡圖,結(jié)果如圖10所示,橫縱坐標(biāo)分別對(duì)應(yīng)Methanosarcina與Methanobacterium兩種古菌類型在相應(yīng)目數(shù)樣品中的含量,氣泡的大小指代產(chǎn)氣量的高低。不難發(fā)現(xiàn)隨著煤樣樣品目數(shù)的增大,產(chǎn)甲烷菌Methanosarcina與Methanobacterium的含量增多,產(chǎn)氣量也呈上升趨勢(shì)。

    2.4 褐煤FTIR分析及分峰擬合

    2.4.1 褐煤FTIR分析

    利用傅里葉變換紅外光譜(FTIR)對(duì)顆粒度組實(shí)驗(yàn)采集的煤樣的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究。紅外光譜結(jié)果見圖11。從圖11可以看到經(jīng)微生物菌群作用后的褐煤與原煤的紅外光譜圖相比各峰吸光度降低,說明煤被微生物消耗,煤中的物質(zhì)被微生物利用。降解前后的褐煤在紅外結(jié)構(gòu)方面無明顯差異,只是某些基團(tuán)相對(duì)增加或減少。這與佟威等[27]研究成果相類似。據(jù)報(bào)道,在3 693 cm-1/3 620 cm-1和1 033 cm-1/1 010 cm-1附近的吸收峰分別來自黏土礦物中的O—H和鋁硅酸鹽中的Si—O的拉伸振動(dòng)[28-30],并且上述峰的面積與煤中的礦物含量有明確的關(guān)系[31]。如圖11所示,隨著粒徑的減小,上述峰面積(接近3 693 cm-1/3 620 cm-1和1 033 cm-1/1 010 cm-1)呈上升趨勢(shì),說明顆粒越大,礦物含量越低。2 921 cm-1,2 850 cm-1和 1 440 cm-1附近的吸收峰分別歸因于烷烴中CH2的不對(duì)稱拉伸振動(dòng)和CH3的不對(duì)稱變形振動(dòng),并隨著粒徑的減小而減?。?2-33]。這表明較大的顆??赡芎懈嗟闹咀鍤洹4送?,隨著粒徑的減小,在798 cm-1和750 cm-1附近的吸光度峰增強(qiáng),這是由于每個(gè)環(huán)上有3個(gè)和4個(gè)相鄰氫的芳香族結(jié)構(gòu)中的平面外形變振動(dòng)=C—H所致[34],意味著較大的顆粒在有機(jī)物中含有較少的芳香氫。

    圖11 顆粒度組樣品紅外光譜Fig.11 Infrared spectra of particle size group

    綜上所述,可知,與對(duì)照組原煤煤樣相比,經(jīng)微生物降解作用后的褐煤某些基團(tuán)發(fā)生改變,說明產(chǎn)氣過程中微生物影響了煤樣的化學(xué)結(jié)構(gòu);同時(shí),某些基團(tuán)隨著影響因素(顆粒度目數(shù))的改變而規(guī)律性變化。由于吸收峰重疊,很難從圖中獲得額外有價(jià)值的信息。

    2.4.2 褐煤紅外光譜分峰擬合

    曲線擬合技術(shù)用于定量分析紅外結(jié)構(gòu)參數(shù)。Origin 8.5軟件用于分離重疊的吸收峰并計(jì)算峰面積。根據(jù)已報(bào)道的方法[35-37],每個(gè)紅外光譜分為4個(gè)波數(shù)帶,以顆粒度組160目樣品為例展示分段分峰擬合結(jié)果(圖12),其余目數(shù)組處理方法相同。共包括a)羥基吸收帶(3 600 cm-1~3 000 cm-1)[38],b)脂肪族吸收帶(3 000 cm-1~2 800cm-1)[39],c)含氧官能團(tuán)吸收帶(1 800 cm-1~1 000 cm-1)[40]和d)芳香族吸收帶(900 cm-1~700 cm-1)[40]。分峰擬合可以得到各波段內(nèi)擬合峰的具體位置、半峰全寬、最大高度和峰面積等信息。

    圖12 160目樣品不同波段的分峰擬合結(jié)果Fig.12 Fitting results of different wave bands of 160 mesh samples

    2.4.3 褐煤紅外結(jié)構(gòu)參數(shù)化

    為在模擬實(shí)驗(yàn)中直接觀察微生物引起煤樣品的化學(xué)和結(jié)構(gòu)變化,引入與紅外結(jié)構(gòu)有關(guān)的參數(shù):芳香環(huán)縮合(I1[35]),脂肪鏈分支度(I2[41]),脫氧指數(shù)(I3[42])和羥基含量(I4[43])。利用參考文獻(xiàn)中的方法,計(jì)算出不同目數(shù)樣品所對(duì)應(yīng)的I1—I4值,繪制圖13。結(jié)合圖像可知,I1隨粒徑的減小而逐漸降低;I2參數(shù)越大,表明樣品中脂肪鏈越長。隨著微生物對(duì)煤的降解,煤中脂肪鏈發(fā)生斷裂,形成短鏈或其他小分子物質(zhì),脂肪鏈支鏈化程度逐漸降低。粒徑的減小加速或有利于微生物對(duì)煤的降解;I3指含氧官能團(tuán)的變化,煤中側(cè)鏈及多數(shù)官能團(tuán)均在反應(yīng)中逐步脫落,造成煤中含氧官能團(tuán)的減少。較小的粒徑可能有助于側(cè)鏈和官能團(tuán)的脫落;I4隨煤粒徑的減小而明顯減小,進(jìn)一步證實(shí)了羥基是重要的可用于甲烷產(chǎn)生的含氧官能團(tuán)。結(jié)合顆粒度組產(chǎn)氣數(shù)據(jù)分析得到,產(chǎn)氣情況最好的高目數(shù)組(160目)在褐煤化學(xué)結(jié)構(gòu)方面與其他組相比芳香環(huán)縮合程度最低,脂肪鏈分支度最低,羥基等含氧官能團(tuán)脫落程度最高。

    圖13 四個(gè)樣品的I1—I4值Fig.13 I1—I4values of four samples

    3 結(jié)論

    (1)山西寺河礦區(qū)的煤層微生物可以利用內(nèi)蒙古勝利褐煤進(jìn)行產(chǎn)氣,對(duì)產(chǎn)氣影響最顯著的環(huán)境因子是顆粒度。

    (2)褐煤顆粒度因素是驅(qū)動(dòng)群落變異的主要因子。隨煤顆粒目數(shù)的增大,產(chǎn)甲烷菌屬M(fèi)ethanosarcina與Methanobacterium的含量增多,產(chǎn)氣量顯著提高。

    (3)生物成氣過程中微生物影響了煤樣的化學(xué)結(jié)構(gòu)。隨煤顆粒目數(shù)的增大,紅外結(jié)構(gòu)中芳香環(huán)縮合程度降低,脂肪鏈支鏈化程度降低,含氧官能團(tuán)減少。

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