針刺對戊四氮致癇大鼠抗癲癇機制的研究*

何 青，張齊娟，甘學文，曹庭欣

(湖北六七二中西醫(yī)結合骨科醫(yī)院，湖北 武漢 430000)

癲癇(Epilepsy)是神經(jīng)系統(tǒng)常見疾病之一，是多種原因引起的反復發(fā)作的腦功能失調綜合征，以短暫腦神經(jīng)元異常放電引起癇樣發(fā)作為特征，臨床表現(xiàn)為突發(fā)性意識喪失及肢體抽搐。癲癇的發(fā)病率與年齡有關，兒童和青少年發(fā)病率較高，隨著我國人口老齡化，腦血管病、癡呆等神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)病率升高，癲癇在老年人群的發(fā)病率呈上升趨勢。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計，全球大約有5 000萬癲癇患者，國內流行病學資料顯示我國目前有癲癇患者約900萬，活動性癲癇600余萬，且每年以45萬新患者數(shù)增長，患病率達5‰～7‰。癲癇屬中醫(yī)學“癇病”范疇，針刺療法是中醫(yī)學特有的治療疾病手段，數(shù)千年大量臨床實例證實針刺可抑制癲癇發(fā)作，但其作用機制至今尚未完全明了。為探究針刺治療癲癇的作用原理，本研究以戊四氮(Pentylenetetrazol,PTZ)致癇的SD大鼠為研究對象，針刺百會、大椎穴觀察對其行為學的影響，檢測癲癇大鼠腦內細胞凋亡因子caspase-3、bax和bcl-2的表達變化，為臨床針刺治療癲癇提供科學依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和試劑

健康雄性SD大鼠252只，體質量180～220 g，由華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物中心提供。戊四氮(Sigma公司)；兔抗caspase-3抗體(Santa Cruz公司);RT-PCR試劑( Fermentas公司);bcl-2、bax引物(上海生工生物技術有限公司合成);兔抗bcl-2抗體、兔抗bax抗體(博士德公司)。

1.2 分組造模和行為學表現(xiàn)觀察

將實驗動物隨機分成3組:生理鹽水對照組(NS組)、戊四氮致癇組(PTZ組) 、戊四氮致癇組+針刺治療組(針刺組)。癲癇發(fā)作分級參考Racine[1]的標準, 由輕到重分為6級。0級：無行為學改變；Ⅰ級：動物出現(xiàn)須動，咀嚼；Ⅱ級：動物出現(xiàn)頭面部抽搐；Ⅲ級：動物前肢或后肢節(jié)律性抽搐或陣攣；Ⅳ級：四肢節(jié)律性抽搐；Ⅴ級：全身強直性抽搐，并伴有甩尾或翻滾。針刺組于腹腔注射PTZ前半小時予針刺預處理，將該組大鼠固定于腦立體定位儀，參考《實驗針灸學》[2]《大鼠腦立體定位圖譜》[3]選取大鼠百會穴(GV20，頂骨正中)、大椎穴(GV14，定位：第7頸椎與第1胸椎之間，背部正中)，局部碘伏擦拭消毒，持0.25 mm×40 mm針灸針斜刺入百會穴、垂直刺入大椎穴,進針約15 mm深，每隔5 min行針1次。留針30 min后，PTZ組和針刺組大鼠分別予60 mg/kg PTZ 腹腔注射誘導建立癲癇模型，NS組腹腔注射等量生理鹽水，觀察各組大鼠行為學表現(xiàn)。針刺組大鼠腹腔注射0.5 h后再次行針刺治療30 min。

1.3 免疫組化法檢測大腦皮質、海馬Caspase-3的免疫反應性

各組大鼠分別于造模后36 h、72 h時間點予10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔麻醉后迅速開胸，經(jīng)左心室插管至升主動脈，快速灌注約37 ℃生理鹽水200 mL置換出血液，再以4%多聚甲醛(pH7.4)緩慢灌流30 min后，斷頭取腦組織塊，于4%多聚甲醛中后固定18～24 h，20%蔗糖中浸泡脫水過夜，冰凍成塊后于冰凍切片機上切片,每片厚25 μm，選取含背側海馬及大腦皮質的切片貼于明膠載玻片上，按照常規(guī)SABC染色操作步驟，滴加一抗兔抗caspase-3(1∶100)于4 ℃冰箱中孵育48 h，滴加二抗生物素化羊抗兔IgG(1∶100)孵育1 h，滴加SABC三抗(1∶100)孵育1 h，滴加DAB顯色5～10 min。各步驟之間用PBS充分漂洗，脫水、透明和中性樹膠封片，于Olympus BX 51顯微鏡下觀察、攝片。免疫染色對照試驗用PBS代替一抗，其余步驟同前。

1.4 半定量RT-PCR檢測海馬bcl-2、bax mRNA含量

按設定時間點對各組大鼠斷頭取出海馬組織，加入Trizol提取總RNA，將其溶解在DEPC水里，按照逆轉錄試劑盒進行逆轉錄得cDNA， bcl-2、bax引物序列根據(jù)bcl-2 cDNA序( GenBank AF218388)，利用Primer5軟件設計，Bcl-2上游引物：5′-TATGATAACCGGGAGATCGTGATC-3′，下游引物：5′-GTGCAGATGCCGGTTCAGGTACTC-3′,Bcl-2的擴增參數(shù)為：94 ℃變性45 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，33個循環(huán)，擴增產物的長度為525 bp；Bax上游引物：5′-GCTAATGGAGGAGAAGAAGT-3′，下游引物：5′-CTGACCTGTTGGACCTTGTG-3′，Bax的擴增參數(shù)為：94 ℃變性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30個循環(huán)，擴增產物的長度為298 bp；內參β-actin上游引物：5′-TGAGACCTTCAACACCCCAG-3′，下游引物：5′-GCCATCTCTTGCTCGAAGTC-3′，產物擴增長度為316 bp，β-actin的擴增參數(shù)為：95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個循環(huán),擴增產物的長度為316 bp，最后72 ℃延伸10 min后，再放4 ℃。將PCR產物置于0.2%瓊脂糖凝膠于50～60 V電泳槽里電泳2 h后于透視紫外燈下觀察、攝片，經(jīng)凝膠掃描儀處理分析條帶吸光度值(OD值)。每個樣本表達水平以其與β-actin吸光度的比值來表示。

1.5 顯微圖像分析和統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 各組大鼠行為學表現(xiàn)

根據(jù)Racine癲癇發(fā)作分級標準,本實驗中，PTZ組有須動、四肢節(jié)律性抽搐及全身強直陣攣發(fā)作，5 min左右達高峰，持續(xù)約10 min，以后逐漸減輕，發(fā)作為Ⅲ～Ⅴ級；針刺組抽搐發(fā)作的程度、持續(xù)時間及頻率明顯減低，I～Ⅲ級；NS組未見明顯行為異常。

2.2 各組caspase-3免疫組化結果

從神經(jīng)元的caspase-3免疫組化染色照片可見，在36 h及72 h時間點，NS組大腦皮質及海馬均有caspase-3免疫染色陽性細胞,見圖1中A、D、G、J;36 h時間點PTZ組大鼠大腦皮質及海馬錐體細胞層免疫染色較NS組顯著增強,見圖1中B、H;免疫染色陽性細胞數(shù)明顯增多;針刺組免疫染色及陽性細胞數(shù)較PTZ組降低,見圖1中C、I，但強于NS組(P<0.05);72 h時間點趨勢更為明顯，見圖1中E、K、F、L。各組平均吸光度(A)值的差異具有統(tǒng)計學意義，見表1。

注:A、G為36 h NS組，B、H為36 h PTZ組，C、I為36 h 針刺組，D、J為72 h NS組，E、K為72 h PTZ組，F(xiàn)、L為72 h針刺組。圖1 caspase-3免疫組化染色圖

分組n大腦皮質(36 h)海馬(36 h)大腦皮質(72 h)海馬(72 h)NS組420.378 8±0.019 30.196 0±0.013 60.390 1±0.025 50.175 6±0.019 3PTZ組420.620 9±0.028 1﹡0.381 0±0.091 5﹡0.841 2±0.031 7﹡0.538 5±0.024 2﹡ 針刺組420.485 0±0.037 4#0.277 1±0.019 6#0.579 0±0.031 7#0.367 4±0.021 6#

2.3 各組RT-PCR檢測bcl-2、bax表達結果

在36 h和72 h時間點，PTZ組bcl-2 mRNA的表達較NS組明顯減少(P<0.05)，針刺組bcl-2 mRNA的表達較NS組明顯減少、較PTZ組增加(P<0.05)，72 h點趨勢更為明顯。bax蛋白與bcl-2的表達水平呈負相關。RT-PCR電泳條帶掃描圖像及分析結果見表2、圖2。

圖2 各組海馬bcl-2、bax蛋白表達水平

3 討論

癲癇的發(fā)病機制十分復雜,目前尚未完全闡明，研究表明，其發(fā)生發(fā)展與炎性因子釋放、神經(jīng)細胞凋亡、突觸重構和膠質細胞功能異常等因素密切相關[4]，幾大因素之間可能存在著相互促進、互為因果的關系，干預這些病理過程，或許能夠在一定程度阻斷癲癇的發(fā)生、發(fā)展。戊四氮(PTZ)是一種經(jīng)典的致癇劑，戊四氮致癇模型被認為是一種較理想的急性全身強直-陣攣發(fā)作模型，其作用機制為PTZ競爭性地識別抑制性神經(jīng)遞質GABA位點, 從而阻遏由GABA介導的興奮抑制作用，引起癲癇發(fā)作[5]。癲癇引起大腦皮質和海馬結構神經(jīng)元凋亡，癲癇動物模型研究發(fā)現(xiàn)，癲癇所誘導的神經(jīng)元死亡在細胞化學和形態(tài)學上有細胞凋亡的特征[6]。

大量研究顯示，bcl-2家族和caspase家族在細胞凋亡轉導通路尤其是線粒體途徑中發(fā)揮了極為重要的調控作用,是近年來凋亡研究的熱點。caspase是一類存在于胞質中的半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶,caspase-3蛋白酶位于凋亡級聯(lián)反應下游，被稱為“死亡執(zhí)行蛋白酶”，執(zhí)行剪切細胞結構蛋白的作用，直接使細胞發(fā)生凋亡[7]。bcl-2家族中bcl-2和bax基因是目前已知的在凋亡調控過程中功能相互對立的一對最重要的調控基因,通常情況下bcl-2和bax兩種蛋白的表達量相對穩(wěn)定，當bax在細胞內超表達時，bax/bax同源二聚體的數(shù)量明顯增多，細胞對死亡信號的反應性增強，啟動凋亡；而當bcl-2高表達時，則bax/bax二聚體大量解離，生成更為穩(wěn)定的bcl-2/bax異源二聚體，對抗其誘導凋亡的作用，使細胞存活期延長[8]。研究發(fā)現(xiàn)[9]bcl-2、bax不但可作為caspase-3的上游調控機制，參與對caspase-3活性的調節(jié)，還可作為caspase-3的直接底物作用于caspase-3的下游，二者在細胞凋亡傳導過程中既相互聯(lián)系又相互制約。大量實驗證明，在caspase-3激活之前進行干預，可以有效抑制凋亡發(fā)生。

“百會”穴位于兩側三叉神經(jīng)第一支額神經(jīng)與枕大神經(jīng)的重疊支配區(qū)域，針刺“大椎”穴可刺激第8頸神經(jīng)和脊髓，有研究[10-11]表明電針刺激癲癇大鼠百會、大椎穴，腦電圖癇波出現(xiàn)明顯的潛伏期延長、波幅降低及癇波密度減小，擬認為電針刺激癲癇大鼠百會、大椎穴產生的神經(jīng)沖動傳入腦干三叉神經(jīng)感覺核后，經(jīng)網(wǎng)狀結構投射到腦內多個區(qū)域，產生抑癇信號抑制受損神經(jīng)元的異常放電。

本研究以凋亡相關因子caspase-3、bcl-2和bax作為觀察指標，以PTZ致癇大鼠并予以針刺百會、大椎穴,觀察各組大鼠的行為學表現(xiàn)，并分別于造模后36 h和72 h時間點取材，采用免疫組織化學法檢察各組大鼠大腦皮質及海馬神經(jīng)元caspase-3的免疫反應性，采用半定量RT-PCR法檢測大鼠海馬bcl-2、bax 蛋白的表達情況，探討針刺對癲癇發(fā)作后神經(jīng)元凋亡的影響。觀察發(fā)現(xiàn)，大鼠腹腔注射PTZ數(shù)分鐘后PTZ組大鼠即出現(xiàn)明顯抽搐，針刺組大鼠抽搐發(fā)作的程度、持續(xù)時間及頻率明顯減低；在36 h時間點，PTZ組大腦皮質及海馬神經(jīng)元caspase-3的免疫反應明顯強于對照組，bcl-2 mRNA表達較對照組減弱而bax表達明顯增強，針刺組caspase-3的免疫反應弱于PTZ組,bcl-2表達較PTZ組增強，bax則相對減弱，72 h時間點各組更為顯著, bcl-2與bax蛋白的表達水平均呈負相關。實驗結果表明針刺PTZ致癇大鼠百會、大椎穴可減輕癲癇發(fā)作程度，抑制癲癇大鼠大腦皮質及海馬神經(jīng)元caspase-3的免疫反應性，拮抗bcl-2、bax蛋白的表達失衡。

本研究進一步證實PTZ致癇誘導大鼠海馬神經(jīng)元凋亡，針刺可一定程度拮抗凋亡發(fā)生、減輕癲癇發(fā)作程度，其作用機制可能是通過干預凋亡相關因子的表達、調控神經(jīng)細胞凋亡途徑從而發(fā)揮神經(jīng)保護作用，為臨床針刺治療癲癇提供了新的科學依據(jù)。