羅非魚肌漿蛋白源抗氧化肽的制備、分離純化及其體外抗氧化活性

胡 曉，周 雅,2，陳星星,2，李來好,*，楊賢慶，陳勝軍，吳燕燕，楊少玲

（1.中國水產(chǎn)科學研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品加工重點研究室，廣東 廣州 510300；2.上海海洋大學食品學院，上海 201306）

自由基是生物體在氧化反應(yīng)過程中產(chǎn)生的中間產(chǎn)物，當自由基的產(chǎn)生和清除無法平衡時，過量的自由基會破壞超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和過氧化物酶等關(guān)鍵酶類，并通過氧化細胞膜脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA等對機體組織及細胞產(chǎn)生嚴重的氧化損傷，進而導(dǎo)致機體衰老、癌癥和心血管病等各種疾病的發(fā)生[1]，因此使用抗氧化劑減少機體的氧化損傷成為人們?nèi)找骊P(guān)注的焦點。此外，食品中的脂質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)易于氧化，會導(dǎo)致食品品質(zhì)下降，縮短其貨架期，以致于需在食品生產(chǎn)及儲運過程中添加抗氧化劑，但目前常用的人工合成抗氧化劑會對人體產(chǎn)生一定的不良影響，甚至與癌癥的發(fā)生有關(guān)[2]。因此，亟需尋找安全、無毒的天然抗氧化活性物質(zhì)?？寡趸钚噪氖且环N具有清除體內(nèi)自由基和抑制生物大分子過氧化作用的生物活性肽，具有較高的抗氧化活性和安全性，應(yīng)用前景十分廣闊。

水產(chǎn)品中蛋白質(zhì)含量高且營養(yǎng)豐富，已成為近年來國內(nèi)外制備抗氧化肽的重要原料[2-6]。從水產(chǎn)抗氧化肽的相關(guān)研究結(jié)果來看，其分子質(zhì)量大多主要分布在300～1 500 Da之間，其肽鏈通常含有一個或多個疏水性氨基酸殘基（Gly、Leu、Ala、Pro等）、親核含硫氨基酸殘基（Cys、Met）、芳香族氨基酸殘基（Phe、Trp、Tyr）以及含有咪唑環(huán)的組氨酸殘基（His）。此外，多肽中氨基酸的位置及序列也與其抗氧化活性有關(guān)，如堿性氨基酸位于肽段的C端會使其具有更高的自由基清除能力[7]。盡管國內(nèi)外對抗氧化活性肽已經(jīng)開展了大量研究，但其氨基酸組成特征、構(gòu)效關(guān)系以及作用機理還需進一步研究和驗證。羅非魚是我國大宗養(yǎng)殖魚類，產(chǎn)量位居世界首位，其肉的蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)可高達19%，且所含氨基酸種類齊全、比例合理，是利用生物酶解法制備功能性肽的理想原料來源，但目前羅非魚肉的加工利用主要以冷凍羅非魚片為主，產(chǎn)品的附加值較低，其蛋白質(zhì)高值化利用程度有待進一步提高，因此研究羅非魚肉的精深加工及高值化利用具有十分重要的意義[8-10]。目前，以羅非魚肉為原料，采用不同的蛋白酶對其水解制備抗氧化活性肽已有報道[11-13]。由于羅非魚肉蛋白主要由肌原纖維蛋白、肌漿蛋白與基質(zhì)蛋白構(gòu)成，而不同組分蛋白及其酶解產(chǎn)物的抗氧化活性可能會存在較大差異。因此，以羅非魚肌肉蛋白組分為研究對象，篩選并分離富集出高活性組分的蛋白源抗氧化肽，可為羅非魚抗氧化肽的研究與開發(fā)提供重要依據(jù)。本研究采用木瓜蛋白酶對羅非魚肌肉蛋白組分進行酶解，比較并探討不同組分蛋白其酶解產(chǎn)物的抗氧化活性，并通過超濾、凝膠過濾色譜、反相高效液相色譜（reversed-phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）對活性較高的肌漿蛋白源抗氧化肽進行了分離純化，同時對其氨基酸組成予以分析，旨在為羅非魚精深加工及高值化利用提供理論依據(jù)及參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羅非魚購于廣州華潤萬家超市，取魚肉，洗凈瀝干，絞碎，置于聚乙烯袋中于-20 ℃凍藏備用。

木瓜蛋白酶 廣東江門拜奧生物化學廠；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，D P P H）、細胞色素c（1 2 4 0 0 D a）、抑肽酶（6 511.83 Da）、維生素B12（1 355.37 Da）、氧化型谷胱甘肽（612.63 Da）、還原性谷胱甘肽（307.32 Da）美國Sigma公司；鄰二氮菲 上海韶遠化學科技有限公司；鄰苯三酚 廣州菲博生物科技公司；三氟乙酸、乙腈、甲醇（均為色譜純） 上海安譜科學儀器有限公司；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DK-S24型恒溫水浴鍋 上海森信實驗儀器廠有限公司；BS 224S型電子精密天平 德國Sartorius公司；Delta320精密pH計 梅特勒-托利多（上海）儀器有限公司；UV2550型紫外-可見分光光度計 日本島津公司；T50均質(zhì)機 德國IKA公司；SUNRISE酶標儀 瑞士TECAN公司；3K30型高速冷凍離心機 德國Sigma公司；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州澳華儀器有限公司；THZ-82水浴恒溫振蕩器 金壇精達儀器制造廠；超純水系統(tǒng)、Labscale TFF system小型切向流超濾系統(tǒng)美國Milipore公司；Sephadex G-25 美國GE公司；1100型高效液相色譜、C18半制備柱（9.4 mm×250 mm，5 μm）、C18分析柱（4.6 mm×150 mm，2.7 μm）、Elicpse AAA柱（4.6 mm×150 mm，3.5 μm） 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 羅非魚肉不同組分蛋白的分離制備

羅非魚肉不同組分蛋白參照課題組前期研究的方法[14]進行制備。各組分蛋白的提取率為提取得到的各組分蛋白質(zhì)量與羅非魚肉蛋白的質(zhì)量比。

1.3.2 羅非魚肉不同組分蛋白酶解產(chǎn)物的制備

將提取的各組分蛋白用蒸餾水（4 ℃）稀釋成蛋白質(zhì)量分數(shù)約4%的溶液，勻漿后，將蛋白溶液pH值調(diào)節(jié)至6.0，加入蛋白溶液中蛋白質(zhì)量2.5%的木瓜蛋白酶，60 ℃下恒溫水浴振蕩酶解1、2、4、6、8 h。酶解至終點時于沸水中滅酶15 min，冷卻后離心（10 000 r/min、4 ℃，10 min），取上清液抽濾，濾液即為不同組分蛋白酶解液。

1.3.3 羅非魚肉不同組分蛋白酶解液的超濾分離

將酶解液在室溫下通過截留分子質(zhì)量分別為10 kDa與5 kDa的超濾膜，收集截留液和濾過液，所得組分分別記為TSPH-1（10 kDa以上）、TSPH-2（5～10 kDa）、TSPH-3（5 kDa以下），將各組分冷凍干燥后配制成質(zhì)量濃度為3 mg/mL的溶液用于測定抗氧化活性。

1.3.4 凝膠過濾色譜分離

將超濾分離所得抗氧化活性最高的組分經(jīng)過0.22 μm微孔濾膜過濾后，利用Sephadex G-25凝膠柱予以進一步分離純化。色譜分離條件：進樣量為1 mL，進樣質(zhì)量濃度為50 mg/mL，以超純水作為洗脫液，洗脫液流速為1.0 mL/min，在215 nm波長處多次重復(fù)進樣收集各分離峰組分，冷凍干燥后測定其抗氧化活性。同時以細胞色素c（12 400 Da）、抑肽酶（6 511.83 Da）、維生素B12（1 355.37 Da）、氧化型谷胱甘肽（612.63 Da）、還原性谷胱甘肽（307.32 Da）作為標準品，測定樣品的分子質(zhì)量。

1.3.5 RP-HPLC分離

取凝膠過濾色譜分離所得抗氧化活性最高的組分，采用RP-HPLC C18半制備柱予以進一步分離純化。色譜分離條件：進樣量為100 μL，進樣質(zhì)量濃度為5 mg/mL，流動相A為體積分數(shù)0.1%三氟乙酸，流動相B為乙腈，流速為2.0 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長為215 nm，梯度洗脫。多次重復(fù)進樣收集各分離峰，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后冷凍干燥測定其抗氧化活性。

將C18半制備柱分離富集得到的抗氧化活性最高的峰組分用C18分析柱鑒定其純度，色譜分離條件：洗脫液為體積分數(shù)25%甲醇溶液，洗脫流速為0.3 mL/min，檢測波長為215 nm。

1.3.6 氨基酸組成分析

氨基酸組成分析按照GB/T 5009.124—2016《食品安全國家標準 食品中氨基酸的測定》中的方法進行。

1.3.7 ·OH清除能力的測定

參照Jin Ming等[15]的方法并有所修改。取0.6 mL 5 mmol/L鄰二氮菲的無水乙醇溶液，與0.4 mL 0.15 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）混勻后加入0.6 mL 0.75 mmol/L的FeSO4溶液，加入樣品溶液2 mL后充分搖勻，再加入0.4 mL體積分數(shù)0.1%的H2O2溶液混勻，37 ℃條件下水浴1 h，于536 nm波長處測得吸光度A1；以去離子水代替樣品和H2O2溶液重復(fù)上述操作，測得吸光度A2；以去離子水代替樣品重復(fù)上述操作，測得吸光度A3。按公式（1）計算·OH清除率。

1.3.8 DPPH自由基清除能力的測定

參照Bae等[16]的方法并稍作修改。取2 mL樣品溶液，加入2 mL 0.15 mmol/L DPPH溶液（用體積分數(shù)95%的乙醇溶液溶解），混勻后在室溫條件下避光反應(yīng)30 min，于517 nm波長處測定吸光度A1，對照組以2 mL體積分數(shù)95%的乙醇溶液代替DPPH溶液，于517 nm波長處測定吸光度A2，空白組為2 mL DPPH溶液加2 mL體積分數(shù)95%的乙醇溶液，于517 nm波長處測定吸光度A3。按公式（2）計算DPPH自由基清除率。

1.3.9 超氧陰離子自由基清除能力的測定

參照Markhund等[17]的方法并有所修改。取0.2 mL樣品溶液，加入5.6 mL 0.1 mol/L Tris-HCl緩沖溶液（pH 8.2），混勻后在25 ℃中水浴10 min，再加入0.2 mL 3 mmol/L的鄰苯三酚溶液，振蕩搖勻后立即在325 nm波長處測定吸光度，測定時間為5 min，每30 s讀數(shù)一次。以0.2 mL去離子水加5.6 mL 0.1 mol/L的Tris-HCl緩沖溶液（pH 8.2）調(diào)零，對照組以去離子水代替樣品。作吸光度隨時間變化的回歸方程，斜率即為鄰苯三酚自氧化速率，按公式（3）計算超氧陰離子自由基清除率。

式中：v1為樣品組的鄰苯三酚自氧化速率；v2為對照組的鄰苯三酚自氧化速率。

1.3.10 還原力測定

參照Ahmadi等[18]的方法并稍作修改。取1 mL樣品液，加入1 mL 0.2 mol/L的磷酸緩沖液（pH 6.6）和1 mL質(zhì)量分數(shù)1%的鐵氰化鉀溶液，混勻后50 ℃下水浴20 min，加入1 mL 10%的三氯乙酸溶液，混勻后10 000 r/min離心10 min。取1 mL上清液，加入1 mL去離子水和0.2 mL質(zhì)量分數(shù)0.1%的FeCl3溶液，混勻后50 ℃水浴10 min，在700 nm波長處測定其吸光度，以A700nm代表還原力。用去離子水代替樣品作為空白對照。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel軟件處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示，采用Origin 8.0軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 羅非魚肉各組分蛋白提取率

采用本實驗的分離方法，羅非魚肉各組分蛋白提取率的大小為：肌原纖維蛋白＞肌漿蛋白＞基質(zhì)蛋白。其中，基質(zhì)蛋白的提取率為（5.62±0.13）%，高于草魚（3.12%）等魚類[19]；肌漿蛋白的提取率為（28.11±0.53）%，高于鳙魚（26.14%）[19]，但低于鯽魚（33.23%）等魚類[19]；肌原纖維蛋白的提取率為（62.14±1.12）%，與鯉魚相近（62.87%）[19]。

2.2 酶解時間對各組分蛋白酶解物抗氧化活性的影響

2.2.1 不同組分蛋白酶解物的DPPH自由基清除率

各組分蛋白酶解物的DPPH自由基清除率如圖1所示，肌漿蛋白在酶解4 h時的DPPH自由基清除率達到最高，為84.61%；基質(zhì)蛋白和肌原纖維蛋白酶解物對DPPH自由基的清除率較為接近，均在酶解1 h時清除率達到最高，分別為32.34%和31.35%。

圖1 酶解時間對羅非魚各組分蛋白酶解物DPPH自由基清除率的影響Fig.1 Effect of hydrolysis time on DPPH radical scavenging capacity of hydrolysates prepared from tilapia muscle proteins

對比羅非魚3 種組分蛋白酶解物對DPPH自由基的清除率可知，肌漿蛋白酶解物明顯高于肌原纖維蛋白和基質(zhì)蛋白酶解物。陳星星等[14]用中性蛋白酶對羅非魚肉不同組分蛋白進行酶解，得到肌漿蛋白酶解物DPPH自由基的半清除質(zhì)量濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）為3.554 mg/mL，顯著低于肌原纖維蛋白（14.886 mg/mL）和基質(zhì)蛋白酶解物（13.389 mg/mL）的IC50，這與本實驗的研究結(jié)果相一致。

2.2.2 不同組分蛋白酶解物的·OH清除率

·OH是化學性質(zhì)非?；顫姷囊环N活性氧，在活性氧中其危害性最大，一旦與物質(zhì)接觸，幾乎可以在瞬間發(fā)生反應(yīng)[20]?！H可以通過Fenton反應(yīng)產(chǎn)生，反應(yīng)式為Fe2++H2O2→Fe3++·OH+OH-，鄰二氮菲-Fe2+會被·OH氧化成鄰二氮菲-Fe3+，從而使536 nm波長處最大吸收峰消失，當有抗氧化物存在時，抗氧化物會抑制·OH將鄰二氮菲-Fe2+氧化成鄰二氮菲-Fe3+，顏色變化明顯，從而能夠判斷出抗氧化物對·OH的抑制情況[21]。

圖2 酶解時間對羅非魚各組分蛋白酶解物·OH清除率的影響Fig.2 Effect of hydrolysis time on hydroxyl radical scavenging capacity of hydrolysates prepared from tilapia muscle proteins

各組分蛋白酶解產(chǎn)物清除·OH的能力如圖2所示，肌漿蛋白酶解物對·OH的清除率隨著酶解時間的延長先呈上升趨勢，在4 h時達到最大，為50.01%；而繼續(xù)延長酶解時間，其清除率逐步下降；基質(zhì)蛋白酶解物的·OH清除率在酶解1 h時達到最高，為26.67%，隨后降低；肌原纖維蛋白酶解物對·OH的清除率隨著酶解時間的延長呈緩慢下降的趨勢，清除率最高為11.67 %。

對比3 種組分蛋白酶解物·OH的清除能力可知，清除率的大小順序為肌漿蛋白酶解物＞基質(zhì)蛋白酶解物＞肌原纖維蛋白酶解物，說明采用木瓜蛋白酶酶解時，肌漿蛋白酶解物是羅非魚肌肉蛋白酶解物中·OH清除能力最高的組分。酶解物樣品的·OH清除率變化趨勢與DPPH自由基清除率結(jié)果相一致。

2.2.3 不同組分蛋白酶解物的超氧陰離子自由基清除率

超氧陰離子具有很強的活性，能夠使多糖解聚、核酸鏈斷裂，并引發(fā)細胞膜脂質(zhì)過氧化，造成線粒體氧化磷酸化作用的改變以及膜損傷等[22-23]。生物體內(nèi)的超氧陰離子自由基可以通過歧化反應(yīng)生成H2O2，H2O2可以與Fe2+或Cu2+等離子生成氧化性更強的·OH。本研究采用鄰苯三酚自氧化法測定酶解物超氧陰離子自由基清除率，鄰苯三酚在堿性環(huán)境下自氧化可以生成超氧陰離子自由基，并產(chǎn)生有色中間產(chǎn)物，當有抑制物存在時，超氧陰離子自由基被清除，有色中間產(chǎn)物積累減少；因此，可通過檢測有色中間產(chǎn)物的含量來評價樣品的超氧陰離子自由基的清除能力。

圖3 酶解時間對羅非魚各組分蛋白酶解物超氧陰離子自由基清除率的影響Fig.3 Effect of hydrolysis time on superoxide anion radical scavenging capacity of hydrolysates prepared from tilapia muscle proteins

羅非魚各組分蛋白酶解物對超氧陰離子自由基清除率如圖3所示，3 種組分蛋白均在酶解2 h時具有最高的超氧陰離子自由基清除活性，其中肌漿蛋白酶解物清除活性最高，為19.80%；基質(zhì)蛋白酶解物與肌原纖維蛋白酶解物的清除活性無明顯差異，分別為17.97%和18.03%。3 種蛋白酶解物超氧陰離子自由基清除率均在酶解1～2 h快速上升，2～8 h呈現(xiàn)不同程度的下降趨勢。從結(jié)果來看，肌漿蛋白是羅非魚肉蛋白組分中制備高抗氧化活性酶解產(chǎn)物的最適組分。

2.2.4 不同組分蛋白酶解物的還原力

圖4 酶解時間對羅非魚各組分蛋白酶解物還原力的影響Fig.4 Effect of hydrolysis time on reducing power of hydrolysates prepared from tilapia muscle proteins

還原力能夠衡量抗氧化劑供電子能力的強弱。由圖4可知，肌漿蛋白酶解物的還原力隨酶解時間延長的趨勢與其清除DPPH自由基、·OH活性的變化趨勢相似，均在酶解4 h時達到最高值，且其還原力（0.629）明顯高于基質(zhì)蛋白和肌原纖維蛋白酶解物。馬賽蕊[13]與王強[24]等對羅非魚肉蛋白酶解產(chǎn)物的抗氧化活性進行了研究，發(fā)現(xiàn)其經(jīng)木瓜蛋白酶水解后的產(chǎn)物具有較高的還原力，本研究結(jié)果進一步表明羅非魚木瓜蛋白酶水解物中高還原力組分主要來源于肌漿蛋白。

綜合上述不同酶解時間各組分蛋白酶解物的抗氧化活性，本研究以抗氧化活性最高的肌漿蛋白酶解物（4 h）為對象，通過超濾、凝膠過濾色譜等分離技術(shù)，分離富集具有高活性的抗氧化肽。

2.3 肌漿蛋白酶解液超濾分離及各組分的抗氧化活性

圖5 TSPH超濾組分的抗氧化活性Fig.5 Antioxidant activities of the fractions obtained from TSPH by ultrafiltration

如圖5所示，超濾分離后各組分均具有一定的抗氧化活性，同時分子質(zhì)量最小的超濾組分TSPH-3具有最高的抗氧化活性，其對DPPH自由基、·OH、超氧陰離子自由基的清除率及還原力最高，分別為57.79 %、16.81%、13.56%和0.476。郝更新等[25]用超濾法對牡蠣蛋白的抗氧化活性肽進行了分離富集，發(fā)現(xiàn)分子質(zhì)量小于4 kDa組分的抗氧化活性高于原液及其他超濾組分。郭善廣等[26]對羅非魚內(nèi)臟蛋白酶解物的超濾分離組分進行了抗氧化活性分析，發(fā)現(xiàn)各組分的抗氧化活性大小順序依次為5 kDa以下組分、5～10 kDa組分、10 kDa以上組分，這與本研究結(jié)果相一致。但也有學者研究發(fā)現(xiàn)小分子質(zhì)量的蛋白肽抗氧化活性并不一定最高，張爽等[27]研究發(fā)現(xiàn)鮑魚外套膜酶解物分子質(zhì)量為3～5 kDa的組分對·OH和DPPH自由基的清除能力要高于分子質(zhì)量小于1 kDa的組分，說明肽的抗氧化活性與其分子質(zhì)量相關(guān)，但同時可能也會受到其氨基酸組成與序列的影響。

2.4 凝膠過濾色譜分離及各組分的抗氧化活性

選擇超濾分離后抗氧化活性最高的TSPH-3組分予以進一步的分離純化。圖6為TSPH-3的凝膠過濾分離色譜圖。經(jīng)凝膠過濾分離后，主要富集得到4 個組分峰，分別標記為E1、E2、E3、E4，其中E1組分出峰時間最早，表明其分子質(zhì)量最大，E4組分出峰時間最晚，表明其分子質(zhì)量最小。通過分子質(zhì)量計算，各組分峰的分子質(zhì)量分布范圍為：1.7 kDa以上（E1）、1.7～0.8 kDa（E2）、0.8～0.3 kDa（E3）、0.3 kDa以下（E4）。

圖6 TSPH-3組分的凝膠過濾分離色譜圖Fig.6 Gel filtration chromatogram of TSPH-3

將凝膠色譜分離所得各組分峰收集后冷凍干燥，分別配制成3 mg/mL溶液后測定其DPPH自由基清除率及還原力，結(jié)果如圖7所示。比較各組分峰對DPPH自由基的清除活性可看出，E3組分的清除率明顯高于其他各組分，其清除率高達83.61%。此外，E1、E2、E4組分的DPPH自由基的清除率均低于TSPH-3組分。對比各組分的還原力可知，E3組分還原力為0.953，其與E4組分還原力差異不明顯，而E1和E2組分的還原力較低，分別為0.235、0.319。綜合上述抗氧化活性結(jié)果可知，E3組分（0.8～0.3 kDa）的抗氧化活性最強，可予以進一步分離純化，富集出高活性抗氧化肽。

圖7 凝膠過濾色譜分離組分的抗氧化活性Fig.7 Antioxidant activities of the fractions obtained from TSPH-3 by gelhk Lltration chromatography

2.5 RP-HPLC分離及各組分的抗氧化活性

圖8 為E3組分的RP-HPLC（半制備柱）分離色譜圖。經(jīng)RP-HPLC分離后，主要富集得到9 個組分峰，依次標記為F1～F9。

圖8 E3組分的RP-HPLC分離色譜圖Fig.8 RP-HPLC profile of E3

收集經(jīng)RP-HPLC分離純化得到的9 個組分峰，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后冷凍干燥，測定各組分峰的DPPH自由基IC50，結(jié)果如圖9所示。通過比較各組分峰的DPPH自由基IC50可知，F(xiàn)4組分的IC50最低，為0.78 mg/mL，表明F4組分的抗氧化活性最高。此外，通過對比分離前后不同組分的DPPH自由基清除率可知，F(xiàn)4組分的清除活性比E3組分提高了2 倍以上，比羅非魚肌漿蛋白提高了5 倍以上（1 mg/mL的F4 DPPH自由基清除率為86.73%，3 mg/mL的E3 DPPH自由基清除率為83.61%，6 mg/mL的羅非魚肌漿蛋白DPPH自由基清除率為84.61%）。由此可知，通過超濾、凝膠過濾色譜、RP-HPLC可將羅非魚肌漿蛋白源高活性抗氧化肽予以有效地分離富集。

圖9 RP-HPLC分離各組分的抗氧化活性Fig.9 Antioxidant activity of the fractions obtained from E3 by RP-HPLC

對抗氧化活性最高的F4組分予以收集，用C18分析柱對其純度進行鑒定，結(jié)果如圖10所示。F4組分只洗脫出一個主峰，出峰時間在8.512 min，無其他明顯的雜質(zhì)峰。總體來看，F(xiàn)4組分純度較高。

圖10 F4組分的RP-HPLCFig.10 RP-HPLC profile of F4

2.6 F4組分氨基酸組成分析結(jié)果

對高活性抗氧化肽（F4組分）的氨基酸組成進行測定，結(jié)果如表1所示。一些氨基酸如色氨酸、酪氨酸、組氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸等通常被認為是具有一定抗氧化活性的氨基酸[4,28]。由表1可知，F(xiàn)4組分中組氨酸、甘氨酸、酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等氨基酸含量較高，其中含量最高的3 種氨基酸為色氨酸、甘氨酸、組氨酸，其相對含量分別高達31.20%、27.25%和8.97%，三者含量占總氨基酸含量的67.42%。F4組分富含的氨基酸中，色氨酸是一種芳香族氨基酸，較易釋放質(zhì)子提供給缺電子的自由基，從而使自由基淬滅[29]；組氨酸含有的咪唑環(huán)可以螯合金屬離子，從而抑制由金屬離子催化或促進產(chǎn)生的氧化反應(yīng)，使得肽段具有較好的抗氧化活性[30]；甘氨酸是一種分子中同時含有酸性和堿性官能團的氨基酸，其是強抗氧化劑谷胱甘肽的重要組成氨基酸，同時也是海參蛋白源和海水魚蛋白源抗氧化肽的主要組成氨基酸[31-32]。由此可知，F(xiàn)4組分的高抗氧化活性與其氨基酸組成存在重要聯(lián)系。

表1 F4組分的氨基酸組成Table 1 Amino acid composition of F4

3 結(jié) 論

采用木瓜蛋白酶對羅非魚不同肌肉蛋白組分進行酶解，發(fā)現(xiàn)羅非魚肌漿蛋白酶解物的抗氧化活性高于肌質(zhì)與肌原纖維蛋白酶解物，且羅非魚肌漿蛋白酶解4 h時的產(chǎn)物（TSPH）具有最高的抗氧化活性，其DPPH自由基、·OH清除率和還原力分別為84.61%、50.01%和0.629。同時，利用超濾對羅非魚肌漿蛋白中的高活性抗氧化肽進行了分離純化，發(fā)現(xiàn)分子質(zhì)量小于5 kDa的肽組分具有較高的抗氧化活性，再經(jīng)凝膠過濾色譜分離后發(fā)現(xiàn)分子質(zhì)量為0.8～0.3 kDa的肽組分抗氧化活性最高。最后，通過RP-HPLC分離得到的高活性抗氧化肽F4，其DPPH自由基IC50為0.78 mg/mL，其活性比羅非魚肌漿蛋白提高了5 倍以上，經(jīng)氨基酸分析發(fā)現(xiàn)其富含色氨酸（Trp）、甘氨酸（Gly）、組氨酸（His），相對含量分別高達31.20%、27.25%和8.97%，占總氨基酸含量的67.42%。