條斑紫菜多糖的降解條件優(yōu)化及其生物活性

姜 慧，孔立敏，王 翀，王彥波，傅玲琳，周 濤

（浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310018）

條斑紫菜（Porphyra yezoensis）是一種多產(chǎn)于東亞國(guó)家的經(jīng)濟(jì)型褐藻，在我國(guó)江蘇沿海有較大的栽培區(qū)域，以此為原料加工的產(chǎn)品外銷量約占全球條斑紫菜貿(mào)易總量的一半，但基本都是初級(jí)加工產(chǎn)品。研究表明條斑紫菜多糖有抗氧化、降血脂、抑制癌細(xì)胞增長(zhǎng)、免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性[1]，而多糖的生物活性常與其結(jié)構(gòu)以及分子質(zhì)量有關(guān)[2-4]，但由于條斑紫菜多糖（Porphyra yezoensispolysaccharide，PSPY）分子質(zhì)量較大、表觀黏度較高和水溶性相對(duì)較低等原因，其產(chǎn)品開發(fā)和活性研究受到限制，故對(duì)多糖進(jìn)行降解，降低多糖分子質(zhì)量和表觀黏度，基本結(jié)構(gòu)暴露更多的活性基團(tuán)有利于提高多糖的生物活性。

降解多糖有超聲波降解法[5]、酶降解法[6]和化學(xué)降解法等多種方法，化學(xué)降解又分為酸降解、堿降解和氧化降解，其中H2O2和VC聯(lián)合降解法環(huán)保并且接近植物體內(nèi)氧化還原反應(yīng)[7]，如Hou Yun等[8]研究表明經(jīng)H2O2-VC降解的巖藻糖基本結(jié)構(gòu)無(wú)明顯變化，降解后多糖的抗氧化性增強(qiáng)；Chen Bingjie等[9]用H2O2-VC降解羊棲菜多糖，發(fā)現(xiàn)降解后多糖的抗氧化性顯著提高，再結(jié)合本課題組的前期研究[10-13]，本實(shí)驗(yàn)采取H2O2-VC聯(lián)合法降解PSPY，并對(duì)降解條件進(jìn)行優(yōu)化以制備具有較高自由基清除活性的多糖。對(duì)條斑紫菜降解多糖（degradedPorphyra yezoensispolysaccharide，DPSPY）進(jìn)行表征和活性研究，與PSPY進(jìn)行對(duì)比，為研發(fā)具有良好抗氧化、降血脂、提高免疫活性的PSPY相關(guān)功能性食品提供理論依據(jù)，以延長(zhǎng)產(chǎn)品商業(yè)鏈，提高條斑紫菜的附加值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

條斑紫菜（Porphyra yezoensis）購(gòu)于江蘇南通昌鈺海苔有限公司。

木瓜蛋白酶、豬胰酶、肌醇、普魯蘭多糖、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-d i p h e n y l-2-picrylhydrazyl，DPPH）、DMEM高糖完全培養(yǎng)液、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer，PBS） 吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)公司；脂多糖 美國(guó)Sigma公司；胎牛血清 浙江杭州四季青生物工程有限公司；MTT細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒、中性紅 上海生工生物工程有限公司；磺胺、萘乙二胺（N-(1-萘基)乙二胺二鹽酸鹽）、亞硝酸鉀 上海阿拉丁試劑有限公司；總膽汁酸試劑盒 南京建成生物科技有限公司。其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HERAcell 150i型CO2培養(yǎng)箱 上海納锘實(shí)業(yè)有限公司；SpectraMax Plus 38型酶標(biāo)儀 美谷分子儀器公司；HF900 A2 Heal Force生物安全柜 力康生物醫(yī)療科技控股集團(tuán)；ECLIPSE Ti-S型倒置顯微鏡 日本Nikon公司；Count star自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)分析儀 京百卓顯科技有限公司；LDZX-30FBS立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；UV-2550型紫外-可見分光光度計(jì) 日本島津公司；Trace GC Ultra DSQII型氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用儀 美國(guó)Thermo Fisher公司；2695高效液相色譜儀 美國(guó)Waters公司；NICOLET-380傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）儀美國(guó)熱電公司。

1.3 方法

1.3.1 PSPY的制備

條斑紫菜60 ℃烘箱內(nèi)干燥2 h破碎成粉，過(guò)100 目篩，粉末按固液比1∶20（m/V）加無(wú)水乙醇后于90 ℃下浸提2 h，重復(fù)3 次除色素，抽濾后濾渣烘干備用。取去除色素的粉末8 g，以1∶75（m/V）加去離子水于90 ℃下水提4 h，離心收集上清液，濃縮至原體積的1/6后加4 倍體積的無(wú)水乙醇，4 ℃靜置12 h，收集沉淀，待乙醇揮發(fā)后加20 mL去離子水復(fù)溶得到糖溶液。

采用酶-S e v a g 復(fù)合法除蛋白，向糖溶液中按1 000∶1（V/m）加入木瓜蛋白酶，于50 ℃水浴鍋中酶解1 h，100 ℃沸水浴滅活15 min，冷卻后離心（8 000 r/min、10 min）除去變性蛋白沉淀，將所得的糖溶液與三氯甲烷和正丁醇按體積比20∶4∶1混合后靜置分層，棄下層溶液，上層糖溶液繼續(xù)按上述條件與三氯甲烷和正丁醇混合，反復(fù)至下層無(wú)渾濁蛋白。除蛋白后的糖溶液用3 500 Da透析袋透析72 h，4 h換一次水，結(jié)束后濃縮至5 mL再冷凍干燥，獲得PSPY，多糖提取率按式（1）計(jì)算，得到多糖提取率為9.7%。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

以DPPH自由基清除率為指標(biāo)進(jìn)行單因素試驗(yàn)，研究不同H2O2-VC濃度、溫度、降解時(shí)間條件下降解PSPY得到的DPSPY對(duì)DPPH自由基的清除率。DPPH自由基清除率的測(cè)定參考Xu Jie等[14]的方法，2 mL多糖溶液與2 mL 0.1 mmol/L DPPH-乙醇溶液混合均勻，37 ℃恒溫避光反應(yīng)30 min，以VC作陽(yáng)性對(duì)照，于517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，DPPH自由基清除率按式（2）計(jì)算。

式中：A0為去離子水代替樣品測(cè)得的吸光度；Al為樣品溶液測(cè)得的吸光度；A2為無(wú)水乙醇代替DPPH測(cè)得的吸光度。

1.3.2.1 H2O2-VC濃度對(duì)DPSPY清除DPPH自由基的影響

取5 mg/mL的PSPY溶液，加入H2O2和VC，使溶液中H2O2和VC的終濃度均分別為0、2、4、6、8、10 mmol/L[15]，50 ℃水浴1.5 h。再濃縮、醇沉、離心、復(fù)溶、透析、冷凍干燥，各處理?xiàng)l件同1.3.1節(jié)，處理得到6 組DPSPY，測(cè)3 mg/mL的DPSPY對(duì)DPPH自由基的清除率。

1.3.2.2 溫度對(duì)DPSPY清除DPPH自由基的影響

取5 mg/mL的PSPY溶液，將溶液中的H2O2-VC濃度調(diào)至4 mmol/L，于30、40、50、60、70 ℃ 5 組溫度下降解1.5 h。同1.3.2.1節(jié)處理得到5 組DPSPY，測(cè)3 mg/mL的DPSPY對(duì)DPPH自由基的清除率。

1.3.2.3 降解時(shí)間對(duì)DPSPY清除DPPH自由基的影響

取5 mg/mL的PSPY溶液，將溶液中的H2O2-VC濃度調(diào)至4 mmol/L后于50 ℃下分別降解0.5、1、1.5、2、2.5、3 h。同1.3.2.1節(jié)處理得到6 組DPSPY，測(cè)3 mg/mL的DPSPY對(duì)DPPH自由基的清除率。

1.3.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用Design Expert軟件、Box-Behnken模型和響應(yīng)面法，以3 mg/mL的DPSPY對(duì)DPPH自由基的清除率作為響應(yīng)值，對(duì)影響降解的3 個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1 Box-Behnken模型設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Code and level of independent variables used for Box-Behnken design

1.3.4 DPSPY的制備

單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法獲取最佳降解條件，在此條件下降解水提多糖，經(jīng)濃縮、醇沉、離心、復(fù)溶、透析、冷凍干燥，制備DPSPY。

1.3.5 PSPY和DPSPY組成及結(jié)構(gòu)分析

利用硫酸苯酚法測(cè)定總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)[16]；利用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)；利用硫酸鋇比濁法進(jìn)行硫酸根質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定[17]。

采用G C-M S 分析單糖組成[4,11]。分析條件：DD-17MS石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：80 ℃保持3 min，以15 ℃/min升至190 ℃，保持4 min，然后以10 ℃/min升溫至230 ℃，保持4 min；載氣（N2）流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量1 μL；分流比：20∶1，電子轟擊離子源；電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；質(zhì)量掃描范圍m/z45～500。

采用高效凝膠滲透色譜（high performance gel permeation chromatography，HPGPC）法測(cè)定多糖分子質(zhì)量[18]。條件：UltrahydrogelTM2000色譜柱（7.8 mm×300 mm）；示差折光檢測(cè)器；流動(dòng)相為20 mmol/L的硫酸鈉溶液；流速為0.6 mL/min；柱溫和檢測(cè)器溫度為（30±5）℃；進(jìn)樣量10 μL。

采用紫外-可見分光光度計(jì)掃描樣品得到紫外-可見光譜圖，從而檢測(cè)純度[19]；采用FTIR儀在400～4 000 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，分析多糖結(jié)構(gòu)。

1.3.6 PSPY和DPSPY的體外抗氧化能力測(cè)定

1.3.6.1 還原力和DPPH自由基清除能力的測(cè)定

參考Liu Yong等[20]的方法測(cè)定PSPY和DPSPY的還原力。取0.5 mL樣品溶液（0.25、0.5、1、2、4、8 mg/mL），加入0.5 mL 0.2 mol/L的PBS溶液、0.5 mL 1 g/100 mL的鐵氰化鉀溶液，50 ℃反應(yīng)20 min后加0.5 mL 10 g/100 mL的三氯乙酸溶液，4 500 r/min離心10 min后取1 mL上清液，加入0.2 mL 0.1 g/100 mL氯化鐵溶液，混勻后靜置10 min，以VC作為陽(yáng)性對(duì)照，于700 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，并以該吸光度表征還原力。

DPPH自由基清除能力測(cè)定方法同1.3.2節(jié)。

1.3.6.2 羥自由基清除能力測(cè)定

羥自由基清除能力的測(cè)定參照Liu Yong等[20]的方法，在0.5 mL樣品溶液（0.25、0.5、1、2、4、 8 mg/mL）中加0.5 mL 9 mmol/L FeSO4溶液和0.5 mL 9 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液，混勻后加入0.5 mL 9 mmol/L H2O2溶液，在37 ℃水浴中反應(yīng)0.5 h，以VC作為陽(yáng)性對(duì)照，于510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，羥自由基清除率按式（3）計(jì)算。

式中：A0為去離子水代替樣品測(cè)得的吸光度；Al為樣品溶液測(cè)得的吸光度；A2為乙醇代替水楊酸-乙醇溶液測(cè)得的吸光度。

取0.2 mL樣品溶液（0.25、0.5、1、2、4 mg/mL），加入50 mmol/L的Tris-HCl緩沖液1 mL，25 ℃水浴20 min后加入7 mmol/L鄰苯三酚溶液1 mL，充分反應(yīng)后加10 mol/L鹽酸0.2 mL終止反應(yīng)，以VC作為陽(yáng)性對(duì)照，于420 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度，O2-·清除率按式（4）計(jì)算。

式中：A0為去離子水代替樣品測(cè)得的吸光度；Al為樣品溶液測(cè)得的吸光度；A2為乙醇代替鄰苯三酚溶液測(cè)得的吸光度。

1.3.7 PSPY和DPSPY的體外膽酸鹽結(jié)合能力測(cè)定

樣品前處理參考何平偉[21]、Niu Yuge[22]等的方法，按照Yang Bao等[23]的方法采用總膽汁酸試劑盒測(cè)定多糖體外結(jié)合膽酸鹽（膽酸鈉、脫氧膽酸鈉、鵝去氧膽酸鈉、甘氨膽酸鈉和?；悄懰徕c）的能力。75 mg PSPY（或DPSPY）溶于6 mL 0.01 mol/L鹽酸溶液，空白組只加鹽酸溶液，于37 ℃水浴鍋中模擬消化2 h后加600 μL 0.1 mol/L的NaOH溶液。取1 mL樣液與1.5 mL 0.3 mmol/L膽酸鹽溶液（溶劑為50 mmol/L pH 6.9 PBS）、2 mL 10 mg/mL豬胰酶充分混合，8 000 r/min離心10 min后取上清液。按照總膽汁酸試劑盒說(shuō)明操作測(cè)得上清液中膽酸鹽濃度，以考來(lái)烯胺為陽(yáng)性對(duì)照、纖維素為陰性對(duì)照，膽酸鹽結(jié)合率按式（5）計(jì)算。

1.3.8 PSPY和DPSPY的體外免疫活性測(cè)定

1.3.8.1 對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖活性的影響

采用MTT細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒測(cè)定多糖對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖活性的影響。調(diào)整RAW264.7細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL，在96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔接種50 μL，樣品組加50 μL DMEM高糖完全培養(yǎng)液配制的50、100、200、500 μg/mL和1 000 μg/mL多糖溶液（終質(zhì)量濃度為25、50、100、250 μg/mL和500 μg/mL），正常組加同體積的DMEM高糖完全培養(yǎng)液，陽(yáng)性對(duì)照加同體積的20 μg/mL脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）溶液，使LPS終質(zhì)量濃度為10 μg/mL，37 ℃、5% CO2條件下分別培養(yǎng)24 h和48 h，細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，加10 μL 5 mg/mL的MTT試劑，均勻后繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄培養(yǎng)液后加100 μL甲臜，振蕩至全部溶解，測(cè)定570 nm波長(zhǎng)處各孔溶液吸光度。

1.3.8.2 對(duì)RAW264.7細(xì)胞吞噬活性的影響

調(diào)整RAW264.7細(xì)胞密度為4×105個(gè)/mL，培養(yǎng)方法同1.3.8.1節(jié)，陽(yáng)性對(duì)照組加入50 μL 10 μg/mL LPS，使終質(zhì)量濃度為5 μg/mL，棄培養(yǎng)液后加100 μL、體積分?jǐn)?shù)0.075%的中性紅溶液，培養(yǎng)4 h后用PBS洗3 次除去中性紅，再加入150 μL細(xì)胞裂解液（V（冰醋酸）∶V（無(wú)水乙醇）＝1∶1），37 ℃靜置1 h，振蕩均勻后于570 nm波長(zhǎng)處測(cè)各孔溶液的吸光度。

1.3.8.3 對(duì)RAW264.7細(xì)胞NO分泌量的影響

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

使用Excel 2010和SPSS 19軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析，Duncan’s法進(jìn)行多組樣本間差異顯著性分析，使用Origin 2017軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

圖1 H2O2-VC濃度（A）、溫度（B）、降解時(shí)間（C）對(duì)DPSPY清除DPPH自由基活性的影響Fig.1 Effects of H2O2-VC concentration (A), temperature (B), and degradation time (C) on DPPH radical scavenging activity of DPSPY

如圖1A所示，H2O2-VC的濃度在0～4 mmol/L時(shí)，DPSPY對(duì)DPPH自由基清除率有劑量依賴關(guān)系，可能是高濃度的H2O2-VC能促進(jìn)多糖作用；H2O2-VC濃度在4～10 mmol/L范圍內(nèi)逐漸增加時(shí)，多糖對(duì)DPPH自由基清除率逐步降低，可能是當(dāng)H2O2-VC濃度超過(guò)4 mmol/L時(shí)，多糖降解成更小的結(jié)構(gòu)影響了清除效果。

如圖1B所示，溫度在30～50 ℃范圍內(nèi)時(shí)，DPSPY的DPPH自由基清除率與溫度呈正相關(guān)；50 ℃后多糖的DPPH自由基清除率與溫度呈負(fù)相關(guān)。適當(dāng)提高溫度可以促進(jìn)分子運(yùn)動(dòng)，加速PSPY的降解反應(yīng)；溫度過(guò)高可能使H2O2揮發(fā)過(guò)量，導(dǎo)致PSPY降解效果變差，使PSPY中活性基團(tuán)不能充分暴露，導(dǎo)致DPSPY對(duì)DPPH自由基的清除活性變?nèi)酢?/p>

如圖1C所示，降解時(shí)間短于2 h時(shí)，DPSPY對(duì)DPPH自由基的清除率與時(shí)間呈正相關(guān)，2 h后降解反應(yīng)仍在繼續(xù)，可能使PSPY降解過(guò)度，從而使DPSPY清除DPPH自由基的活性降低。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化降解條件試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)，H2O2-VC的濃度（X1）、溫度（X2）、降解時(shí)間（X3）為三因素，3 mg/mL的DPSPY對(duì)DPPH自由基的清除率作為響應(yīng)值，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)，結(jié)果見表2。用Design Expert軟件對(duì)表2結(jié)果進(jìn)行二次回歸分析，回歸分析結(jié)果見表3?；貧w方程：

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model

由表3看出，回歸模型的P值小于0.000 1，模型極顯著，失擬項(xiàng)P＝1.196 9，不顯著，表示二次回歸模型可用于分析預(yù)測(cè)，無(wú)需引入更高次模型和新的變量。決定系數(shù)R2為0.996 2，表示試驗(yàn)誤差較小。變異系數(shù)為1.12%，說(shuō)明試驗(yàn)有較高的重復(fù)性、精度和良好的可靠性。校正決定系數(shù)與R2值接近，說(shuō)明模型擬合度較好，具有準(zhǔn)確性和較高的相關(guān)性。對(duì)DPSPY清除DPPH自由基能力的影響極顯著（P＜0.01），X2、X2X3對(duì)DPSPY清除DPPH自由基能力的影響顯著（P＜0.05），其他因素影響不顯著。

2.2.2 交互作用結(jié)果分析結(jié)果

圖2 交互作用的響應(yīng)面及等高線圖Fig.2 Response surface and contour plots showing the interactive effects of variables

響應(yīng)面和等高線圖可以反映變量之間的交互作用，響應(yīng)面越陡峭，等高線呈橢圓形，表示交互作用越顯著，由圖2可知，H2O2-VC濃度與溫度、溫度和降解時(shí)間的交互作用顯著，與方差分析的結(jié)果相同。

2.2.3 降解條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果

通過(guò)Design Expert軟件分析得出PSPY最佳降解條件為：H2O2-VC濃度4.16 mmol/L、降解時(shí)間2.12 h、溫度52.46 ℃，理論上此降解條件得到的DPSPY對(duì)DPPH的清除率為52.14%。修正條件為H2O2-VC濃度4.1 mmol/L、52.4 ℃下降解2.1 h，此時(shí)3 mg/mL DPSPY對(duì)DPPH自由基的清除率達(dá)51.01%，接近理論值52.14%。

2.3 PSPY和DPSPY的組成和結(jié)構(gòu)分析結(jié)果

2.3.1 PSPY和DPSPY的組成

表4 PSPY和DPSPY的主要成分與單糖組成Table 4 Main components and monosaccharide compositions of PSPY and DPSPY

如表4所示，降解后多糖的總糖和硫酸根質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低，可能是H2O2-VC造成糖鏈上部分糖蛋白基團(tuán)解離，少量帶硫酸根的小分子聚糖被透析除去。PSPY和DPSPY主要由半乳糖、葡萄糖和少量的甘露糖、鼠李糖和木糖組成，降解前后單糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)有輕微差別。

2.3.2 PSPY和DPSPY的分子質(zhì)量

圖3 PSPY、DPSPY的HPGPC圖Fig.3 High performance gel permeation chromatography profiles of PSPY and DPSPY

PSPY、DPSPY的保留時(shí)間分別為14.43 min和17.42 min（圖3），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和樣品保留時(shí)間，得出PSPY、DPSPY分子質(zhì)量分別為452、17 ku，表明H2O2-VC有效降解了PSPY。

2.3.3 PSPY和DPSPY的紫外-可見光譜

圖4 PSPY和DPSPY的紫外-可見光譜圖Fig.4 UV-visible absorption spectra of PSPY and DPSPY

圖4 為PSPY和DPSPY的紫外-可見光譜圖，PSPY和DPSPY在280 nm波長(zhǎng)處有弱吸收峰，說(shuō)明存在少量的蛋白質(zhì)，符合組成分析結(jié)果；在260 nm及400～700 nm波長(zhǎng)處未出現(xiàn)吸收峰，表示PSPY和DPSPY中基本無(wú)核酸和色素的存在。

2.3.4 FTIR圖譜

圖5 PSPY和DPSPY的FTIR圖譜Fig.5 Fourier transform infrared spectroscopy spectra of PSPY and DPSPY

由圖5可見，PSPY和DPSPY的FTIR光譜圖峰位差異不大，說(shuō)明降解沒(méi)有改變PSPY的基本基團(tuán)結(jié)構(gòu)。其中3 441 cm-1附近為O—H伸縮振動(dòng)特征吸收帶，1 636 cm-1附近為羧基的C＝O的非對(duì)稱伸縮振動(dòng)吸收峰[25]。在1 260 cm-1處有較弱的O＝S＝O的非對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰，表明了硫酸基團(tuán)存在。1 069 cm-1處屬于葡萄糖殘基的伸縮振動(dòng)吸收峰，950 cm-1附近是吡喃糖環(huán)末端的次甲基的橫搖振動(dòng)峰，這兩峰證明了吡喃糖的存在[26]。在824 cm-1處為α-型糖苷鍵的吸收峰，864 cm-1處為β-糖苷鍵的吸收峰[27]。

2.4 PSPY和DPSPY體外抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 PSPY和DPSPY的還原力

圖6 VC、PSPY和DPSPY的還原力Fig.6 Reducing power of VC, PSPY and DPSPY

如圖6所示，PSPY和DPSPY的還原力明顯弱于陽(yáng)性對(duì)照VC，還原能力隨質(zhì)量濃度提高而增強(qiáng)，DPSPY的還原力優(yōu)于PSPY。有研究表明多糖的還原力與分子質(zhì)量大小有關(guān)，一定程度上多糖的還原力隨分子質(zhì)量的減少而增強(qiáng)[28-30]，這與前面得到的DPSPY分子質(zhì)量遠(yuǎn)小于PSPY的結(jié)果吻合。

2.4.2 PSPY和DPSPY對(duì)DPPH自由基清除率的影響

圖7 VC、PSPY和DPSPY對(duì)DPPH自由基的清除率Fig.7 Scavenging capacity of VC, PSPY and DPSPY on DPPH radicals

如圖7所示，PSPY和DPSPY對(duì)DPPH自由基的半抑制質(zhì)量濃度（50% inhibition concentration，IC50）分別為15.07 mg/mL和3.71 mg/mL。兩種多糖對(duì)DPPH自由基的清除能力與VC差距較大，且有劑量依賴關(guān)系。在相同質(zhì)量濃度下，DPSPY對(duì)DPPH自由基的清除能力明顯高于PSPY，表示H2O2-VC降解PSPY能增強(qiáng)其對(duì)DPPH自由基的清除能力，這一方面是由于降解使PSPY提供氫的活性基團(tuán)暴露；另一方面，大量研究表明硫酸根含量高的多糖自由基清除活性相對(duì)較高[18]，也可能是因?yàn)镈PSPY中活性基團(tuán)硫酸根質(zhì)量分?jǐn)?shù)更高。

2.4.3 PSPY和DPSPY對(duì)羥自由基清除率的影響

圖8 VC、PSPY和DPSPY對(duì)羥自由基的清除率Fig.8 Scavenging capacity of VC, PSPY and DPSPY on hydroxyl radicals

由圖8可知，VC、PSPY和DPSPY羥自由基清除率的IC50分別為0.25、19.25 mg/mL和10.86 mg/mL，同質(zhì)量濃度下的羥自由基清除率由大到小依次為：VC＞PSPY＞DPSPY。4 mg/mL DPSPY的羥自由基清除率（31.18%）與0.2 mg/mL VC相當(dāng)，這表明DPSPY能一定程度抑制機(jī)體的氧化損傷。

圖9 VC、PSPY和DPSPY對(duì)·的清除率Fig.9 Scavenging capacity of VC, PSPY and DPSPY on superoxide anion radicals

2.5 PSPY和DPSPY的膽酸鹽結(jié)合能力

膽酸鹽結(jié)合能力常用來(lái)評(píng)價(jià)化合物其體外降血脂的活性。如圖10所示，PSPY和DPSPY都能結(jié)合膽酸鹽，DPSPY的膽酸鹽結(jié)合率高于PSPY。人體膽酸鹽多以共軛形式存在，如?；悄懰崤c甘氨膽酸；游離膽酸為非共軛膽酸，如膽酸與脫氧膽酸[31]。PSPY和DPSPY對(duì)牛磺膽酸鈉和鵝去氧膽酸鈉的結(jié)合率相對(duì)較高，其中DPSPY對(duì)?；悄懰徕c和鵝去氧膽酸鈉的結(jié)合率分別達(dá)到了62.64%、66.98%。DPSPY的膽酸鹽結(jié)合力明顯高于PSPY，可能與DPSPY的分子質(zhì)量較小、硫酸根含量較高有關(guān)[18,25]。

圖10 PSPY和DPSPY的膽酸鹽結(jié)合率Fig.10 Cholate-binding rates of PSPY and DPSPY

2.6 PSPY和DPSPY體外免疫活性研究結(jié)果

2.6.1 PSPY和DPSPY對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖活性的影響

圖11 PSPY和DPSPY對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖活性的影響Fig.11 Effects of PSPY and DPSPY on the proliferation of RAW264.7 cells

由圖11可知，兩種多糖能提高RAW264.7細(xì)胞的增殖能力，這與Zhao Ting等[32]的研究結(jié)果一致，都存在劑量依賴關(guān)系但不是很明顯，延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)促進(jìn)增殖無(wú)較大的影響。相同培養(yǎng)時(shí)間、相同質(zhì)量濃度下，DPSPY促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞增殖的能力顯著高于PSPY（P＜0.05），表示H2O2-VC降解PSPY可提高其促RAW264.7細(xì)胞增殖活性。

2.6.2 PSPY和DPSPY對(duì)RAW264.7細(xì)胞吞噬活性的影響

由圖12可知，LPS有較好的促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞吞噬中性紅的作用，與正常組相比，PSPY和DPSPY處理組RAW264.7細(xì)胞的吞噬能力明顯提高，且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)，無(wú)劑量依賴關(guān)系，這與黃菊青[24]和Zhao Ting[32]等的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。有研究表明，細(xì)胞吞噬能力的強(qiáng)弱可間接反映免疫活性的高低[33-34]，因此，PSPY和DPSPY可以通過(guò)提高RAW264.7細(xì)胞的吞噬能力從而提高細(xì)胞的免疫活性。

圖12 PSPY和DPSPY對(duì)RAW264.7細(xì)胞吞噬中性紅活性的影響Fig.12 Effects of PSPY and DPSPY on phagocytosis of RAW264.7 cells

2.6.3 PSPY和DPSPY對(duì)RAW264.7細(xì)胞分泌NO的影響

圖13 PSPY和DPSPY對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞分泌NO的影響Fig.13 Effects of PSPY and DPSPY on NO production of RAW264.7 cells

如圖1 3 所示，與正常組對(duì)比，P S P Y 處理組RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)24 h和48 h后分泌的NO量均無(wú)明顯變化，且不同質(zhì)量濃度處理組也無(wú)顯著差異。DPSPY處理組RAW264.7分泌NO的能力隨著DPSPY質(zhì)量濃度的增加而提高。DPSPY處理組組內(nèi)顯著性差異分析結(jié)果表明，DPSPY刺激RAW264.7細(xì)胞分泌NO的能力呈顯著劑量依賴性，表明H2O2-VC降解可以提高PSPY刺激RAW264.7細(xì)胞分泌NO的活性。NO是巨噬細(xì)胞免疫應(yīng)答中分泌的炎性介質(zhì)，是巨噬細(xì)胞抵御病原體和殺傷刺激物的重要生物因子[35]，NO的分泌水平可以反映巨噬細(xì)胞的活化水平，上述研究表明DPSPY可以提升RAW264.7細(xì)胞分泌NO的能力，提高細(xì)胞殺傷活力。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)建立了一種通過(guò)H2O2-VC法提高PSPY生物活性的方法。響應(yīng)面法優(yōu)化H2O2-VC降解PSPY的條件為：H2O2-VC濃度4.1 mmol/L、溫度52.4 ℃、降解時(shí)間2.1 h。最佳條件下DPSPY的得率為73.89%。與PSPY相比，DPSPY的總糖、硫酸根質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低。FTIR分析結(jié)果表明，降解未改變PSPY鏈上的基團(tuán)，PSPY和DPSPY的分子質(zhì)量分別為452 ku和17 ku。PSPY降解后的還原力和DPPH自由基、羥自由基、O2-·清除活性得到明顯提高，且清除活性有明顯的劑量依賴性，表明PSPY抗氧化能力提高。5 種膽酸鹽結(jié)合實(shí)驗(yàn)中，DPSPY與膽酸鹽的結(jié)合率均高于PSPY。RAW264.7細(xì)胞模型系列實(shí)驗(yàn)中，DPSPY對(duì)促進(jìn)細(xì)胞增殖、提高細(xì)胞吞噬能力和促進(jìn)細(xì)胞分泌NO的活性更強(qiáng)。