刃天青微量板法對沙門氏菌的抗菌敏感性試驗(yàn)

任奕婧 孫嘉笛 孫秀蘭

摘要?采用刃天青微量板法檢測多株沙門氏菌對抗生素的耐藥性，得到最小抑菌濃度（MIC）。通過肉眼觀察和熒光檢測都可判定沙門氏菌的耐藥性，判定時(shí)間僅需5?h，刃天青法與微量肉湯稀釋法檢測得到的耐藥性結(jié)果一致。其中用顏色觀察能更清晰明確地分辨出耐藥折點(diǎn)，熒光檢測可以動(dòng)態(tài)地反映細(xì)菌隨時(shí)間變化的生長情況。刃天青微量板法具有簡便、快速、靈敏度高的特點(diǎn)，能確定抗生素的耐藥性和精確耐藥MIC值。

關(guān)鍵詞?沙門氏菌;藥敏試驗(yàn);刃天青微量板法

中圖分類號?R446.5?文獻(xiàn)標(biāo)識碼?A?文章編號?0517-6611（2021）03-0199-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.03.053

Abstract?The?resazurin?microplate?method?was?used?to?detect?the?resistance?of?several?Salmonella?strains?to?antibiotics，?and?the?minimum?inhibitory?concentration?（MIC）?was?obtained.The?drug?resistance?of?Salmonella?could?be?determined?by?visual?inspection?and?fluorescence?detection，?and?the?determination?time?was?only?5?hours.?The?drug?resistance?results?obtained?by?the?resazurin?method?and?the?micro?broth?dilution?method?were?consistent.?Among?them，?color?observation?could?more?clearly?distinguish?drugresistant?turning?points，?and?fluorescence?detection?could?dynamically?reflect?the?growth?of?bacteria?over?time.?The?resazurin?microplate?method?was?simple，?fast?and?highly?sensitive.?It?could?determine?antibiotic?resistance?and?precise?resistance?MIC?values.

Key?words?Salmonella;Antibiotic?sensitivity?test;Resazurin?microplate?method

沙門氏菌（Salmonella）作為一種食源性病原體，對人類健康構(gòu)成了巨大威脅。沙門氏菌可通過受污染的畜禽產(chǎn)品、蛋、奶乃至海洋產(chǎn)品感染人類[1-7]。近年來，由于抗生素的廣泛使用，出現(xiàn)了沙門氏菌耐藥株和多重耐藥株，導(dǎo)致沙門氏菌耐藥性問題日益嚴(yán)重，對畜牧業(yè)和人類健康都構(gòu)成了潛在威脅[8-9]。

為了應(yīng)對這種威脅，迫切需要進(jìn)行抗生素敏感測試（AST），以快速診斷這些危險(xiǎn)細(xì)菌的耐藥性，確?？焖?、準(zhǔn)確地使用抗生素。當(dāng)前，各種傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室方法可用來表征微生物對抗生素的體外敏感性，如常量肉湯稀釋和微量肉湯稀釋法、圓盤擴(kuò)散法和抗菌梯度法等。但是，這些方法多數(shù)都需要冗長的測試程序，通常需要經(jīng)歷收集樣品、富集培養(yǎng)物，在這之后還至少需要孵育16?h才能進(jìn)行檢測[10-11]。耐藥細(xì)菌的流行率增加表明現(xiàn)在迫切需要能夠在數(shù)小時(shí)而不是數(shù)天之內(nèi)提供藥敏性數(shù)據(jù)的AST。除了常規(guī)檢測方法，mPCR法和全自動(dòng)微生物分析儀測定法等新型檢測技術(shù)也已運(yùn)用在耐藥性檢測中[12]。基于已知和賦予細(xì)菌抗性基因的擴(kuò)增和檢測技術(shù)，與常規(guī)培養(yǎng)方法相比，酶促擴(kuò)增技術(shù)減少了檢測時(shí)間[13-14]。但這些技術(shù)需要大型且昂貴的儀器，這限制了它們在資源受限的環(huán)境中的使用。

刃天青（resazurin）作為一種氧化還原染料，活細(xì)菌可以將刃天青轉(zhuǎn)化為粉紅色的熒光染料試鹵靈（resorufin），繼續(xù)反應(yīng)可以變?yōu)榘咨珶o熒光的二氫試鹵靈（dihydroresorufin）。因其安全無毒、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的優(yōu)點(diǎn)，已被越來越多地應(yīng)用于細(xì)胞活力和細(xì)胞增殖能力的評估[15-16]。以刃天青為指示劑的低成本藥敏試驗(yàn)方法，能動(dòng)態(tài)地反映細(xì)菌的生長情況，可以檢測藥物的作用時(shí)間和細(xì)菌的耐藥情況。該研究采用刃天青法檢測沙門氏菌對幾種抗生素的敏感性，確定最佳試驗(yàn)條件，為沙門氏菌的快速、簡便檢測提供一種新方法。

1?材料與方法

1.1?試材

氧氟沙星（Ofloxacin）、環(huán)丙沙星（Ciprofloxacin）購自上海麥克林生化科技有限公司;氯金酸（AuCl3·HCl·4H2O）購自美國Sigma試劑有限公司;氨芐西林（Ampicillin）、美羅培南（Meropenem）、四環(huán)素（Tetracycline）、刃天青（Resazurin）、鹽酸（HCl）購自上海國藥集團(tuán);營養(yǎng)肉湯（NB）、營養(yǎng)瓊脂（NA）購自上海博威生物醫(yī)藥有限公司。所有溶液均用超純水制備，所有試劑均為分析純。鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028（Salmonella?typhimurium）為實(shí)驗(yàn)室保存菌株，其余沙門氏菌（Salmonella）分離株均來自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，-80?℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2?儀器

Lab?Dancer漩渦儀，IKA公司;Spectra?MAX?M5酶標(biāo)儀，美國Molecular?Devices;WGZ-XT細(xì)菌濁度儀，杭州齊威儀器有限公司;平底96孔細(xì)菌培養(yǎng)板，南通市海之星實(shí)驗(yàn)器材有限公司;VB-40立式高溫高壓滅菌鍋，德國SYSTEC;BSC-1300超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;SHP-150生化培養(yǎng)箱，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;EX-OHOUS電子天平，美國奧豪斯公司;Milli-Q超純水儀，美國Millipore公司。

1.3?細(xì)菌培養(yǎng)

取沙門氏菌接種于NB培養(yǎng)基，在37?℃搖床培養(yǎng)，通過細(xì)菌濁度儀檢測細(xì)菌濃度。將濃度為0.5?MCF的菌液進(jìn)行梯度稀釋，取100?μL涂布NA瓊脂平板，37?℃培養(yǎng)24?h，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算出0.5?MCF菌液對應(yīng)的細(xì)菌培養(yǎng)物的菌落數(shù)及菌落形成單位（CFU/mL）。最后用NB將菌液稀釋成所需濃度，4?℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4?微量肉湯稀釋法藥敏試驗(yàn)

按美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會（CLSI）方案，將倍比稀釋的不同濃度的抗生素分別加到無菌的96孔培養(yǎng)板中，1～11孔加入系列稀釋抗生素100?μL，第12孔不加抗生素作為陽性生長對照。將培養(yǎng)的沙門氏菌菌懸液稀釋至7.5×106?CFU/mL，向每孔中加100?μL，在37?℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育[10]。此時(shí)，1～11孔藥物濃度分別為128.000、64.000、32.000、16.000、8.000、4.000、2.000、1.000、0.500、0.250、0.125?μg/mL。20?h后，觀察96孔培養(yǎng)板中的液體渾濁情況，判斷沙門氏菌是否生長及其對所試抗生素的敏感性。

1.5?刃天青工作條件的優(yōu)化

用NB肉湯將沙門氏菌進(jìn)行連續(xù)梯度稀釋，分裝96孔培養(yǎng)板中，每孔加入100?μL，終濃度分別為?7.5×106、7.5×105、7.5×104、7.5×103、7.5×102、7.5×10?CFU/mL，菌液濃度列間遞減;同時(shí)每孔加入用NB肉湯稀釋的不同濃度刃天青溶液100?μL，終濃度為1.600、0.800、0.400、0.200、0.100、0.050、0.025?mmol/L，刃天青濃度行間遞減。設(shè)無刃天青含菌的NB肉湯為陽性對照，無菌含刃天青的NB肉湯為陰性對照，37?℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12?h，每隔1?h觀察顏色變化，檢測熒光值，熒光激發(fā)波長為530?nm，發(fā)射波長為590?nm，并記錄熒光數(shù)據(jù)。該試驗(yàn)測量熒光值和觀察顏色變化來評價(jià)藥物的抑菌效果，選用變?yōu)榉奂t色的時(shí)間為試驗(yàn)所需測試時(shí)間，并且將能明顯顯示細(xì)菌生長的刃天青濃度選為工作濃度。

1.6?沙門氏菌生長動(dòng)態(tài)觀察

取培養(yǎng)的沙門氏菌，用NB肉湯稀釋成不同濃度7.5×106、7.5?×105、7.5×104、7.5×103、7.5×102、7.5×10?CFU/mL，分裝于96孔板中，100?μL/孔，再每孔加入100?μL的工作濃度刃天青溶液，37?℃恒溫培養(yǎng)10?h，每隔1?h觀察結(jié)果并同時(shí)檢測熒光值。

1.7?刃天青微量板藥敏試驗(yàn)

將NB肉湯稀釋的刃天青溶液100?μL加到無菌的96孔培養(yǎng)板中，將抗生素加入第1孔，1～11孔進(jìn)行梯度稀釋，第12孔不加抗生素作為陽性生長對照。向每孔中加100?μL培養(yǎng)的沙門氏菌菌懸液，在37?℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育。選擇對5種抗生素耐藥或敏感的6株沙門氏菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，根據(jù)顏色變化及熒光值來判斷沙門氏菌是否生長及其對所試抗生素的敏感性。

1.8?刃天青微量板的應(yīng)用

將蛋洗凈并浸泡在75%乙醇溶液中后，將蛋清和蛋黃在無菌條件下移入無菌均質(zhì)袋中，并用均質(zhì)器打漿2?min以制備懸浮液。通過將25?mL雞蛋混合物添加到175?mL營養(yǎng)肉湯中來制備1∶10樣品稀釋液。用該稀釋液將鼠傷寒沙門氏菌稀釋成7.5×106?CFU/mL，然后按照“1.7”方法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。另取樣品100?μL，涂布NA瓊脂平板，37?℃培養(yǎng)24?h觀察是否雜菌污染。

2?結(jié)果與分析

2.1?細(xì)菌濃度的確定

為了便于細(xì)菌定量檢測，用細(xì)菌濁度儀測定沙門氏菌濁度，取定量稀釋液涂布NA瓊脂平板，培養(yǎng)24?h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。經(jīng)菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算出0.5?MCF菌液對應(yīng)的細(xì)菌培養(yǎng)物的菌落數(shù)為4.15×108?CFU/mL。

2.2?刃天青工作條件優(yōu)化

該試驗(yàn)測試沙門氏菌濃度與刃天青濃度的熒光值和顏色變化，根據(jù)其變化來優(yōu)化測試條件。其中挑選3個(gè)時(shí)間點(diǎn)來進(jìn)行結(jié)果說明。當(dāng)培養(yǎng)3?h時(shí)，7.5?×106?CFU/mL濃度細(xì)菌可使0.025～0.200?mmol/L刃天青變粉紅色。當(dāng)培養(yǎng)6?h時(shí)，細(xì)菌濃度≤103?CFU/mL，均不能使所用7種刃天青濃度變色，這顯示沙門氏菌沒有生長;當(dāng)細(xì)菌濃度≥104?CFU/mL，0.025～0.400?mmol/L刃天青可以顯示沙門氏菌生長，≥0.800?mmol/L刃天青的顯色時(shí)間相對滯后，其中高濃度細(xì)菌（7.5×106?CFU/mL）在全濃度刃天青溶液中都變粉紅色。培養(yǎng)12?h后，只有7.5×10?CFU/mL濃度的細(xì)菌在1.600?mmol/L刃天青濃度下不變色，其余濃度的細(xì)菌均可使刃天青變?yōu)榉凵?。熒光檢測結(jié)果所得趨勢同上。從7.5×105?CFU/mL細(xì)菌在不同刃天青濃度下隨孵育時(shí)間的熒光檢測結(jié)果（圖1）可以看出，細(xì)菌與刃天青反應(yīng)2?h后熒光差異明顯，0.025～0.100?mmol/L刃天青在5?h內(nèi)還原趨于飽和，0.200～0.800?mmol/L刃天青在5～6?h還原飽和;0.050～0.800?mmol/L刃天青的飽和熒光值接近，說明特定濃度細(xì)菌已被刃天青飽和或過飽和。試驗(yàn)結(jié)果表明，低濃度刃天青產(chǎn)生的熒光信號低，反應(yīng)不靈敏，而過高濃度的刃天青會導(dǎo)致反應(yīng)時(shí)間過長且熒光檢測滯后。綜合顏色變化和熒光值，在5個(gè)變色較快的濃度中，0.100?mmol/L刃天青的顯色清晰，熒光值明顯，因此選為刃天青微量板的工作濃度。

2.3?沙門氏菌的生長動(dòng)態(tài)

將不同濃度的沙門氏菌在刃天青微量板上培養(yǎng)12?h，每隔1?h觀察結(jié)果。結(jié)果顯示（表1），當(dāng)細(xì)菌濃度為7.5×102、7.5×104和7.5×105?CFU/mL時(shí)，分別培養(yǎng)8、6和4?h即可見沙門氏菌生長;其中細(xì)菌濃度為7.5×10、7.5×103和7.5×106?CFU/mL時(shí)，分別在10、7和2?h顯示為部分沙門氏菌生長。由此可見，刃天青微量板進(jìn)行沙門氏菌藥敏試驗(yàn)的判斷時(shí)間可以控制在5?h。

2.4?刃天青微量板藥敏試驗(yàn)

用配制好的標(biāo)準(zhǔn)濃度抗生素進(jìn)行沙門氏菌藥敏試驗(yàn)，結(jié)果顯示（表2），不同沙門氏菌分離株對抗生素氧氟沙星、氨芐西林、環(huán)丙沙星、美羅培南、四環(huán)素或敏感或耐藥。依據(jù)CLSI的最新判斷標(biāo)準(zhǔn)，刃天青微量板與微量肉湯稀釋法藥敏試驗(yàn)得到的耐藥結(jié)果一致。這表明用刃天青微量板法可以在短時(shí)間內(nèi)更為直觀地觀察到耐藥結(jié)果。但在檢測沙門氏菌對美羅培南耐藥性時(shí)發(fā)現(xiàn)，因?yàn)樗蒙抽T氏菌對美羅培南均為完全敏感，可以觀察到在耐藥折點(diǎn)有些菌株會有極輕微的變色。

在測量菌株耐藥情況的同時(shí)，選擇性地?cái)U(kuò)大抗生素的濃度范圍，發(fā)現(xiàn)用刃天青微量板法得到的MIC值和微量肉湯稀釋法的MIC值會有些許差異，沙門氏菌對環(huán)丙沙星和美羅培南的耐藥性如表3所示。擴(kuò)大濃度范圍后，用2種方法測得的4株菌的MIC有差異。其中3株菌在測量對美羅培南耐藥性時(shí)發(fā)現(xiàn)，用刃天青微量板法檢測可以得到相對應(yīng)的MIC值，但用微量肉湯稀釋法檢測得到的卻為敏感，沒有確切的MIC值。這可能是因?yàn)槿刑烨嘧兩舾?，更易被人肉眼和熒光檢測到，而微量肉湯稀釋法只關(guān)注培養(yǎng)基的渾濁程度，無法精確得到耐藥值。這間接表明刃天青微量板法比肉湯稀釋法更靈敏，對研究菌株在低濃度抗生素中的生長情況有幫助，有益于在公共衛(wèi)生方面的用藥安全。

2.5?刃天青微量板的應(yīng)用

用氧氟沙星、氨芐西林、環(huán)丙沙星、美羅培南、四環(huán)素5種抗生素對實(shí)際樣品進(jìn)行刃天青微

量板快速藥敏試驗(yàn)，并同時(shí)進(jìn)行微量肉湯稀釋法藥敏試驗(yàn)對照，結(jié)果顯示（表4），2種藥敏試驗(yàn)方法的結(jié)果具有良好的一致性。

3?結(jié)論

該研究以刃天青為檢測物質(zhì)，對食源性致病菌沙門氏菌的耐藥性進(jìn)行檢測。所用刃天青微量板法得到的MIC與微量肉湯稀釋法進(jìn)行判斷的結(jié)果具有良好的一致性，且更為靈敏、直觀，在5?h內(nèi)就可以得出藥敏結(jié)果。其中肉眼觀察在實(shí)際應(yīng)用中較為方便，不受試驗(yàn)設(shè)備、場地的制約;熒光檢測可以更清晰地明確耐藥情況，獲得整個(gè)耐藥進(jìn)程，且更為準(zhǔn)確、客觀和結(jié)果可量化。刃天青微量板法彌補(bǔ)了瓊脂法等常規(guī)藥敏試驗(yàn)方法無法動(dòng)態(tài)檢測細(xì)菌生長情況的缺陷，其優(yōu)勢在于其可清晰辨別耐藥折點(diǎn)，動(dòng)態(tài)地檢測細(xì)菌的生長狀況，在低濃度抗生素下可以得到更為精確的耐藥值。刃天青微量板法具有簡便、快速、靈敏、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)，在檢測各種細(xì)菌對抗生素的敏感性中有顯而易見的優(yōu)勢。同時(shí)刃天青法為非特異性檢測，在實(shí)際檢測中有更好的應(yīng)用價(jià)值。

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