山羊產(chǎn)氣莢膜梭菌的分子流行病學(xué)調(diào)查與毒素型分析

曹思宇，張彤宇，2，張 燕，成大榮，3*，邢 華，3*

（1．揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州225009；2．南京傳奇生物科技有限公司，江蘇 南京211100；3．江蘇高校動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚(yáng)州225009）

產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens，C.perfringens）又稱(chēng)魏氏梭菌，在自然界分布廣泛，存在于污水、土壤、人畜糞便及腸道中，是一種人畜共患病原菌[1-2]。產(chǎn)氣莢膜梭菌嚴(yán)重影響畜禽的健康養(yǎng)殖，給養(yǎng)殖業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失，同時(shí)也對(duì)人類(lèi)健康造成極大威脅[3-4]。產(chǎn)氣莢膜梭菌是一種專(zhuān)性厭氧的革蘭氏陽(yáng)性桿菌，可形成芽孢，其能產(chǎn)生多種外毒素和侵襲性酶類(lèi)，主要有α、β、ε、ι4種致病性毒素[5]。根據(jù)致死性毒素及抗毒素中和試驗(yàn)，將產(chǎn)氣莢膜梭菌分為A、B、C、D、E 5種毒素型[6]。其中，A型攜帶α毒素，主要引起易感動(dòng)物的壞死性腸炎[7]；B型攜帶α、β、ε毒素，其中β毒素有較強(qiáng)的致死性；C型攜帶α、β毒；D型攜帶α、ε毒素，其中ε毒素是僅次于肉毒毒素和破傷風(fēng)毒素的梭菌強(qiáng)毒素[8]；E型攜帶α、ι毒素。B型和D型產(chǎn)氣莢膜梭菌感染易引起牛、羊的腸炎或腸毒血癥，E型臨床致病較少。產(chǎn)氣莢膜梭菌可以形成芽孢，能夠穩(wěn)定長(zhǎng)期的存在于易感動(dòng)物和環(huán)境中，對(duì)易感動(dòng)物造成極大的威脅。因此，本試驗(yàn)采集江蘇地區(qū)及揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物醫(yī)院的山羊新鮮糞便進(jìn)行PCR核酸檢測(cè)，對(duì)陽(yáng)性的菌株進(jìn)行毒素型鑒定，為該地區(qū)的山羊產(chǎn)氣莢膜梭菌的分子流行病學(xué)的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

在江蘇灌云、揚(yáng)州、宿遷、泰州、連云港等10個(gè)地區(qū)的肉羊規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)經(jīng)直腸采集新鮮糞樣1 114份，其中健康糞便樣品971份，發(fā)病糞便樣品143份。置于密封袋或滅菌的Ep管，4℃保存。

1.2 樣品處理

取糞球與少量生理鹽水混合后，用接種環(huán)蘸取混合物接種于梭菌增菌培養(yǎng)基中培養(yǎng)。采用煮沸法對(duì)增菌后的細(xì)菌總DNA提取。

1.3 引物合成與反應(yīng)條件

參考張彤宇[9]的試驗(yàn)方法合成產(chǎn)氣莢膜梭菌通用引物，反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2 min，94℃變性30 s，55.9℃退火30 s，72℃延伸40 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸2 min。根據(jù)產(chǎn)氣莢膜梭菌的α、β、ε、ι4種毒素基因序列，參照鮑長(zhǎng)磊等[10]的試驗(yàn)方法合成基因分型引物。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物均用1%瓊脂凝膠電泳檢測(cè)。

1.4 陽(yáng)性菌株的分離與鑒定

挑取梭菌檢測(cè)呈陽(yáng)性的增菌培養(yǎng)物，在卵黃CW瓊脂平板（含卡那霉素）上四區(qū)劃線(xiàn)分離培養(yǎng)，挑取分離出的可疑菌落接種進(jìn)行增菌[11]，提取DNA模板，經(jīng)PCR電泳驗(yàn)證。同時(shí)，挑取可疑菌落經(jīng)革蘭染色法、亞甲基藍(lán)染色法、生化鑒定、牛乳發(fā)酵試驗(yàn)后觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR檢測(cè)結(jié)果（見(jiàn)圖1）

1 114份樣品用梭菌經(jīng)PCR檢測(cè)，213份（19.12%）呈陽(yáng)性，其中208份（21.42%）來(lái)源于健康肉羊，5份（3.50%）來(lái)源于發(fā)病肉羊。

圖1 產(chǎn)氣莢膜梭菌的PCR擴(kuò)增電泳圖Fig.1 PCR amplification of C.perfringens

2.2 產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離鑒定與毒素型分析（見(jiàn)圖2）

圖2 分離株的PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.2 PCR product electrophoretogram of isolated strain

由圖2可知，對(duì)分離鑒定后得到的108株產(chǎn)氣莢膜梭菌用PCR鑒定，A型產(chǎn)氣莢膜梭菌67（62.04%）株、D型產(chǎn)氣莢膜梭菌41（37.96%）株，未見(jiàn)其他型菌株。

2.3 不同地區(qū)產(chǎn)氣莢膜梭菌的檢測(cè)結(jié)果（見(jiàn)表1）

表1 不同地區(qū)產(chǎn)氣莢膜梭菌的檢測(cè)結(jié)果Tab.1 Prevalence of C.perfringens in different regions

由表1可知，各個(gè)地區(qū)受檢樣品中產(chǎn)氣莢膜梭菌陽(yáng)性率不等，最高的地區(qū)為灌云，其次為揚(yáng)州。

3 討論

產(chǎn)氣莢膜梭菌可引起多種人獸共患傳染病，臨床癥狀不明顯，易引起死亡，已成為危害人類(lèi)及養(yǎng)殖業(yè)的重要疾病之一。產(chǎn)氣莢膜梭菌所分泌的外毒素是其主要致病因子[12]，多作用于腸道，造成感染動(dòng)物的急性死亡，其中A型梭菌易引起氣性壞疽和食物中毒[13]；D型梭菌易引起腸毒血癥[14]。另外，不同毒素型對(duì)藥物的敏感性不同，應(yīng)嚴(yán)格分型后指導(dǎo)養(yǎng)殖戶(hù)正確使用藥物及疫苗，防止疾病發(fā)展[15]。

本試驗(yàn)對(duì)臨床糞便樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，產(chǎn)氣莢膜梭菌在江蘇肉羊規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)流行廣泛，健康羊群普遍攜帶產(chǎn)氣莢膜梭菌，且至少存在2種毒素基因型。從不同地區(qū)肉羊產(chǎn)氣莢膜梭菌檢測(cè)結(jié)果可知，陽(yáng)性率有所不同，最高的地區(qū)為灌云，其次為揚(yáng)州。對(duì)各地區(qū)毒素分型鑒定發(fā)現(xiàn)，各地區(qū)均攜帶A型菌，揚(yáng)州、泰州和南通除A型以外還攜帶D型菌，可能與規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)的飼養(yǎng)環(huán)境、地理位置有關(guān)。

產(chǎn)氣莢膜梭菌是構(gòu)成動(dòng)物腸道菌群的一部分，當(dāng)機(jī)體處于健康情時(shí)該菌不會(huì)引起疾病，但當(dāng)動(dòng)物處于亞臨床狀態(tài)或爆發(fā)壞死性腸炎時(shí)，胃腸道的菌群平衡被打破，菌群失調(diào)，產(chǎn)氣莢膜梭菌會(huì)快速增殖并產(chǎn)生大量毒素，對(duì)機(jī)體造成損傷。

4 結(jié)論

江蘇地區(qū)被檢的臨床健康肉羊廣泛攜帶產(chǎn)氣莢膜梭菌，且大多攜帶A型，少部分?jǐn)y帶D型。為避免疾病的大規(guī)模爆發(fā)，除注意飼養(yǎng)管理外，需針對(duì)菌株的不同毒素型提早預(yù)防，并采取相應(yīng)的控制措施。