• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    MEK5α 和MEK5β 調(diào)控Beclin 1 啟動子

    2021-03-01 09:28:58劉曉蕓王雷斌張沙沙趙微苗朱洪新
    關(guān)鍵詞:共轉(zhuǎn)染報告基因熒光素酶

    劉曉蕓,王雷斌,王 慶,張沙沙,趙微苗,賀 林,朱洪新

    (上海交通大學(xué)Bio-X 研究院遺傳發(fā)育與精神神經(jīng)疾病教育部重點(diǎn)實驗室,上海 200240)

    巨自噬(簡稱自噬)是真核細(xì)胞內(nèi)一種保守的溶酶體降解路徑,存在于體內(nèi)幾乎所有的細(xì)胞中[1].自噬可人為地分為自噬起始、自噬體形成、自噬體成熟及溶酶體內(nèi)降解等幾個階段.目前,對自噬的分子機(jī)制已有了比較明確的認(rèn)識.在哺乳動物細(xì)胞自噬起始階段,ULK1-ATG13-FIP200 復(fù)合物中,ULK1 激活Beclin 1-VPS34-Atg14L 復(fù)合物組分VPS34,促進(jìn)PI3P 的合成,從而誘導(dǎo)自噬泡的形成.然后,細(xì)胞內(nèi)形成泛素樣復(fù)合物Atg12-Atg5-Atg16L,行使泛素連接酶的功能,促進(jìn)LC3-PE(也稱為LC3 Ⅱ)與自噬體外膜結(jié)合,并募集其他自噬體膜蛋白促進(jìn)自噬體形成.自噬體形成后與溶酶體外膜融合(自噬體成熟),自噬體內(nèi)膜及內(nèi)容物被溶酶體水解酶降解并進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)加以再利用.自噬體成熟受Beclin 1-VPS34-UVRAG 復(fù)合物調(diào)控[2].因此,Beclin 1在細(xì)胞自噬起始及自噬體成熟階段起著關(guān)鍵作用.

    Beclin 1 是哺乳動物的酵母Atg6 同源基因,也是最早發(fā)現(xiàn)的哺乳動物自噬相關(guān)基因[3].人Beclin 1 基因位于17q21,含12 個外顯子和11 個內(nèi)含子.Beclin 1 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為2 098 個堿基,包括120 個堿基的5′末端未翻譯區(qū),1 353 堿基的編碼區(qū)和625 個堿基的3′末端未翻譯區(qū)[4].在蛋白結(jié)構(gòu)上,Beclin 1有一個Bcl-2 同源結(jié)構(gòu)域3(Bcl-2 homology domain 3,BH3),一個coiled-coil 結(jié)構(gòu)域(coiled-coil domain,CCD)及一個進(jìn)化保守結(jié)構(gòu)域(evolutionarily conserved domain,ECD).這些結(jié)構(gòu)域的存在使Beclin 1 可以與多個蛋白質(zhì)如VPS34 及UVRAG 形成復(fù)合物行使相應(yīng)的分子功能[5].

    MEK5 是MEK 家族成員,由選擇性剪切產(chǎn)生MEK5α 和MEK5β,相應(yīng)合成的蛋白質(zhì)分別為50 和40 kDa[6].MEK5α 主要在腦和肝臟表達(dá),而MEK5β 在多種組織器官廣泛表達(dá)[6].已有研究表明,MEK5α 可結(jié)合并激活ERK5.MEK5α 也是迄今為止發(fā)現(xiàn)的唯一能夠特異性激活ERK5 的上游激酶.而MEK5β 抑制MEK5α與ERK5 結(jié)合從而抑制MEK5α 激活ERK5.因此,MEK5α和MEK5β 對于ERK5 的激活具有拮抗作用[7].

    目前,已有研究發(fā)現(xiàn)MAPK 家族信號通路如MEK-ERK 及JNK可調(diào)控Beclin 1 的表達(dá).而MEK5-ERK5 信號通路對Beclin 1 的表達(dá)調(diào)控尚不清楚[8-10].Beclin 1 在肌肉分化的過程中表達(dá)上調(diào),并調(diào)控心肌細(xì)胞及骨骼肌細(xì)胞分化[11-13].已有研究發(fā)現(xiàn),在肌肉分化過程中,MEK5-ERK5 信號通路活性增強(qiáng),并調(diào)控成肌細(xì)胞分化[14-16].本工作推測MEK5-ERK5 信號通路可能通過調(diào)控Beclin 1 基因表達(dá)從而調(diào)控肌肉分化,并主要研究MEK5 對于成肌細(xì)胞Beclin 1 啟動子活性的調(diào)控.

    1 材料與方法

    1.1 試劑

    PyrobestTMDNA Polymerase 及T4 DNA 連接酶購自Takara 公司.限制性內(nèi)切酶KpnⅠ、HindⅢ及SalⅠ購自New England Biolabs(NEB)公司.1 kb plus DNA ladder 購自Invitrogen 公司.C2C12 細(xì)胞購自美國菌種保藏中心(American type culture collection,ATCC).胎牛血清及DMEM(高糖)購自Gibco 公司,Lipofectamine 2000 購自Invitrogen 公司.Dual Luciferase Reporter Assay System 購自Promega 公司.

    1.2 質(zhì)粒

    PCFG5-DD(持續(xù)活性 MEK5β),PCFG5-AA(負(fù)顯性 MEK5β)及 PCFG5-WT(野生 型MEK5β)由Stephan Ludwig 教授(Universitaetsklinikum Muenster)饋 贈.pCMVMEK5αCA(持續(xù)活性MEK5α)及pCMV-MEK5αDN(負(fù)顯性MEK5α)由Xia Zhengui 教授(University of Washington)饋贈.pS6(pCMV.SPORT6),pS6-CREB3,pS6-CREBP,pS6-CREBL1 及pS6-E2F-1 由馬鋼副教授及郭熙志教授(上海交通大學(xué))提供.

    1.3 DNA 片段克隆與亞克隆

    用SalⅠ和Hind Ⅲ雙酶切PCFG5-DD,將獲得的MEK5βDD 片段亞克隆至pDNA3.1(?)質(zhì)粒,得到pcDNA3.1-MEK5βDD(簡稱MEK5βDD),并進(jìn)行酶切鑒定和測序鑒定.用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)擴(kuò)增PCFG5-AA及PCFG5-WT中的MEK5β片段,將其亞克隆至pDNA3.1(?)質(zhì)粒,分別獲得pcDNA3.1-MEK5βAA(簡稱MEK5βAA)及pcDNA3.1-MEK5βWT(簡稱MEK5βWT).然后分別進(jìn)行酶切鑒定和測序鑒定.以鼠尾DNA 為模板,用PCR 擴(kuò)增Beclin 1 起始密碼子上游2 088 堿基對區(qū)域,并將其克隆至pGL3-Basic 載體KpnⅠ及HindⅢ酶切位點(diǎn),進(jìn)行酶切鑒定及測序鑒定.由于Beclin 1轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)位于起始密碼子上游232 堿基對位置,因此將含有2 088 堿基對片段的pGL3-Basic 載體命名為p-1 856.類似地,以p-1 856 為模板,用PCR 分別擴(kuò)增起始密碼子上游1 870,1 613,1 448,1 207,1 023,586 及373 堿基對區(qū)域并克隆至pGL3-Basic 質(zhì)粒KpnⅠ及HindⅢ酶切位點(diǎn),分別獲得pGL3-Basic-1 638 (p-1 638),pGL3-Basic-1 381 (p-1 381),pGL3-Basic-1 216 (p-1 216),pGL3-Basic-975(p-975),pGL3-Basic-791(p-791),pGL3-Basic-354(p-354)及pGL3-Basic-141(p-141)載體,進(jìn)行酶切鑒定及測序鑒定后分析啟動子活性.不同長度Beclin 1 啟動子片段PCR 擴(kuò)增引物如表1所示.

    表1 小鼠Beclin 1 啟動子片段PCR 擴(kuò)增引物Table 1 Sequences of primers used for PCR-amplification of mouse Beclin 1 promoter fragments

    1.4 細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞轉(zhuǎn)染

    C2C12 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM(高糖)培養(yǎng)液.將細(xì)胞接種至24 孔板,待次日細(xì)胞密度達(dá)到80%~90%時用lipofectamine 2000 進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染.轉(zhuǎn)染操作按lipofectamine 2000 使用說明書進(jìn)行.如無特殊說明,0.8 μg 質(zhì)粒DNA 用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染后24~48 h 進(jìn)行熒光素酶報告基因檢測實驗.

    1.5 熒光素酶報告基因檢測

    采用Promega 公司Dual Luciferase Reporter Assay System 進(jìn)行熒光素酶報告基因測定,具體操作按說明書進(jìn)行.

    1.6 Real-time RT-PCR

    使用TRIzol 試劑提取轉(zhuǎn)染細(xì)胞總RNA,并將細(xì)胞總RNA 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA(GENEray,GK8030-50)后用 real-time PCR(RT-PCR) 方法分析基因表達(dá)(GENEray,GK8020-200).用于real-time PCR 的Beclin 1 基因正向引物序列為5′-GCTCCTGTGGAATGGAATGA-3′,反向引物序列為5′-GAACAGTACAACGGCAACTC-3′;內(nèi)參基因Gapdh正向引物序列為5′-GTGTTCCTACCCCCAATGT-3′,反向引物序列為5′-TGTCATCATACTTGGCAGGTTTC-3′.

    1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

    數(shù)據(jù)均以mean±SD 表示,兩組間平均值比較采用student t 檢驗.多組間平均值比較采用單因素方差分析,P <0.05 表示差異具有顯著性.

    2 結(jié)果

    2.1 不同Beclin 1 啟動子片段的活性分析

    為了確定Beclin 1 啟動子活性區(qū)域,首先將小鼠Beclin 1 起始密碼子上游2 088 堿基對區(qū)域克隆至pGL3-Basic 質(zhì)粒中(p-1 856).將p-1 856 或pGL3-Basic 轉(zhuǎn)染至C2C12 細(xì)胞,雙熒光素酶報告基因檢測實驗結(jié)果顯示p-1 856 熒光素酶活性顯著增加(見圖1,圖中M 代表1 kb plus DNA ladder),表明Beclin 1 基因?1 856 區(qū)域具有啟動子活性.為了獲得Beclin 1 啟動子關(guān)鍵區(qū)域,將Beclin 1 啟動子?1 856 片段5′端刪除不同長度后亞克隆至pGL3-Basic,并進(jìn)行啟動子活性分析.實驗結(jié)果表明,p-354 熒光素酶活性最高,而p-791 熒光素酶活性顯著下降,p-141 熒光素酶活性最低(見圖1).上述結(jié)果表明,?354 ~?141 區(qū)域是Beclin 1 啟動子活性的關(guān)鍵區(qū)域.因此,接下來將使用p-354 進(jìn)一步研究Beclin 1 啟動子的調(diào)控.

    圖1 小鼠Beclin 1 啟動子的克隆與活性分析Fig.1 Cloning and activity analysis of Beclin 1 promoters in mice

    2.2 MEK5α 與MEK5β對Beclin 1 啟動子活性的調(diào)控

    為了研究 MEK5 對 Beclin 1 啟動子活性的調(diào)控,首先將活性形式的MEK5α(MEK5αCA)或無活性形式的MEK5α(MEK5αDN)分別與p-354 共轉(zhuǎn)染至C2C12細(xì)胞.雙熒光素酶報告基因檢測實驗結(jié)果顯示,MEK5αCA 顯著上調(diào)熒光素酶活性,而MEK5αDN 顯著下調(diào)熒光素酶活性(見圖2(a)),表明MEK5α能夠正向調(diào)控Beclin 1 啟動子活性.然后分別轉(zhuǎn)染不同量的MEK5αCA,結(jié)果表明少量MEK5αCA(0.3 μg)對Beclin 1啟動子活性無顯著作用,中量MEK5αCA(0.8 μg)可顯著上調(diào)Beclin 1 啟動子活性,而多量MEK5αCA(2.4 μg)可進(jìn)一步上調(diào)Beclin 1 啟動子活性(見圖2(b)).因此,MEK5αCA對于Beclin 1 啟動子活性的調(diào)控具有劑量依賴關(guān)系.為了研究MEK5β對Beclin 1 啟動子活性的調(diào)控,分別將活性MEK5β (MEK5βDD),野生型MEK5β(MEK5βWT)及無活性MEK5β(MEK5βAA)與p-354 共轉(zhuǎn)染至C2C12 細(xì)胞.雙熒光素酶報告基因檢測實驗結(jié)果顯示,盡管MEK5βAA 對p-354 活性無顯著影響,但MEK5βWT 及MEK5βDD 顯著下調(diào)Beclin 1 啟動子活性(見圖2(c)),表明MEK5β 負(fù)向調(diào)控Beclin 1 啟動子活性.為了揭示MEK5α 與MEK5β對Beclin 1 啟動子活性調(diào)控是否具有拮抗作用,將p-354,MEK5αCA 與MEK5βWT/MEK5βAA/MEK5βDD 分別共轉(zhuǎn)染至C2C12 細(xì)胞.雙熒光素酶報告基因檢測實驗結(jié)果顯示,共轉(zhuǎn)染MEK5βDD 和MEK5αCA 導(dǎo)致p-354 的熒光素酶活性顯著降低(見圖2(d)),表明MEK5βDD 能夠抑制MEK5αCA對Beclin 1 啟動子活性的正向調(diào)控.

    圖2 MEK5α 與MEK5β對Beclin 1 啟動子的調(diào)控Fig.2 MEK5α and MEK5β regulated Beclin 1 promoters

    2.3 MEK5α 與MEK5β 調(diào)控Beclin 1 mRNA 表達(dá)

    為了驗證MEK5α 與MEK5β 能夠調(diào)控細(xì)胞Beclin 1 基因表達(dá),將MEK5αCA 與MEK5βDD單獨(dú)或共轉(zhuǎn)染細(xì)胞,用real-time PCR 方法檢測Beclin 1 mRNA的表達(dá).由圖3可見,單獨(dú)轉(zhuǎn)染MEK5αCA 顯著上調(diào)Beclin 1 mRNA 表達(dá),單獨(dú)轉(zhuǎn)染MEK5βDD 顯著下調(diào)Beclin 1 mRNA 表達(dá).在MEK5βDD 與MEK5αCA 共轉(zhuǎn)染細(xì)胞,MEK5βDD 則顯著抑制MEK5αCA 對Beclin 1 mRNA 表達(dá)的促進(jìn)作用.這些結(jié)果說明MEK5α 與MEK5β分別正向和負(fù)向調(diào)控Beclin 1 mRNA表達(dá),二者具有拮抗作用,這與MEK5α 與MEK5β對Beclin 1 啟動子的調(diào)控結(jié)果一致.

    圖3 MEK5α與MEK5β調(diào)控Beclin 1 mRNA 表達(dá)Fig.3 MEK5α and MEK5β regulated the expression of Beclin 1 mRNA

    2.4 MEK5α 與CREB 對Beclin 1 啟動子活性調(diào)控具有協(xié)同效應(yīng)

    在p-354 啟動子區(qū)域存在CREB 結(jié)合位點(diǎn),而MEK5-ERK5 信號通路能夠調(diào)控CREB 活性.因此,MEK5-ERK5 可能通過CREB 調(diào)控Beclin 1啟動子活性.首先研究CREB 是否能夠調(diào)控p-354 活性,將CREB 家族成員CREB3,CREBBP 及CREBL1 分別與p-354 共轉(zhuǎn)染至C2C12 細(xì)胞,雙熒光素酶報告基因檢測實驗結(jié)果顯示,CREB3,CREBBP 及CREBL1 均能夠顯著上調(diào)p-354 熒光素酶活性(見圖4(a)).將不同量的CREB3 與p-354 共轉(zhuǎn)染至C2C12細(xì)胞,雙熒光素酶報告基因檢測實驗結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染少量CREB3(0.3 μg)對p-354 熒光素酶活性無顯著影響,而轉(zhuǎn)染中量CREB3(0.8 μg)顯著上調(diào)p-354 熒光素酶活性,轉(zhuǎn)染多量CREB3(2.4 μg) 也顯著上調(diào)p-354 熒光素酶活性,但與轉(zhuǎn)染中量CREB3 無顯著差別(見圖4(b)),證明CREB 能夠上調(diào)Beclin 1 啟動子活性.接下來將少量CREB(0.3 μg)或MEK5αCA (0.3 μg)分別與p-354 共轉(zhuǎn)染至C2C12 細(xì)胞,或者將少量CREB (0.3 μg)和MEK5αCA(0.3 μg)與p-354 共轉(zhuǎn)染至C2C12 細(xì)胞.雙熒光素酶報告基因檢測實驗結(jié)果顯示,單獨(dú)轉(zhuǎn)染少量CREB3,CREBP,CREBL1 或MEK5αCA 對p-354 熒光素酶活性無顯著影響,但共轉(zhuǎn)染少量CREB 和MEK5αCA 可顯著上調(diào)p-354 熒光素酶活性(見圖4(c)).上述結(jié)果表明MEK5α 與CREB 對Beclin 1 啟動子的調(diào)控具有協(xié)同效應(yīng).

    圖4 MEK5α 與CREB對Beclin 1 啟動子調(diào)控的協(xié)同效應(yīng)Fig.4 Synergistic effects of MEK5α and CREB on Beclin 1 promoter

    2.5 E2F-1 調(diào)控Beclin 1 啟動子活性

    在p-1 381 與p-1 216 之間存在E2F-1 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn),因此選用長Beclin 1 啟動子區(qū)域p-1 856 研究E2F-1 對Beclin 1 啟動子的調(diào)控.將E2F-1 及p-1 856 共轉(zhuǎn)染至C2C12 細(xì)胞.雙熒光素酶報告基因檢測實驗結(jié)果顯示,E2F-1 顯著上調(diào)p-1 856 熒光素酶活性(見圖5),表明E2F-1 能夠調(diào)控Beclin 1 啟動子活性.MEK5 是否能夠通過E2F-1 調(diào)控Beclin 1 啟動子活性則有待進(jìn)一步研究.

    圖5 E2F-1 促進(jìn)Beclin 1 啟動子活性Fig.5 E2F-1 facilitated Beclin 1 promoter activity

    MEK5α 通過活化ERK5 促進(jìn)CREB 活性,進(jìn)而上調(diào)Beclin 1 基因表達(dá).MEK5β能夠抑制MEK5α 對ERK5 的激活從而抑制MEK5α 對Beclin 1 的表達(dá)調(diào)控.E2F-1 能促進(jìn)Beclin 1基因表達(dá).

    3 討論

    本工作主要發(fā)現(xiàn)如下:①Beclin 1 轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游354 堿基對區(qū)域是Beclin 1 啟動子的關(guān)鍵活性區(qū)域;②MEK5α 和MEK5β 對Beclin 1 啟動子的調(diào)控具有相互拮抗作用;③CREB 促進(jìn)Beclin 1 啟動子活性,并與MEK5α 具有協(xié)同效應(yīng).

    在Beclin 1 起始密碼子上游約2 kb 堿基對區(qū)域,Beclin 1轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游354 堿基對區(qū)域具有最大啟動子活性,而轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游141 堿基對區(qū)域啟動子活性最低.因此,Beclin 1 啟動子活性的關(guān)鍵區(qū)域位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游354 堿基對區(qū)域與141 堿基對區(qū)域之間.Beclin 1 轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游791 堿基對區(qū)域啟動子活性下降的原因可能是存在轉(zhuǎn)錄抑制因子結(jié)合位點(diǎn),這有待進(jìn)一步鑒定.Beclin 1 轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游1 381 堿基對與1 216 堿基對之間區(qū)域存在E2F-1 結(jié)合位點(diǎn).E2F-1 能夠促進(jìn)Beclin 1 啟動子活性,這可能是?1 381 片段比?1 216 片段啟動子活性強(qiáng)的原因.

    本工作發(fā)現(xiàn)MEK5α 和MEK5β 對Beclin 1 啟動子具有相反的調(diào)控作用,并且在mRNA水平上證實了MEK5α 和MEK5β對Beclin 1 表達(dá)的拮抗調(diào)控.已有研究中MEK5α能夠與ERK5 結(jié)合并激活ERK5,而MEK5β 抑制MEK5α與ERK5 結(jié)合從而抑制MEK5α 誘導(dǎo)的ERK5 活化[7].因此,可認(rèn)為MEK5α 通過活化ERK5 上調(diào)Beclin 1 基因表達(dá).MEK5β 能夠抑制MEK5α 對ERK5 的激活從而抑制MEK5α 對Beclin 1 的表達(dá)調(diào)控(見圖6).鑒于?354 堿基對區(qū)域Beclin 1 啟動子片段活性最強(qiáng),?141 堿基對區(qū)域Beclin 1 啟動子片段活性最弱,而CREB 結(jié)合位點(diǎn)位于?354 堿基對區(qū)域與?141 堿基對區(qū)域之間,并能劑量依賴性調(diào)控Beclin 1 啟動子活性,這提示CREB 可能是調(diào)控Beclin 1 表達(dá)的關(guān)鍵因子.本工作發(fā)現(xiàn)MEK5α 與CREB 對Beclin 1 啟動子活化具有協(xié)同效應(yīng),這與文獻(xiàn)[17]發(fā)現(xiàn)的MEK5-ERK5信號通路能夠活化CREB 一致.因此,CREB 可能是MEK5-ERK5 信號通路調(diào)控Beclin 1表達(dá)的關(guān)鍵下游效應(yīng)因子.此外,本工作還發(fā)現(xiàn)E2F-1 能夠促進(jìn)Beclin 1 啟動子活性,這與Weinmann 等[18]的報道一致.目前尚不清楚MEK5α 和MEK5β 是否可以直接調(diào)控E2F-1的活性.但已有報道表明CREB 能夠上調(diào)E2F-1 的表達(dá)[19],因此MEK5-ERK5 有可能通過CREB 間接調(diào)控E2F-1 的活性,從而調(diào)控Beclin 1 基因表達(dá).

    圖6 MEK5 調(diào)控Beclin 1 基因表達(dá)模式Fig.6 Pattern of MEK5 regulating Beclin 1 expression

    Beclin 1 在生物體內(nèi)廣泛表達(dá),能夠調(diào)控多種生物學(xué)過程如細(xì)胞自噬、增殖、分化和凋亡[20].本工作使用小鼠成肌細(xì)胞C2C12 研究了MEK5 對Beclin 1 啟動子活性的調(diào)控.Beclin 1 在肌肉細(xì)胞分化過程中表達(dá)增加,自噬上調(diào)[11-13].因此,本工作對于肌肉細(xì)胞分化調(diào)控研究具有一定意義,也對Beclin 1 調(diào)控其他生物學(xué)過程的研究具有一定的啟示.此外,Beclin 1 在多種疾病如腫瘤、心臟疾病及神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展中均起著重要作用[21-23],因此本工作對于與Beclin 1 相關(guān)的疾病研究也具有一定意義.

    猜你喜歡
    共轉(zhuǎn)染報告基因熒光素酶
    NNMT基因啟動子雙熒光素酶報告系統(tǒng)的構(gòu)建及其與SND1靶向關(guān)系的驗證
    不同雙熒光素酶方法對檢測胃癌相關(guān)miRNAs靶向基因TIAM1的影響
    長鏈非編碼RNA-ATB對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其機(jī)制研究
    EIAV Rev 蛋白拮抗eqTRIM5α介導(dǎo)的AP-1 信號通路的機(jī)制研究
    重組雙熒光素酶報告基因質(zhì)粒psiCHECK-2-Intron構(gòu)建轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染細(xì)胞螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶表達(dá)
    綿羊肺腺瘤病毒SU蛋白與Hyal-2蛋白的結(jié)合域研究
    啟動子陷阱技術(shù)在植物啟動子克隆研究中的應(yīng)用
    報告基因標(biāo)記在干細(xì)胞治療急性心肌梗死中的應(yīng)用進(jìn)展
    人多巴胺D2基因啟動子區(qū)—350A/G多態(tài)位點(diǎn)熒光素酶表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定及活性檢測
    基因捕獲技術(shù)及其在水稻突變體庫構(gòu)建上的應(yīng)用
    黄色日韩在线| 色哟哟·www| av在线观看视频网站免费| 在线观看66精品国产| 欧美国产日韩亚洲一区| 天天躁日日操中文字幕| 日本精品一区二区三区蜜桃| 亚洲中文字幕日韩| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 床上黄色一级片| 又黄又爽又免费观看的视频| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 亚洲av一区综合| eeuss影院久久| 欧美激情久久久久久爽电影| 国产在线精品亚洲第一网站| 成熟少妇高潮喷水视频| 91在线精品国自产拍蜜月| 长腿黑丝高跟| 国产精品久久久久久精品电影| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 国产精品野战在线观看| 欧美色视频一区免费| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 3wmmmm亚洲av在线观看| 国产一级毛片七仙女欲春2| 国内精品久久久久精免费| 人妻少妇偷人精品九色| 欧美成人性av电影在线观看| 亚洲内射少妇av| 久久久久久久久大av| 久久久午夜欧美精品| 999久久久精品免费观看国产| 欧美激情久久久久久爽电影| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 99热这里只有是精品50| 久久精品国产亚洲网站| 真人一进一出gif抽搐免费| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 欧美色视频一区免费| 色在线成人网| 色综合色国产| 日本熟妇午夜| 免费观看精品视频网站| 女人被狂操c到高潮| 熟女人妻精品中文字幕| a级毛片a级免费在线| 欧美bdsm另类| 精品久久久久久,| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 亚洲精华国产精华液的使用体验 | 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 色av中文字幕| 成人av在线播放网站| 日韩av在线大香蕉| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 美女黄网站色视频| 久久久成人免费电影| 国产高清不卡午夜福利| 91在线观看av| 一本精品99久久精品77| 免费看日本二区| 禁无遮挡网站| 一夜夜www| 久久久久久国产a免费观看| 亚洲综合色惰| 国产免费av片在线观看野外av| 两个人的视频大全免费| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| av在线老鸭窝| 色av中文字幕| 亚洲国产色片| 中国美女看黄片| 91久久精品国产一区二区三区| 精品一区二区免费观看| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 日本与韩国留学比较| 久久热精品热| 国产三级中文精品| 男人舔奶头视频| 男人舔奶头视频| 日本免费一区二区三区高清不卡| av.在线天堂| 亚洲欧美日韩东京热| 日本a在线网址| or卡值多少钱| 少妇的逼好多水| 久久中文看片网| 国产91精品成人一区二区三区| 99国产极品粉嫩在线观看| 午夜影院日韩av| 亚洲美女黄片视频| 国产av一区在线观看免费| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 日本一二三区视频观看| 欧美激情在线99| 国产男人的电影天堂91| 国产亚洲91精品色在线| 欧美区成人在线视频| 日韩精品中文字幕看吧| 免费一级毛片在线播放高清视频| 91麻豆av在线| 久久久久久久久久久丰满 | 免费人成视频x8x8入口观看| 国产精品精品国产色婷婷| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 国产精品,欧美在线| 亚洲自拍偷在线| 免费观看在线日韩| 亚洲色图av天堂| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 国产精品久久久久久av不卡| 一级毛片久久久久久久久女| 男女边吃奶边做爰视频| 91麻豆精品激情在线观看国产| 男女下面进入的视频免费午夜| eeuss影院久久| 久久这里只有精品中国| 日本五十路高清| 色哟哟哟哟哟哟| 国产极品精品免费视频能看的| 国产精品一区二区性色av| 中文字幕av成人在线电影| 成人特级黄色片久久久久久久| 国产欧美日韩精品一区二区| 亚洲美女搞黄在线观看 | 免费观看的影片在线观看| 乱人视频在线观看| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 亚洲无线在线观看| 中亚洲国语对白在线视频| 国产亚洲欧美98| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 国产成人一区二区在线| 麻豆成人av在线观看| 国产综合懂色| 麻豆av噜噜一区二区三区| 欧美性感艳星| 3wmmmm亚洲av在线观看| 久久精品国产自在天天线| 午夜福利欧美成人| 搡老岳熟女国产| 2021天堂中文幕一二区在线观| 男女啪啪激烈高潮av片| 欧美日本视频| 亚洲中文日韩欧美视频| 色综合婷婷激情| 一级av片app| 精品午夜福利视频在线观看一区| 国产麻豆成人av免费视频| 男插女下体视频免费在线播放| 给我免费播放毛片高清在线观看| 日本欧美国产在线视频| 国内精品宾馆在线| 午夜精品在线福利| 99在线视频只有这里精品首页| av女优亚洲男人天堂| 日韩高清综合在线| 久久久久国内视频| 男人狂女人下面高潮的视频| 直男gayav资源| 日韩一区二区视频免费看| 在线观看舔阴道视频| 亚洲av五月六月丁香网| av国产免费在线观看| 日本与韩国留学比较| 草草在线视频免费看| 91麻豆精品激情在线观看国产| 国产91精品成人一区二区三区| 国产黄a三级三级三级人| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 毛片一级片免费看久久久久 | 精品免费久久久久久久清纯| 久久亚洲真实| 久久久色成人| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 成人二区视频| 亚洲三级黄色毛片| 黄色一级大片看看| 在线观看av片永久免费下载| 日本色播在线视频| 亚洲综合色惰| 乱人视频在线观看| 夜夜爽天天搞| 亚洲国产色片| 91麻豆av在线| 99精品在免费线老司机午夜| 不卡视频在线观看欧美| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 日韩欧美 国产精品| 日韩欧美国产一区二区入口| 午夜福利欧美成人| 国产免费av片在线观看野外av| 五月玫瑰六月丁香| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 超碰av人人做人人爽久久| 一夜夜www| 99在线视频只有这里精品首页| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 成人美女网站在线观看视频| 真人做人爱边吃奶动态| 国产毛片a区久久久久| 999久久久精品免费观看国产| 亚洲真实伦在线观看| 男女下面进入的视频免费午夜| 国产成人福利小说| 亚洲av熟女| av女优亚洲男人天堂| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 国产爱豆传媒在线观看| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 丰满乱子伦码专区| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 午夜精品在线福利| 亚洲avbb在线观看| 搡老熟女国产l中国老女人| 亚洲一区二区三区色噜噜| 欧美又色又爽又黄视频| av国产免费在线观看| 亚洲内射少妇av| 97热精品久久久久久| 亚洲欧美激情综合另类| 一本精品99久久精品77| 看十八女毛片水多多多| 久久热精品热| 色吧在线观看| 亚洲精品影视一区二区三区av| 久99久视频精品免费| 国产久久久一区二区三区| 成年版毛片免费区| 深夜a级毛片| 国产高清激情床上av| 久久久久久大精品| 一个人观看的视频www高清免费观看| 51国产日韩欧美| 一本精品99久久精品77| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| av天堂在线播放| 在线免费观看的www视频| 日韩欧美免费精品| 桃色一区二区三区在线观看| 亚洲,欧美,日韩| 又粗又爽又猛毛片免费看| 亚洲精品日韩av片在线观看| 国产av不卡久久| 69人妻影院| 午夜精品在线福利| 亚洲一区高清亚洲精品| 黄色丝袜av网址大全| 免费一级毛片在线播放高清视频| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 欧美又色又爽又黄视频| 香蕉av资源在线| 免费大片18禁| 真人一进一出gif抽搐免费| 免费看av在线观看网站| 亚洲在线自拍视频| 亚洲无线观看免费| 免费观看在线日韩| 91av网一区二区| 午夜福利欧美成人| 国产一区二区在线av高清观看| 国产伦人伦偷精品视频| 1024手机看黄色片| 直男gayav资源| 国产老妇女一区| avwww免费| 最近中文字幕高清免费大全6 | 亚洲男人的天堂狠狠| 在线观看舔阴道视频| 国产一区二区三区视频了| 久久中文看片网| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 老司机福利观看| 国产精品人妻久久久久久| 永久网站在线| 黄色女人牲交| 狠狠狠狠99中文字幕| 韩国av在线不卡| 啦啦啦韩国在线观看视频| 成人特级黄色片久久久久久久| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 国产黄色小视频在线观看| 色精品久久人妻99蜜桃| 在现免费观看毛片| 老司机福利观看| 免费黄网站久久成人精品| 看十八女毛片水多多多| eeuss影院久久| 俄罗斯特黄特色一大片| 欧美xxxx性猛交bbbb| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 亚洲专区国产一区二区| 黄色女人牲交| 色精品久久人妻99蜜桃| 欧美另类亚洲清纯唯美| 免费看光身美女| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 九色成人免费人妻av| 天天躁日日操中文字幕| 成人二区视频| 国产色婷婷99| 国产精品1区2区在线观看.| 99国产极品粉嫩在线观看| 久久久久久国产a免费观看| 久久午夜亚洲精品久久| 精品久久久久久成人av| 看十八女毛片水多多多| 色噜噜av男人的天堂激情| av视频在线观看入口| 国产久久久一区二区三区| 国产毛片a区久久久久| 少妇丰满av| 国产伦人伦偷精品视频| 两人在一起打扑克的视频| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 小说图片视频综合网站| 久久久久久久久久黄片| 啪啪无遮挡十八禁网站| 校园春色视频在线观看| 日韩精品中文字幕看吧| 亚洲欧美日韩无卡精品| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 中亚洲国语对白在线视频| 男人狂女人下面高潮的视频| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 欧美激情在线99| 国产v大片淫在线免费观看| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| www日本黄色视频网| 俺也久久电影网| 国产精品电影一区二区三区| 22中文网久久字幕| 日韩强制内射视频| 久久久久精品国产欧美久久久| 最好的美女福利视频网| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 午夜视频国产福利| 免费av毛片视频| 又爽又黄无遮挡网站| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 男人舔女人下体高潮全视频| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 嫩草影院新地址| 老女人水多毛片| 日本免费一区二区三区高清不卡| 日韩强制内射视频| 美女高潮的动态| 看免费成人av毛片| 黄片wwwwww| 国产精华一区二区三区| 国内精品久久久久精免费| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 嫩草影院精品99| 九九爱精品视频在线观看| 国产精品亚洲一级av第二区| 精品午夜福利在线看| 好男人在线观看高清免费视频| 日韩大尺度精品在线看网址| 22中文网久久字幕| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 欧美中文日本在线观看视频| 99视频精品全部免费 在线| 日本精品一区二区三区蜜桃| 美女 人体艺术 gogo| 91在线观看av| 深夜a级毛片| 啪啪无遮挡十八禁网站| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 国产午夜福利久久久久久| 国产av不卡久久| 99热6这里只有精品| 看免费成人av毛片| 日韩欧美三级三区| 简卡轻食公司| 欧美激情国产日韩精品一区| 亚州av有码| 51国产日韩欧美| 特级一级黄色大片| 久久精品国产清高在天天线| 春色校园在线视频观看| 欧美潮喷喷水| 一级a爱片免费观看的视频| 丝袜美腿在线中文| 久久久久精品国产欧美久久久| 熟女电影av网| 精品久久久久久久久av| 99热这里只有是精品在线观看| 白带黄色成豆腐渣| 国产精品一及| 最近在线观看免费完整版| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 日日夜夜操网爽| 日韩欧美国产一区二区入口| 亚洲av一区综合| 亚洲不卡免费看| 日本黄色视频三级网站网址| 波多野结衣高清作品| 亚洲人成伊人成综合网2020| 日韩国内少妇激情av| 久久99热这里只有精品18| 禁无遮挡网站| 精品国产三级普通话版| 一本久久中文字幕| 午夜视频国产福利| 国产真实伦视频高清在线观看 | .国产精品久久| 国国产精品蜜臀av免费| 校园春色视频在线观看| 波多野结衣高清无吗| 一边摸一边抽搐一进一小说| 欧美日本视频| 深夜精品福利| 成年女人毛片免费观看观看9| 三级国产精品欧美在线观看| 搡老妇女老女人老熟妇| 欧美潮喷喷水| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 国产人妻一区二区三区在| 黄色一级大片看看| 免费高清视频大片| 成熟少妇高潮喷水视频| 国产高潮美女av| 中亚洲国语对白在线视频| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片 | 最新在线观看一区二区三区| 亚洲一区二区三区色噜噜| 一区二区三区四区激情视频 | 色综合站精品国产| 99久久成人亚洲精品观看| 波多野结衣高清无吗| 男女视频在线观看网站免费| 成人一区二区视频在线观看| 午夜福利欧美成人| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 国产老妇女一区| 超碰av人人做人人爽久久| 中文在线观看免费www的网站| 国产高潮美女av| 搡老妇女老女人老熟妇| 黄色欧美视频在线观看| 亚洲自拍偷在线| 在线免费十八禁| 一级黄色大片毛片| 波多野结衣高清作品| xxxwww97欧美| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 春色校园在线视频观看| 免费观看精品视频网站| 日本色播在线视频| 一边摸一边抽搐一进一小说| av专区在线播放| 日本 av在线| 午夜激情欧美在线| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 日韩一本色道免费dvd| 最后的刺客免费高清国语| 尾随美女入室| 国产亚洲91精品色在线| 午夜福利成人在线免费观看| 一区二区三区高清视频在线| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 欧美最黄视频在线播放免费| 日韩精品有码人妻一区| 久久亚洲真实| 如何舔出高潮| 两个人的视频大全免费| 岛国在线免费视频观看| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 亚洲精品日韩av片在线观看| 国产人妻一区二区三区在| 亚洲av二区三区四区| 亚洲最大成人av| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 此物有八面人人有两片| 色精品久久人妻99蜜桃| 免费av观看视频| 亚洲18禁久久av| 亚洲av电影不卡..在线观看| 男女啪啪激烈高潮av片| 亚洲成人久久爱视频| 欧美区成人在线视频| 嫩草影院入口| 精品福利观看| 性插视频无遮挡在线免费观看| 免费看光身美女| 露出奶头的视频| 国产探花在线观看一区二区| 91麻豆精品激情在线观看国产| 99热这里只有精品一区| 一级a爱片免费观看的视频| 免费在线观看成人毛片| 亚洲av中文av极速乱 | 亚洲久久久久久中文字幕| 午夜福利18| 最新在线观看一区二区三区| 国产三级在线视频| 一边摸一边抽搐一进一小说| 亚洲最大成人中文| 久久久久久大精品| 成人欧美大片| 丰满人妻一区二区三区视频av| 免费看av在线观看网站| 在线观看av片永久免费下载| 国产亚洲av嫩草精品影院| 伦理电影大哥的女人| 我要看日韩黄色一级片| 亚洲人成网站高清观看| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 全区人妻精品视频| 亚洲av第一区精品v没综合| 免费人成在线观看视频色| 国产伦精品一区二区三区视频9| 两人在一起打扑克的视频| 欧美三级亚洲精品| 嫩草影院入口| 亚洲,欧美,日韩| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 日本 av在线| 极品教师在线视频| 亚洲自拍偷在线| x7x7x7水蜜桃| ponron亚洲| 久久久久九九精品影院| 亚洲欧美日韩东京热| 久久久久久久午夜电影| 老女人水多毛片| 婷婷六月久久综合丁香| 韩国av在线不卡| 国产高潮美女av| 午夜免费激情av| 一个人看的www免费观看视频| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 欧美最黄视频在线播放免费| 一进一出好大好爽视频| 99久国产av精品| 国产精品日韩av在线免费观看| 亚洲美女搞黄在线观看 | 久久精品91蜜桃| 男女视频在线观看网站免费| 欧美+日韩+精品| 亚洲国产欧美人成| 天堂网av新在线| 色吧在线观看| 久久久久久久久久久丰满 | 日韩强制内射视频| 国产av麻豆久久久久久久| 亚洲av免费在线观看| 在线播放国产精品三级| 少妇人妻一区二区三区视频| 午夜激情福利司机影院| 不卡一级毛片| 嫁个100分男人电影在线观看| 国产乱人伦免费视频| а√天堂www在线а√下载| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片 | 亚洲图色成人| www日本黄色视频网| 久久久国产成人精品二区| 最好的美女福利视频网| 能在线免费观看的黄片| 色哟哟哟哟哟哟| 美女cb高潮喷水在线观看| 亚洲专区国产一区二区| 免费人成视频x8x8入口观看| 天天一区二区日本电影三级| 欧美一区二区亚洲| 色综合婷婷激情| 成人特级av手机在线观看| 免费人成在线观看视频色| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 久久国产精品人妻蜜桃| 久久亚洲精品不卡| 精品久久久久久成人av| 一区福利在线观看| 亚洲久久久久久中文字幕| 亚洲成人中文字幕在线播放| 如何舔出高潮| 一a级毛片在线观看| 色av中文字幕| 一a级毛片在线观看| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 亚洲天堂国产精品一区在线| 色吧在线观看| 欧美一级a爱片免费观看看| 国产精品人妻久久久影院| 十八禁国产超污无遮挡网站| 国产欧美日韩精品亚洲av| 99热这里只有是精品50| 亚洲av美国av| 国产精品电影一区二区三区| 99在线人妻在线中文字幕| 99热这里只有是精品50| 国产成年人精品一区二区| 免费在线观看日本一区| 综合色av麻豆| av在线亚洲专区| 狠狠狠狠99中文字幕| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 欧美极品一区二区三区四区| 日本色播在线视频| 免费看av在线观看网站| 精品久久久久久久久亚洲 | 国产乱人视频| 99热6这里只有精品| 日韩精品青青久久久久久|